CN116239653A

CN116239653A - 具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽2KRI4W及其应用

Info

Publication number: CN116239653A
Application number: CN202310472168.1A
Authority: CN
Inventors: 倪京满; 王锐; 缑三虎
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2023-06-09
Also published as: CN113072619B; CN116284243A; CN113072619A

Abstract

本发明提供了一类具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，该α螺旋抗菌短肽是以α螺旋多肽为结构基础，引入含带正电荷氨基酸或中性亲水性氨基酸，以及疏水性不含硫氨基酸得到的两亲性α螺旋抗菌短肽，其结构通式为：XYYXXYXXYY‑NH₂，其中，X为带正电荷或中性亲水性氨基酸，Y为疏水性不含硫氨基酸。体外抑菌实验、溶血活性实验、诱导耐药实验以及急性毒性实验表明，本发明的α螺旋抗菌短肽具有高抗菌活性和低毒性，且无诱导耐药性，将α螺旋抗菌短肽与Rifampin或Gentamicin联用可以减少Rifampin或Gentamicin耐药性的产生；本发明的α螺旋抗菌短肽还可以用于治疗小鼠肺炎克雷伯杆菌诱导的细菌性肺炎，因此，其在制备临床抗菌药物中具有很好的应用前景。

Description

具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽2KRI4W及其应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一类具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，本发明同时还涉及该α螺旋抗菌短肽的应用。

背景技术

联合国2019年4月29日发布的耐药报告显示，抗生素耐药性问题日益严重，如不立即采取应对措施，到2050年，抗生素耐药性疾病每年可能造成1000万人死亡，对经济的破坏或相当于2008年的全球金融危机。我国卫健委2019年发布的《中国临床抗菌药物管理和细菌耐药现状报告》显示，碳青霉烯类耐药菌检出率呈现上升趋势，原因是碳青霉烯类临床抗菌药物的过度使用。目前，大部分抗生素对“超级细菌”不起作用，“超级细菌”对人类健康已造成极大的危害。而这些超级耐药细菌有扩散到世界各地的趋势，世界急切呼唤新型临床抗菌药物。

大多数抗生素通过干扰细胞壁、蛋白质、核酸的生物合成或代谢功能的途径来攻击细菌。细菌很容易通过发展生化溶液来对抗这些特定的过程而进化出对抗生素的耐受能力，从而产生耐药性。抗菌肽是生物体免疫防御系统的重要组成部分，可直接作用于菌膜造成物理性损伤，其有多种杀菌机制，且能与免疫系统相互作用，对多重耐药菌表现出显著杀伤作用，可以快速地杀灭微生物。由于细菌表面的结构和带电性能无法改变，因此很难产生耐药性。它与传统抗生素联用具有协同增效的作用，既降低了抗生素的用量又降低了抗菌肽的用量，同时还可以减缓抗生素耐药速度以及逆转抗生素耐药性，避免资源的浪费，因此抗菌肽的研发有望应对抗生素耐药危机。

目前为止，已经有上千种天然抗菌肽被分离出来，其空间结构分为α螺旋、β折叠、环形、伸展型以及无规律型和复合型结构等。天然或传统的多肽类抗生素一般稳定性差，生物半衰期短，生物利用率低，且有一定的毒性。因此，设计合成具有高稳定性、低毒的新型长效抗菌肽具有重要意义。β折叠、环形等抗菌肽主要以二级结构为基础发挥抗菌活性。而α螺旋型抗菌肽由于结构简单，其发挥活性不仅依靠两亲性α螺旋结构，氨基酸的组成和排列方式对其发挥活性更加重要，尤其对于短序列α螺旋抗菌肽，氨基酸的选择和排列组合方式对其活性影响很大，选择疏水性一般的氨基酸和多引入带正电荷氨基酸，亲水性太强，难以平衡两亲性，选择高疏水性氨基酸和少引入带正电荷氨基酸，疏水性太强，要么肽在水环境中难以溶解，要么分子易发生团聚，不能通过细胞膜而不产生抗菌活性。因此，合适的氨基酸种类、数目、排列方式决定了α螺旋抗菌短肽的二级结构、疏水性、两亲性、跨膜能力和抗菌活性。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽。

本发明的目的之二是提供上述α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一、具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽的设计

本发明具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，是以α螺旋多肽为结构基础，引入含带正电荷氨基酸或中性亲水性氨基酸，以及疏水性不含硫氨基酸得到的两亲性α螺旋抗菌短肽，其结构通式为：

XYYXXYXXYY-NH₂，其中，X为带正电荷或中性亲水性氨基酸，Y为疏水性不含硫氨基酸。

作为本发明技术方案的优选，上述α螺旋抗菌短肽包括5K5W，2KRI4W，KR5W，3RI4F，其氨基酸序列如下：

Lys-Trp-Trp-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-NH₂，标记为5K5W（SEQ ID No.1）；

Gly-Trp-Trp-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Trp-Trp-NH₂，标记为2KRI4W（SEQ IDNo.2）；

Lys-Trp-Trp-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-NH₂，标记为4KR5W（SEQ ID No.3）；

Gly-Phe-Phe-Arg-Arg-Ile-Arg-Thr-Phe-Phe-NH₂，标记为3RI4F（SEQ ID No.4）。

上述α螺旋抗菌短肽均采用经典的多肽Fmoc固相合成法制备得到，具体为：

以Rink-MBHA Resin为原料，在多肽合成过程中以HOBt/HBTU作为缩合剂进行氨基酸耦合，采用茚三酮显色法检定二级胺，按照多肽序列依次耦合即得连有MBHA树脂的多肽，多肽切割及HPLC纯化后得到α螺旋抗菌短肽。

二、具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用

1、体外抑菌实验

采用经典微量连续二倍稀释法测定本发明α螺旋抗菌短肽对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌）及革兰氏阴性菌（铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌）的最小抑菌浓度；以抗生素Gentamicin、Kanamycin、Vancomycin、Rifampin、Polymyxin B作为阳性对照。实验平行重复3次，结果见表1和表2。

表1本发明α螺旋抗菌短肽对革兰氏阳性菌菌株的最低抑菌浓度

表2本发明α螺旋抗菌短肽对革兰氏阴性菌菌株的最低抑菌浓度

表1和2结果显示，本发明α螺旋抗菌短肽对以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌为代表的革兰氏阳性菌，和以大肠杆菌、铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌都具有较强抑制作用，表现为广谱抗菌活性，5K5W抗革兰氏阴性菌效果与抗生素Polymyxin B较相近，抗革兰氏阳性菌效果要强于Polymyxin B。

2、溶血活性实验

为了考察本发明合成的α螺旋抗菌短肽对正常哺乳动物细胞的毒性，测定了α螺旋抗菌短肽与小鼠红细胞孵育1h后的溶血情况，结果见图5。

图5结果显示，2KRI4W的10%溶血浓度为103.54 μM，5K5W的10%溶血浓度为134.38μM，4KR5W的10%溶血浓度为77.65 μM，远高于其对革兰氏阴性菌和阳性菌的MIC。3RI4F10%溶血浓度远大于256 μM，没有表现出溶血毒性。说明本发明合成的α螺旋抗菌短肽毒性低，用药安全。

以下以抗菌活性高、毒性低的5K5W为代表，进行α螺旋抗菌短肽的诱导耐药实验、急性毒性实验，以及治疗小鼠肺炎克雷伯杆菌诱导的细菌性肺炎的实验。

3、诱导耐药实验

为了考察本发明合成的α螺旋抗菌短肽是否会产生耐药性，测定了5K5W与铜绿假单胞菌连续作用15天后的诱导耐药情况，以抗生素Rifampin、Gentamicin、Polymyxin B作为对照，结果见图6。

图6结果显示，α螺旋抗菌短肽5K5W及抗生素Polymyxin B，与铜绿假单胞菌连续作用15天后均没有产生耐药性，而Rifampin或Gentamicin迅速产生耐药性，15天后Rifampin的MIC提高了64倍，Gentamicin的的MIC提高了256倍。值得注意的是，α螺旋抗菌短肽5K5W对Rifampin或Gentamicin诱导耐药的铜绿假单胞菌的MIC还是2 μM，而且5K5W与Rifampin联用可使Rifampin对其诱导耐药的铜绿假单胞菌的MIC降低至少32倍，与Gentamicin联用可使Gentamicin对其诱导耐药的铜绿假单胞菌的MIC降低至少32倍。这说明本发明合成的α螺旋抗菌短肽不仅无诱导耐药性，还能减少抗生素产生的耐药性。

为了考察铜绿假单胞菌对Rifampin和Gentamicin耐药后是否会导致α螺旋抗菌短肽5K5W的交叉耐药，我们采用经典微量连续二倍稀释法测定α螺旋抗菌短肽5K5W对Rifampin和Gentamicin连续作用15天后的铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度，以对正常铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为对照。实验平行重复3次。结果见表3。

表3对Rifampin或Gentamicin连续作用15天后的大肠杆菌的最低抑菌浓度

表3结果显示，Rifampin或Gentamicin诱导耐药后的铜绿假单胞菌对α螺旋抗菌短肽5K5W没有交叉耐药性。

为了考察5K5W与Rifampin或Gentamicin联合用药后是否会使Rifampin或Gentamicin耐药反转，我们用棋盘法将5K5W与Rifampin或Gentamicin联合用药抗Rifampin或Gentamicin诱导耐药的铜绿假单胞菌，并与正常铜绿假单胞菌的抗菌效果作比对。实验平行重复3次。结果见图7和图8。

图7和图8结果显示，5K5W可以将Rifampin对其诱导耐药的铜绿假单胞菌的MIC从2048 μM降低到64 μM，可使Gentamicin对其诱导耐药的铜绿假单胞菌的MIC从64 μM降低到2 μM。说明5K5W与Rifampin或Gentamicin联合用药后使诱导耐药的铜绿假单胞菌对Rifampin或Gentamicin重新恢复敏感性。

综上所述，α螺旋抗菌短肽5K5W无诱导耐药性，与Rifampin或Gentamicin联合用药后不仅可减少Rifampin或Gentamicin耐药性的产生，而且能使Rifampin或Gentamicin耐药菌株对Rifampin或Gentamicin重新敏感。

4、抗菌短肽5K5W的小鼠体内急性毒性实验

实验小鼠为BALB/C小鼠，雄性，18-22g，根据兰州大学实验动物伦理学管理办法饲喂。

急性毒性半数致死量LD₅₀预实验：每组3只，腹腔一次性注射用生理盐水溶解的5K5W，14天内观察死亡情况，用Polymyxin B作对照，探索引起100%死亡的最小剂量和0%死亡的最大剂量，确定剂量上下限。

正式试验：我们测得5K5W的LD₅₀剂量范围为50-150 mg/kg，对照药Polymyxin B的剂量范围为15-25 mg/kg。因此我们根据5K5W的剂量范围计算出其分组的公比为1.316，将其分为5组，分别是50，65.8，86.6，114，150 mg/kg。对照药Polymyxin B的分组的公比为1.185，将其分为4组，分别是15，17.8，21，25 mg/kg，分别进行接下来的正式试验。根据分组我们对各组小鼠腹腔一次注射相应剂量的5K5W或Polymyxin B，14天内观察死亡情况，计算LD₅₀，并对死亡小鼠取心，肝，脾，肺，肾做病理学切片，观察药物对脏器的毒性。结果如表4和图9。

表4抗菌短肽5K5W和Polymyxin B对BALB/C小鼠的LD₅₀

从表4的结果可以看出抗菌短肽5K5W的体内毒性比Polymyxin B低4倍，毒性较低。从图9脏器的HE切片看，Polymyxin B可引起各大脏器的出血及其炎症反应，Polymyxin B尤其对于脾脏和肾脏的毒性较强，而且Polymyxin B致死的小鼠都是在2 h内死亡的，从肺脏的检查结果来看，肺泡收缩严重，小鼠可能因窒息缺氧而死亡。而5K5W致死的小鼠都是在24h以后缓慢死亡的，它仅对肝脏和肾脏肾小球有微弱的毒性。但5K5W致死剂量远大于Polymyxin B。

5、抗菌短肽5K5W治疗小鼠肺炎克雷伯杆菌诱导的细菌性肺炎实验

BALB/C小鼠，雄性，18-22g，根据兰州大学实验动物伦理学管理办法饲喂。分为5组，每组各8只小鼠，分别为正常组，模型组，阳性药组（Polymyxin B，5 mg/kg治疗组），5K5W治疗组（5 mg/kg，10 mg/kg），小鼠用戊巴比妥麻醉后，用雾化针给每只小鼠肺部支气管处给予负荷剂量的肺炎克雷伯杆菌ATCC700603（MH肉汤中，25μL，3×10⁹CFU/mL）造成细菌性肺炎模型，给药组3小时后腹腔注射第一次给予相应剂量的药物。12小时后腹腔注射第二次给予相应剂量的药物。24小时候处死，左肺匀浆后将匀浆液（浓度为1mg组织/mL）及其稀释液涂平板计数。右肺及其肝脏泡多聚甲醛用于HE切片。结果如图10所示。

图10中，从平板计数结果来看，5K5W对肺炎克雷伯杆菌造成的细菌性肺炎小鼠有明显的治疗效果，且与Polymyxin B的治疗效果无统计学差异。并且治疗剂量的5K5W对小鼠的肺和肝脏都没有任何毒性。5 mg/kg的Polymyxin B对小鼠肺和肝脏还是表现出了较大的毒性。因此10 mg/kg的5K5W应用于小鼠体内表现出了优越的抗菌活性，并且没有出现毒性。

综上，体外抑菌实验、溶血活性实验、诱导耐药实验以及急性毒性实验表明，本发明的α螺旋抗菌短肽具有高抗菌活性和低毒性，且无诱导耐药性，将α螺旋抗菌短肽与Rifampin或Gentamicin联用可以减少Rifampin或Gentamicin耐药性的产生；本发明的α螺旋抗菌短肽还可以用于治疗小鼠肺炎克雷伯杆菌诱导的细菌性肺炎，因此，其在制备临床抗菌药物中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明抗菌短肽5K5W的质谱图；

图2为本发明抗菌短肽2KRI4W的质谱图；

图3为本发明抗菌短肽4KR5W的质谱图；

图4为本发明抗菌短肽3RI4F的质谱图；

图5为本发明抗菌短肽与小鼠红细胞孵育后对红细胞的溶血活性结果；

图6为本发明抗菌短肽5K5W与铜绿假单胞菌连续作用15天后的诱导耐药结果；

图7为本发明抗菌短肽5K5W与Rifampin联合用药后抗诱导耐药的铜绿假单胞菌的棋盘图；

图8为本发明抗菌短肽5K5W与Gentamicin联合用药后抗诱导耐药的铜绿假单胞菌的棋盘图；

图9为本发明抗菌短肽5K5W、Polymyxin B致小鼠急性毒性死亡后的病理学检查结果图；

图10为本发明抗菌短肽5K5W治疗小鼠细菌性肺炎的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽的合成作进一步说明。

实施例1：抗菌短肽5K5W的合成

（1）树脂的活化及预处理

称取0.5g的Fmoc-NH₂-MBHA树脂（0.40mmol/g），加入多肽固相合成仪中，经DCM溶胀30min，DMF洗涤后，茚三酮显色法鉴定树脂，若无色表明树脂正常。

（2）Fmoc-5K5W-MBHA的合成

溶胀后的树脂用含有20%哌啶的DMF溶液洗涤脱去Fmoc保护基团，茚检树脂呈蓝紫色即可。将3倍过量的Trp、3倍过量的HOBt、HBTU，6倍过量的DIEA用重蒸DMF溶解加入到合成仪中搅拌1h，反应到时间后，茚检树脂呈无色透明表明缩合成功，得到Fmoc-Trp-MBHA。

按照上述方法依次缩合Trp，Trp，Lys，Lys，Trp，Lys，Lys，Trp，Trp，Lys得到Fmoc-Lys-Trp-Trp-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-MBHA。

（3）多肽切割

将所得Fmoc-Lys-Trp-Trp-Lys-Lys-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-MBHA用含有20%哌啶的DMF溶液洗涤脱去Fmoc保护基团后，依次用DCM、甲醇洗涤，彻底抽干树脂。加入10mL切割试剂（TFA:Tris:水=9.5:0.25:0.25(v:v:v)）反应3h，经乙醚萃取后冷冻干燥。

（4）多肽纯化

RP-HPLC纯化条件为流动相A：0.1%TFA/水，流动相B：0.1%TFA/乙腈，采用线性梯度洗脱，收集目标峰流出液，冻干。

其质谱图见图1。分子量理论计算结果为1588.97，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌短肽结构正确。

实施例2：抗菌短肽2KRI4W的合成

（1）树脂的活化及预处理

同实施例1。

（2）Fmoc-2KRI4W-MBHA的合成

按照上述方法依次缩合Trp，Trp，Thr，Lys，Ile，Arg，Lys，Trp，Trp，Gly得到Fmoc-Gly-Trp-Trp-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Trp-Trp-MBHA。

（3）多肽切割

同实施例1。

（4）多肽纯化

同实施例1。

其质谱图见图2，分子量理论计算结果为1445.74，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌短肽结构正确。

实施例3：抗菌短肽4KR5W的合成

（1）树脂的活化及预处理

同实施例1。

（2）Fmoc-4KR5W-MBHA的合成

按照上述方法依次缩合Trp，Trp，Lys，Lys，Trp，Arg，Lys，Trp，Trp，Lys得到Fmoc-Lys-Trp-Trp-Lys-Arg-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-MBHA。

（3）多肽切割

同实施例1。

（4）多肽纯化

同实施例1。

其质谱图见图3，分子量理论计算结果为1616.98，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌短肽结构正确。

实施例4：抗菌短肽3RI4F的合成

（1）树脂的活化及预处理

同实施例1。

（2）Fmoc-3RI4F-MBHA的合成

溶胀后的树脂用含有20%哌啶的DMF溶液洗涤脱去Fmoc保护基团，茚检树脂呈蓝紫色即可。将3倍过量的Phe、3倍过量的HOBt、HBTU，6倍过量的DIEA用重蒸DMF溶解加入到合成仪中搅拌1h，反应到时间后，茚检树脂呈无色透明表明缩合成功，得到Fmoc-Phe-MBHA。

按照上述方法依次缩合Phe，Phe，Thr，Arg，Ile，Arg，Arg，Phe，Phe，Gly得到Fmoc-Gly-Phe-Phe-Arg-Arg-Ile-Arg-Thr-Phe-Phe-MBHA。

（3）多肽切割

同实施例1。

（4）多肽纯化

同实施例1。

其质谱图见图4，分子量理论计算结果为1345.60，与质谱鉴定结果一致，证明抗菌短肽结构正确。

Claims

1.具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽，其特征在于，所述抗菌短肽是以α螺旋多肽为结构基础，引入带正电荷氨基酸，以及疏水性不含硫氨基酸得到的两亲性α螺旋抗菌短肽，其结构通式为：XYYXXYXXYY-NH₂；

所述抗菌短肽为2KRI4W，其氨基酸序列如SEQ ID No.1。

2.如权利要求1所述的具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌药物或抗革兰氏阴性菌药物。

3.如权利要求2所述的具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用，其特征在于，将α螺旋抗菌短肽与Rifampin或Gentamicin联用以减少Rifampin或Gentamicin耐药性的产生。

4.如权利要求2所述的具有高抗菌活性、低毒性的α螺旋抗菌短肽在制备治疗小鼠肺炎克雷伯杆菌诱导的细菌性肺炎的药物中的应用。