CN108084249A - 一种用于抗雌激素受体α的稳定多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多肽，其结构如下所示：本发明还提供了上述的一种多肽在制备抑制雌激素受体阳性癌细胞生长活性的药物中的用途。本发明开发了一类稳定多肽雌激素受体拮抗剂，具有较好的稳定性，并且能够穿透细胞膜。能够与激活的雌激素受体alpha结合，抑制雌激素受体alpha的转录活性，显示出较好的生物活性，抑制雌激素受体阳性肿瘤的生长。更进一步，与临床药物他莫昔芬联合使用显示出比药物单独使用更好的抗肿瘤活性。

Description

一种用于抗雌激素受体α的稳定多肽及其用途
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽，具体来说是一种用于抗雌激素受体α的稳定多肽及其用途。
背景技术：
乳腺癌作为世界范围内危害广大女性健康和生命的主要妇科恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤中其发病率和死亡率均居首位。
70％以上的乳腺癌是雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌，雌激素受体α是一种转录因子，其过度活化会激活一些癌基因的表达从而驱动雌激素受体阳性的癌细胞的生长。
针对ERα这个肿瘤靶点已经开发出了一些小分子抑制剂，比如他莫昔芬(tamoxifen)是目前应用最广泛的乳腺癌内分泌治疗药物，其通过与体内雌激素竞争性结合雌激素受体的配体结合口袋，抑制其活性，从而抑制肿瘤细胞的生长。但是，随之产生的乳腺癌治疗中的耐药问题大大影响了他莫昔芬的临床疗效和进一步推广。
最近在一些发生转移的耐药性乳腺癌中发现了雌激素受体持续性激活的突变体，因此开发靶向雌激素受体配体结合口袋以外区域的抑制剂显得非常必要。
ERα活化会招募一些共激活因子来调控下游基因的表达，这是典型的蛋白-蛋白相互作用，抑制这一作用方式是潜在的新的抑制肿瘤生长的策略。然而由于蛋白-蛋白相互作用一般作用界面浅而宽泛，一般的小分子化合物很难抑制。
多肽类药物是一类引起人们广泛关注和兴趣的靶向分子，从分子量上看，多肽类分子一般不超过50个氨基酸，其分子量介于小分子(小于500Da)与生物大分子(大于5000Da)之间，有效地填补了分子量缺口。与生物大分子类似，多肽类分子对于靶点也有较高的结合力与选择性，相对于小分子类药物具有更小的脱靶效应。而多肽在体内的代谢产物为氨基酸，最大限度地降低了毒性。共激活因子一般通过包含LXXLL(其中L代表亮氨酸，X代表任意氨基酸)元件的α螺旋与ERα相互作用，理论上体外合成的包含LXXLL元件的多肽能够竞争性抑制这一作用，然而线性多肽由于具有不稳定性及很难穿过细胞膜等缺点，限制了其进一步发展。
近年来科学家开发出一些化学方法(二硫键、烯烃复分解等)来稳定或直接模拟α螺旋多肽，然而关于其对雌激素受体阳性肿瘤的生物活性鲜有报道。
因此，针对雌激素受体α配体结合口袋以外区域开发出新的雌激素受体α抑制剂来治疗癌症显得非常必要。
发明内容：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于抗雌激素受体α的稳定多肽及其用途，所述的这种用于抗雌激素受体α的稳定多肽及其用途要解决现有技术中治疗雌激素受体α阳性乳腺癌的药物效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种多肽，其特征在于，其结构如下所示：
其中，R1为色氨酸、异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、已酰基、苯邻二甲酰亚胺类、蛋白水解靶向嵌合体或者生物素；
R2为精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或者谷氨酸；
L1为叔亮氨酸、γ-甲基-L-亮氨酸或者亮氨酸；
L2为亮氨酸、γ-甲基-L-亮氨酸；
L3为亮氨酸或者其衍生氨基酸。
进一步的，上述的一种多肽的氨基酸序列为：
Ac-Trp-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或者
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Npg-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2、或
FITC-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Npg-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2、或
H-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
H-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2、或
Biotin-linker-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
Leu-Ala-Pro(OH)-Tyr-Ile-linker-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-
Npg-Leu-Gln-NH2、或
Phthalimide-linker-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-
NH2；
进一步的，所述的linker为长链氨基酸或脂肪酸，长链碳原子个数为4-16个，包括且不限于氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸。
本发明还提供了上述的一种多肽在制备抑制雌激素受体阳性癌细胞生长的药物中的用途。
本发明还提供了上述的一种多肽与临床抗雌激素受体阳性肿瘤药物联合使用的用途。
本发明还提供了上述的一种药物组合物，由上述的一种多肽和他莫昔芬组成。
本发明提供了基于非天然天冬氨酸形成酰胺键关环的稳定多肽，其显示出较稳定的螺旋性，高的穿膜能力和抗降解能力，用于抑制雌激素受体ERα高表达的肿瘤。本发明所述稳定多肽作用于雌激素受体上不同于已经产生耐药性了的配体结合口袋的新的位点，其作用方式是全新的，首次报道了其对雌激素受体α阳性的乳腺癌细胞的靶向抑制生长作用，并且对正常细胞的毒副作用较小。
本发明通过荧光偏振实验、X射线晶体结构、圆二色谱、MTT实验、流式细胞术、免疫荧光、实时定量荧光PCR反应、荧光素酶报告基因等实验证实稳定多肽能够选择性地抑制雌激素受体α的活性，穿透细胞膜并且对雌激素受体α阳性的乳腺癌细胞有特异性的抑制生长作用。
细胞实验显示本发明的稳定多肽对雌激素受体alpha阳性的MCF-7及T47D乳腺癌细胞都有抑制细胞增殖效果，并且呈剂量依赖性，而对雌激素受体alpha阴性MDA-MB-231细胞及正常细胞无明显的抑制作用，说明该稳定多肽能特异性地抑制雌激素受体alpha阳性的乳腺癌细胞的生长。小鼠移植瘤体内实验也验证了该稳定多肽抑制ERα阳性肿瘤生长的有效性，并且与临床药物他莫昔芬联合使用显示出更好的抗肿瘤活性。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明开发了一类稳定多肽雌激素受体拮抗剂，具有较好的稳定性，并且能够穿透细胞膜，与激活的雌激素受体alpha结合，抑制共激活因子的结合，从而抑制雌激素受体alpha的转录活性，显示出较好的生物活性。
附图说明：
图1为纯化ERα-LBD的SDS-PAGE图及凝胶层析图(A为纯化ERα-LBD的SDS-PAGE图；B为纯化ERα-LBD的凝胶层析图)。
图2为ERα-LBD与稳定多肽的复合物晶体形貌图。
图3为雌激素受体ERα-LBD与稳定多肽复合物晶体结构(A为稳定多肽与ERα-LBD的复合物晶体结构表面静电显示图；B为稳定多肽与ERα-LBD晶体结构相互作用图；图C显示晶体结构具体参与相互作用的氨基酸；图D显示稳定多肽与ERα-LBD的复合物晶体结构和来自共激活因子的天然多肽与ERα-LBD的复合物晶体结构的对比图)。
图4为稳定多肽与雌激素受体ERα，ERβ，维他命D受体(VDR)及孕激素受体(PR)的结合力比较。(A)FITC标记的线性雌激素受体配体多肽(1FITC)及原始稳定多肽2FITC与雌激素受体ERα，ERβ，维他命D受体(VDR)及孕激素受体(PR)的结合力；B)雌激素受体ERα与稳定多肽复合物晶体结构；C)晶体结构中稳定多肽与来自共激活因子NR BOX2序列的线性多肽结构对比图)。
图5为示例多肽序列。
图6为代表性稳定多肽的HPLC色谱图(A)和质谱图(B)。
图7为多肽HPLC色谱。
图8为多肽在水中的圆二色谱图。
图9为MTT实验检测多肽对MCF7细胞活力影响；(A)MTT实验检测多肽对MCF7细胞活力影响；B)MTT实验测试20μM多肽对不同细胞系的影响)。
图10为MTT实验检测多肽对ERα阳性的T47D细胞(A)，ERα阴性的MDA-MB-231细胞(B)，正常的乳腺细胞系MCF-10A(C)的细胞活性的影响。
图11为荧光偏振实验测试多肽与ERα-LBD的体外结合；A)荧光偏振实验测试多肽与ERα的体外结合；B)多肽6FITC与多种核受体家族蛋白的结合常数比较。
图12为荧光偏振实验测试多肽1FITC(A)、、2FITC(B)、、6FITC(C)与孕激素受体配体结合结构域的结合。
图13为荧光偏振实验测试稳定多肽6FITC与雌激素受体ERβ的结合(A图)，维他命D受体VDR的结合(B图)。
图14为流式细胞术检测多肽的细胞穿膜能力；A)FITC标记多肽的流式细胞图；B)流式细胞术检测5μM FITC标记多肽处理MCF7细胞3小时后细胞中的平均荧光强度。
图15为免疫荧光及激光共聚焦显微成像检测多肽的细胞分布；细胞核用DAPI染色，ERα用免疫荧光检测(红色)，FITC标记的多肽显示绿色。
图16为RT-PCR检测多肽对ERα下游基因pS2(A图)，PgR(C图)，BCAS3(D图)及内参基因β-actin(B图)的转录水平的影响。
图17为多肽的溶血性结果。
图18为多肽6W不同给药方式在小鼠体内血浆浓度随时间变化情况；蓝色，红色，绿色分别代表静脉注射，腹腔注射和皮下注射。
图19为多肽的体内抑制肿瘤生长曲线图。
图20为稳定多肽对MCF7人乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤相对抑制率。
图21为稳定多肽对MCF7人乳腺癌移植瘤小鼠体重影响。
图22为红外成像测试Cy5荧光基团标记的稳定多肽静脉注射和瘤内注射时体内分布；肿瘤部位被圈起。
图23为Cy5荧光集团标记的稳定多肽静脉注射和瘤内注射荷瘤小鼠24小时后肿瘤、肾、肝、脾、心脏、肺、脑组织的红外成像；Vehicle溶剂为2％DMSO+98％生理盐水。
图24为苏木精-伊红染色检测稳定多肽分别对小鼠心脏、肝、脾、肺、肾组织的影响。
图25免疫组化检测多肽处理对肿瘤抗原的影响。
图26为多肽Ac-Trp-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图27为多肽
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图28为多肽
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Npg-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图29为多肽
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图30为多肽
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图31为多肽
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图32为多肽
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(Dap-Ile-Npg-isoAsp)-Gln-Npg-Arg-Npg-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图33为多肽FITC-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图34为多肽
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图35为多肽
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Npg-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图36为多肽
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图37为多肽
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图38为多肽
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
图39为多肽
FITC-βAla-Arg-cyclo(Dap-Ile-Npg-isoAsp)-Gln-Npg-Arg-Npg-NH2的高效液相色谱图与质谱图。
具体实施方式：
为了便于理解本发明，下面通过实施例并结合附图对本发明内容做进一步阐述，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案，这些实施例并不限制本发明的保护范围。本领域技术人员将意识到可以对本发明多肽进行不同的替换/修饰和/或添加以便裁剪多肽适于不偏离本发明范围的特异应用。以下更详细的描述了这些修饰和添加，其可以包括在同一多肽链中的额外的氨基酸，或与本发明多肽化学缀合或结合的标记和/或治疗药物。
实施例1
本发明的一个实施例是，基于非天然天冬氨酸形成酰胺键关环的稳定多肽能够穿过细胞膜。
本发明基于共激活因子上一段与雌激素受体α相互作用的序列HKILHRLLQ，利用多肽固相合成法合成多肽，此线性多肽命名为多肽1。同时将不参与相互作用的i位赖氨酸及i+3位组氨酸位点分别突变为带侧链羧基的氨基酸(这里以非天然天冬氨酸为例)和带侧链氨基的氨基酸(这里以二氨基丙酸为例)，固相合成多肽，用三氟乙酸将多肽粗品从固相树脂切下来，并且用高效液相色谱纯化目的多肽，用质谱鉴定多肽(本发明的多肽均用上述的固相合成的方法制备，固相合成的方法为本领域的常规技术)。其中非天然天冬氨酸侧链羧基和2，3二氨基丙酸的侧链氨基用四苯基磷钯脱保护后，在氮甲基吗啡啉的弱碱性条件下发生化学反应形成酰胺键关环，稳定多肽二级构象。同时合成了氨基酸序列打乱的对照多肽6*。为了便于测定多肽浓度，在多肽氨基端分别连接个具有紫外吸收的色氨酸，中间用β-丙氨酸连接，分别标记为多肽1w--6*w(色氨酸标记的氨基酸在右下方标记W，以下同样标记)。同时为了用荧光显微镜观察多肽的细胞定位，在多肽氨基端分别连接异硫氰酸荧光素(FITC)，中间用β-丙氨酸连接，分别标记为多肽1FITC--6*FITC。
部分代表多肽序列及分子量如下表所示
本发明选择的线性雌激素受体配体多肽序列为
Ac-Trp-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2(下面命名为1W，Trp标记的氨基酸在右下方标记W，以下同样标记)，来自于共激活因子与雌激素受体ERα相互作用的多肽区域SRC-Box2691-699，稳定多肽序列为Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2(命名为2W)，相比天然线性多肽，稳定多肽具有提高的螺旋含量，更好的结合靶点的能力，稳定性和穿透细胞膜的能力。之前雌激素受体多肽抑制剂由于穿透性的原因，细胞活性鲜有报道。
实施例2
为了进一步理解本发明，研究多肽2(序列为H-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2)与雌激素受体ERα相互作用的结构，解析了复合物的晶体结构。首先，用固相合成的方法合成了稳定多肽，纯化分离了蛋白ERα-LBD，蛋白SDS-PAGE电泳图及凝胶层析色谱图见图1。然后用2到4倍多肽与ERα-LBD孵育，浓缩到4mg/ml左右，然后用座滴法得到了复合物的晶体(图2)，然后收集了多套X射线衍射数据，并用分子置换法确定了相位，用COOT软件修正了结构模型，用Phenix软件做了结构优化，最终得到了蛋白-稳定多肽复合物的晶体结构。
实施例3
ERα配体结合域与多肽2的复合物晶体结构分析见图3，从晶体结构图可以看出，稳定多肽疏水性亮氨酸残基正好插入到ERα配体结合域的共激活因子结合的疏水口袋。雌激素受体ERα表面542位负电氨基酸谷氨酸(Glu)与362位正电氨基酸赖氨酸(Lys)形成“带电钳”结构通过与多肽主链形成离子键进一步稳定多肽的结合，同时多肽3号位的异亮氨酸与4号位的亮氨酸能与ERα配体结合域542位的谷胺酸形成氢键；ERα配体结合域的362位的赖氨酸与多肽的第7位和第8位的亮氨酸形成氢键，进一步稳定相互作用。稳定多肽侧链酰胺键关环将结构锁定，同时主链形成i，i+4氢键作用，进一步将多肽稳定在α-螺旋结构。
实施例4
本发明测试了线性ER多肽配体1FITC和稳定多肽2FITC与ERαLBD的结合力，同时测试了与其他核受体雌激素受体ERβ，维他命D受体(VDR)及孕激素受体(PR)的结合力，比较了稳定多肽对不同核受体的结合力选择性(图4A)。Moore等人报道，在关环的侧链氨基酸上加个甲基基团能够进一步调节稳定多肽与ERαLBD上疏水口袋的结合。雌激素受体ERα与稳定多肽复合物晶体结构显示，稳定多肽同样结合在ERαLBD上共激活因子结合的疏水口袋上，在多肽的IL1XXL2L3模块中，L1和L3侧链处于螺旋多肽同一侧，插入到疏水口袋中(图4B)。本发明推测将亮氨酸突变为γ-甲基-L-亮氨酸(Npg)，可能会增强多肽与雌激素受体ERα的结合，因此本发明设计合成了一系列稳定多肽。为了准确测定多肽浓度，在氨基端连接了色氨酸，以β丙氨酸为连接。同时也合成了相应的FITC标记的多肽。
实施例5
用固相合成的方法合成了稳定多肽，用三氟乙酸将多肽粗品从固相树脂切下来，并且用高效液相色谱的方法纯化目的多肽，用质谱鉴定多肽分子量(如图26-39)。图6为代表性稳定多肽6W的HPLC色谱图和MS鉴定图。图7将纯化的多肽1W-6W的高效液相色谱图叠加在一起，可以看出将亮氨酸突变为γ-甲基-L-亮氨酸(Npg)会一定程度上增加多肽的疏水性，其中多肽6W的疏水性最强。
实施例6
用圆二色谱CD测多肽在水溶液中的二级结构，从图8可以看到，线性对照多肽1W呈无规则卷曲，而稳定多肽2W--6W具有螺旋结构，说明末端非天然天冬氨酸诱导成核的多肽稳定方法能较好地将多肽稳定成螺旋结构。其中将亮氨酸突变为γ-甲基-L-亮氨酸(Npg)的多肽螺旋含量有提高，将亮氨酸全部突变为γ-甲基-L-亮氨酸的多肽6W具有最高的螺旋含量。本发明猜测在多肽的IL1XXL2L3模块中，将亮氨酸L2突变为γ-甲基-L-亮氨酸时，i位的异亮氨酸(Ile)和i+4位的γ-甲基-L-亮氨酸(Npg)可能会形成疏水相互作用，L1和L3突变为γ-甲基-L-亮氨酸(Npg)，可能也会形成i，i+4疏水相互作用，进一步稳定多肽的螺旋结构。Galande等人曾在二硫键关环的稳定多肽中计算模拟了i位的异亮氨酸和i+4位的γ-甲基-L-亮氨酸可能会形成疏水相互作用，与本发明的发现相吻合。
实施例7
用MTT实验测试了多肽对细胞活性的影响。图9A中可以看到稳定多肽6W对雌激素受体ERα阳性的MCF7细胞具有强烈的抑制作用，其IC50为12μM左右，低于阳性对照他莫昔芬。而序列打乱的6W对照多肽对MCF7细胞活性的抑制作用较弱，说明6W是通过其特定的序列作用于ERα而发挥作用。6W同时对ERα阳性的T47D细胞也具有较强的增殖抑制作用，而对ERα阴性的MDA-MB-231细胞及正常的乳腺细胞系MCF-10A具有较低的毒性(图9B，图10)，说明该稳定多肽雌激素受体抑制剂能选择性地抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖。后面本发明重点发明稳定多肽6W的生物活性和作用机制。
实施例8
用荧光偏振实验测定生物活性最强的稳定多肽6W对雌激素受体ERα的体外结合能力，由于核受体家族蛋白ERβ，VDR(维他命D受体)，孕激素受体(RgR)等都具有LXXLL序列模块，为了检测多肽与ERα结合的选择性，本发明也体外表达纯化了核受体家族蛋白ERβ，VDR和RgR，并测定了稳定多肽6W与这些核受体蛋白的体外结合能力。结果显示稳定多肽6FITC与雌激素受体alpha的结合很强，其结合常数在几十纳摩尔级别，比初始的稳定多肽2FITC有一定提升，而多肽6FITC序列打乱后的多肽6*FITC与ERα基本没有结合(图11)，说明序列对结合能力影响很大。同时，结合实验表明，稳定多肽6FITC对核受体家族其他蛋白比如ERβ，VDR(维他命D受体)，孕激素受体(RgR)结合力明显弱于ERα(图12，图13)，说明其具有一定选择性。
实施例9
为了发明多肽的穿膜能力，固相合成多肽时在氨基端连接FITC(异硫氰酸荧光素)，然后用流式细胞仪检测多肽的穿膜能力。对于MCF7细胞，可以看到线性多肽1FITC穿膜能力很弱，关环稳定多肽穿膜能力提高，其中稳定多肽6FITC穿膜能力最强，并且算出多肽在细胞中的相对荧光强度(图14)。同时用另外一种细胞系U2OS测试了多肽的穿膜能力，结果与多肽在MCF7中的穿膜情况相似，说明这些多肽对不同细胞的穿膜能力有一定普适性，其中稳定多肽6FITC穿膜能力最强。
实施例10
为了进一步验证多肽的细胞穿膜能力及与细胞内ERα的定位，本发明用免疫荧光检测ERα，同时用激光共聚焦显微成像检测FITC标记的多肽与ERα的分布。可以看到线性多肽1FITC基本不能穿过细胞膜，稳定多肽2FITC可以穿过细胞膜，而优化设计的稳定多肽6FITC穿膜能力最强，能明显穿透细胞，并且能够部分进入细胞核，可能与细胞内ERα部分共定位(图15)。
实施例11
本发明另一个实施例是用RT-PCR实验检测了多肽对细胞内ERα转录活性的影响。结果标明，稳定多肽6W可以抑制ERα下游基因pS2和PgR转录mRNA水平，而线性多肽及序列打乱的对照多肽不能抑制ERα转录活性。同时在此浓度下，稳定多肽处理对细胞内“管家基因”β-actin的转录水平没有太大影响(图16)。
实施例12
多肽类药物一般注射给药比较多，如果药物的溶血性比较强，进入血液循环可能会发生溶血，引起较大的毒性。为了检测多肽的溶血性，本发明用新鲜的小鼠血液做发明。取了新鲜的小鼠血液，加了防凝血剂防止血细胞聚集，然后加入梯度浓度的多肽，37℃孵育一小时后高速离心，测定上清中的血红素，测定吸收波长为570nm。0.1％Triton-X100和0.9％生理盐水分别作为正负对照，结果如图17所示，可以看到稳定多肽具有比较低的溶血性，因此进一步发明其在小鼠体内的活性应该不会发生溶血，具有一定安全性。
实施例13
为了验证细胞活性最强的稳定多肽6W的体内抗肿瘤效果，首先测定了其在小鼠中的药代情况。经静脉、腹腔或皮下给予药物6W后，雌性Balb/c小鼠血浆中的药物浓度见表1-3，相应的药代动力学参数见表4，相应的药时曲线图见图18。
静脉给予3mg/kg 6W后，5分钟时血药浓度为30000±4101ng/mL。给药后24小时内6W的血药浓度曲线下面积(AUC0-24h)为20964ng·h/mL，消除半衰期为0.35小时。6W的清除率为0.14L/h/kg，表观分布容积为0.10L/kg。
腹腔给予10mg/kg 6W后，给药后2h达峰，峰浓度为22550±212ng/mL。给药后24小时内6W的血药浓度曲线下面积(AUC0-24h)为60057ng·h/mL。腹腔给药相对静脉注射的生物利用度为85.9％。
皮下给予10mg/kg 6W后，给药后1h达峰，峰浓度为7835±983ng/mL。给药后24小时内6W的血药浓度曲线下面积(AUC0-24h)为25 239ng·h/mL。皮下给药相对静脉注射的生物利用度为36.1％。
表1 6W静脉给药后(3mg/kg)，血浆中6W的浓度(ng/mL)
BLOQ:低于最低定量检测限(1ng/mL)
表2 6W经腹腔给药后(10mg/kg)，血浆中6W的浓度(ng/mL)
BLOQ:低于最低定量检测限(1ng/mL)
表3 6W经皮下给药后(10mg/kg)，血浆中6W的浓度(ng/mL)
BLOQ:低于最低定量检测限(1ng/mL)
表4 6w不同途径给药后的药代参数
续表4 6w不同途径给药后的药代参数
多肽6W不同给药方式在小鼠体内血浆浓度随时间变化曲线如图18所示，腹腔注射时多肽6W生物利用度最高，并且维持在有效浓度的时间较长，故后面的药效实验准备选择腹腔注射给药方式。
实施例14
本发明另一个实施例是测试稳定多肽对MCF7人乳腺癌Balb/c裸小鼠移植瘤模型肿瘤体积的影响。当瘤体积达到100mm3后按照体重随机分组给药，以分组给药当天作为第0天，肿瘤体积变化如图19所示。溶媒对照组肿瘤生长良好，实验结束时肿瘤体积为378.37±91.08mm3。阳性对照他莫昔芬组在腹腔给药后能够抑制肿瘤生长。多肽6W与他莫昔芬腹腔注射联合给药与溶媒对照组相比，肿瘤体积显著地降低，说明联合给药能有效抑制人MCF7乳腺癌细胞小鼠移植瘤的生长，由于效果明显，联合给药组在第33天停止给药，并将小鼠处理。多肽6W一开始腹腔给药时抑制肿瘤效果不太明显，可能是10mg/kg(200μg/200μL/小鼠)的腹腔给药浓度没有使多肽达到有效作用浓度。在第22天将此组给药途径改为瘤内注射(图19箭头所示)，药物浓度提高一倍，给药剂量为40μg/20μL/小鼠，每天给药，每天一次。结果显示药物浓度提高一倍后，相对于对照组，多肽6W能有效抑制人MCF7乳腺癌细胞小鼠移植瘤的生长。
实施例15
本发明另一个实施例是测试稳定多肽给药对MCF7人乳腺癌Balb/c裸小鼠移植瘤模型小鼠体重的影响。数据显示不论稳定多肽单独给药还是与他莫昔芬联合给药，对小鼠体重影响都很小(图21)，说明稳定多肽体内给药对小鼠毒性不明显。
实施例16
本发明另一个实施例是红外成像测试Cy5红外基团标记的稳定多肽在活体荷瘤小鼠体内分布。注射药物前及注射药物后10min，30min，1h，2h，4h，24h分别用IVIS Spectrum活体成像系统(Perkin Elmer)做活体红外成像，照肿瘤一面的腹面成像。图22结果显示，静脉注射时多肽6--Cy5能够在肿瘤部位聚集。同时瘤内注射时，稳定多肽基本聚集在肿瘤部位，很少扩散到其他器官，并且24小时后仍有较高荧光强度。
在第24h照完小鼠全身成像后，将小鼠的肿瘤、肾、肝、脾、心脏、肺、脑组织分别取出，同样用IVIS Spectrum活体成像系统做红外成像，用配套的红外成像软件计算各组织器官红外荧光强度。6--Cy5静脉注射24小时后，在肿瘤组织仍有较多分布，另外在肾、肝和肺有一定分布，在其他组织基本没有分布。瘤内注射24小时后，仍然聚集在肿瘤组织并且有较高强度，其他组织没有分布(图22)。说明稳定多肽注射后能够在肿瘤部位富集，发挥抗肿瘤效果。
实施例17
本发明另一个实施例是苏木精-伊红染色检测多肽对小鼠各身体组织的影响。稳定多肽抗MCF7人乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤生长的药效实验给药结束后，将小鼠处理。分别取出小鼠肿瘤及肾、肝、脾、心脏、肺、脑组织，部分样品立即放入福尔马林保存，用苏木精-伊红染色检测多肽对小鼠各身体组织的影响。结果如图24所示，可以看到多肽6W单独给药及与他莫昔芬联合给药相对于对照组对小鼠各组织器官都没有太大影响，说明该稳定多肽药物对小鼠各组织器官没有明显毒性作用。
实施例18
本发明另一个实施例是免疫组化检测多肽处理对肿瘤抗原的影响。如图25所示，多肽6W能抑制肿瘤中癌蛋白抗原BCAS3的表达，与他莫昔芬联合使用抑制效果更强。

Claims (6)

1.一种多肽，其特征在于，其结构如下所示：
其中，R1为色氨酸、异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、已酰基、苯邻二甲酰亚胺类、蛋白水解靶向嵌合体或者生物素；
R2为精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或者谷氨酸；
L1为叔亮氨酸、γ-甲基-L-亮氨酸或者亮氨酸；
L2为亮氨酸、γ-甲基-L-亮氨酸；
L3为亮氨酸或者其衍生氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种多肽，其特征在于，其氨基酸序列为
Ac-Trp-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或者
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Npg-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
Ac-Trp-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2、或
FITC-βAla-His-Lys-Ile-Leu-His-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Npg-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
FITC-βAla-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2、或
H-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Leu-Leu-Gln-NH2、或
H-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Npg-Dap)-Arg-Npg-Npg-Gln-NH2、或
Biotin-linker-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
Leu-Ala-Pro(OH)-Tyr-Ile-linker-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2、或
Phthalimide-linker-Arg-cyclo(isoAsp-Ile-Leu-Dap)-Arg-Npg-Leu-Gln-NH2。
3.根据权利要求2所述的一种多肽，其特征在于，所述的linker为长链氨基酸或脂肪酸，长链碳原子个数为4-16个，包括且不限于氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸。
4.权利要求1或者2所述的一种多肽在制备抑制雌激素受体阳性癌细胞生长的药物中的用途。
5.权利要求1或者2所述的一种多肽与临床抗雌激素受体阳性肿瘤药物联合使用的用途。
6.一种药物组合物，其特征在于：由权利要求1所述的一种多肽和他莫昔芬组成。
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