CN116196386A - 枸杞糖肽在制备治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及枸杞糖肽在制备预防或治疗药物诱导的帕金森病(Parkinson’s disease，PD)运动并发症的药物中的用途。优选地，将枸杞糖肽作为左旋多巴的伴侣药物，用于预防或治疗左旋多巴诱导的异动症。本发明以左旋多巴诱导的异动症(levodopa‑induced dyskinesia，LID)动物模型6‑羟基多巴胺中脑黑质定位注射和左旋多巴腹腔注射造模为研究对象，研究了枸杞糖肽改善LID的作用。结果显示枸杞糖肽能显著改善药物诱导的PD运动并发症LID，说明枸杞糖肽可作为伴侣药物辅助左旋多巴治疗PD。

Description

枸杞糖肽在制备治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物 中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及枸杞糖肽在制备预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物中的用途。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)也称为震颤麻痹，是一种以中脑黑质致密部多巴胺能神经元丢失和神经元内路易小体出现为特征的慢性神经退行性疾病。流行病学数据显示，60岁以上人群的患病率为2％，是目前日趋老龄化的社会亟待解决的一大沉重负担。半个世纪以来，以左旋多巴为主的多巴胺替代疗法一直是PD治疗的金标准。左旋多巴可通过血脑屏障并脱酸形成多巴胺，这种神经递质的补充虽然可以暂时缓解行为异常，但不能阻止神经元退行性病变，由于患者不得不终身服药来改善症状，随着疾病的进展以及治疗剂量的升高，多数患者会出现左旋多巴诱导的异动症等诸多运动并发症，严重影响患者生活质量，是帕金森病患者致残的重要原因。

左旋多巴诱导的运动并发症主要包括运动波动和异动症(levodopa-induceddyskinesia，LID)，根据临床表现，前者可分为剂末现象、开期延迟、开关现象和冻结步态四型，后者则可分为剂峰异动、关期肌张力障碍和双相性异动三型。服用左旋多巴是运动并发症的独立危险因素，由于其半衰期短、吸收代谢快，血药浓度波动会影响D1/2受体、谷氨酸受体和五羟色胺受体等相关信号通路，导致涉及神经元以及非神经元的错综复杂的级联反应，病理机制难以阐明，其中最经典的是多巴胺系统的扰乱。左旋多巴可通过反复刺激多巴胺D1受体引起蛋白激酶活性增强以及一系列的级联反应。首先，腺苷酸环化酶被D1受体激活，促进多巴胺和cAMP调节的磷蛋白-32(DARPP-32)的磷酸化，进而促进细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化和早期基因蛋白Delta FosB的表达增加，最后导致突触信号的“去功能化”丧失和基底神经节活性的失衡，从而促进了异动症的发生。

在治疗方面，除了脑深部电刺激和单侧苍白球损毁术等外科手段，目前可选药物非常有限，主要包括金刚烷胺、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂等，疗效常不能持续，并带来新的副作用。目前，药物诱导的运动并发症仍缺乏有效的治疗手段，使得患者长期处于抗PD药物的两难用药处境，治疗策略的研发方面仍然面临着重大挑战。

在中医学，PD属“颤证”范畴，早在黄帝内经时期就有对其症状的描述。明代医家孙一奎在《赤水玄珠》中首次将PD命名为“颤振症”，历代学者对此均有相应论述和经验积累。根据本病本虚标实的病机，中医理论指导的运动并发症治疗方案主要针对“风、火、痰、瘀、虚”的病机，重视平肝熄风、补益肝肾，即以治疗“颤证”为基本，加强平肝潜阳熄风治疗，同时给以解毒祛邪之品，调整患者本身脏腑功能及气血阴阳平衡，以求治病求本，标本兼顾。

枸杞子，中药名，为茄科植物，属宁夏枸杞的成熟果实，从古至今被誉为一种名贵中草药，被用于多种补益方剂中。《神农本草经》中记载：“枸杞主内邪，热中消渴，周痹风湿，久服坚筋骨，轻身不老，耐寒暑”，其味甘平，其药理作用为滋肾、润肺、补肝、祛风、明目，治肝肾阴亏、腰膝酸软、头晕、目眩等。枸杞子自2002年被中华人民共和国卫生部收录入药食两用中草药名单，药食同源是枸杞子的优势，具有很好的开发前景。现代药理学结果显示，枸杞子具有神经保护、清除自由基、抗炎等作用，广泛用于养生、保健等领域。

枸杞糖肽(LbGP)是中国科学院上海有机化学研究所田庚元研究员团队首次在枸杞中发现的具有免疫活性的成分，为一种多糖与肽链以共价结合的糖缀合物，有5种组分(LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5)，有明确的三维结构与鉴定方法，其制备方法包括纯物理离心、膜过滤提纯、真空冷冻干燥等。枸杞糖肽与以往研究的枸杞多糖有所不同，枸杞多糖是枸杞子中一类粗多糖的总称，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖等6种单糖组成，枸杞多糖在枸杞子中的含量约为2％-5％，《中国药典》要求枸杞子中枸杞多糖含量测定不得少于1.8％(以葡萄糖计)。

此前，已有研究显示枸杞多糖可发挥一定的PD保护作用。本发明人团队在对枸杞糖肽的前期研究中也发现其具有改善PD的作用(参见CN113750217A)，但关于枸杞糖肽在作为左旋多巴伴侣药物缓解药物诱导的PD运动并发症方面的研究尚未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中能够有效预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物不足的问题，本发明提供了枸杞糖肽在制备预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物中的用途。特别是，本发明提供了枸杞糖肽作为左旋多巴伴侣药物在制备药物诱导的PD运动并发症的药物中的应用。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

本发明提供了枸杞糖肽在制备预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物中的用途。

作为可选的方式，在上述用途中，所述帕金森病运动并发症为左旋多巴诱导的。

作为可选的方式，在上述用途中，所述帕金森病运动并发症包括运动波动和异动症。

作为可选的方式，在上述用途中，所述运动并发症包括轴向、肢向和口面部的异常不自主运动，其中轴向异常不自主运动为颈部上身向损伤对侧扭转运动，肢向异常不自主运动为对侧前肢重复性跳动或者肌张力障碍姿势，口面部异常不自主运动为颌运动和对侧舌头突出。

作为可选的方式，在上述用途中，将枸杞糖肽作为左旋多巴的伴侣药物，用于预防或治疗左旋多巴诱导的异动症(levodopa-induced dyskinesia，LID)。

本发明以LID行为学数据作为LID改善的最佳指标，通过检测并计算异常不自主运动(AIM)的评分证明枸杞糖肽可明显改善LID。本发明中，所述改善AIM包括轴向、肢向和口面部3个部分的评分。观察方法为：每次在左旋多巴给药后每30min观察一次，每次观察1min，共持续120min。

本发明以小鼠中脑的酪氨酸羟化酶TH的表达(多巴胺能神经元标志物)、DeltaFosB的表达和ERK1/2的磷酸化(与LID的发生密切相关)为LID改善的病理学指标，通过蛋白免疫印迹法分析上述指标证明枸杞糖肽可明显改善LID。

LID的致病机理是多样的，本发明以6-羟基多巴胺(6-OHDA)模拟神经性毒性导致的神经细胞受损导致PD，并以左旋多巴诱导动物模型出现LID症状。

作为可选的方式，在上述用途中，所述枸杞糖肽预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的剂量为1-100mg/kg。

优选地，所述枸杞糖肽预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的剂量为30mg/kg。

作为可选的方式，在上述用途中，所述枸杞糖肽的制备方法主要包括清洗、浸泡、破碎打浆、浸提、双道打浆、两级分离、膜分离、单效浓缩、冷冻干燥的步骤。其中，在双道打浆步骤分离出枸杞籽、在两级离心步骤中分离出枸杞果肉，在膜分离步骤中分离出寡糖，最终获得的产品为枸杞糖肽。

作为可选的方式，在上述用途中，所述枸杞糖肽包含以下一种或多种：LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4或LbGp5。

其中：LbGp1中蛋白含量为28.87％、LbGp2中蛋白含量为9.25％、LbGp3中蛋白含量为5.19％、LbGp4中蛋白含量为10.75％和LbGp5中蛋白含量为59.87％。

作为可选的方式，在上述用途中，所述枸杞糖肽包含LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5，其中LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5的质量比为(0.01-0.02)：(0.005-0.01)：(0.01-0.02)：(0.02-0.03)：(0.01-0.02)。

优选地，在所述枸杞糖肽中，LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5的质量比为0.018：0.0077：0.018：0.029：0.014。

作为可选的方式，在上述用途中，所述药物包含枸杞糖肽和药学上可接受的载体。

作为可选的方式，在上述用途中，所述药物的剂型为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂、颗粒剂、注射液、粉针剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂或栓剂。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明首次提出了可以将枸杞糖肽作为左旋多巴伴侣药物用于预防或治疗左旋多巴诱导的异动症。本发明以LID动物模型6-羟基多巴胺中脑黑质定位注射和左旋多巴腹腔注射造模为研究对象，研究了枸杞糖肽改善LID的作用。结果显示枸杞糖肽能显著改善药物诱导的PD运动并发症LID，说明枸杞糖肽可作为伴侣药物辅助左旋多巴治疗PD。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1示PD模型的构建和验证；

图2示LID造模和分组给药流程；

图3示造模和给药方法对小鼠体重无明显影响；

图4示各组药物对小鼠异常不自主运动的轴向评分的影响；

图5示各组药物对小鼠异常不自主运动的肢向评分的影响；

图6示各组药物对小鼠异常不自主运动的口面部评分的影响；

图7示各组药物对小鼠异常不自主运动的总分的影响；

图8示各组药物对小鼠纹状体TH蛋白表达的影响；

图9示各组药物对小鼠纹状体Delta FosB蛋白表达的影响；

图10示各组药物对小鼠纹状体ERK1/2磷酸化激活的影响。

具体实施方式

本发明提供了枸杞糖肽改善PD运动并发症的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，其都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

本发明所述枸杞糖肽的制备包括将枸杞子的水提物经纯物理离心、膜过滤提纯、真空冷冻干燥等工艺技术提取分离所得的一种多糖与肽链以共价结合的糖缀合物。其中含有LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5。其中：LbGp1中蛋白含量为28.87％、LbGp2中蛋白含量为9.25％、LbGp3中蛋白含量为5.19％、LbGp4中蛋白含量为10.75％和LbGp5中蛋白含量为59.87％。枸杞糖肽中，LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5的质量比为0.018：0.0077：0.018：0.029：0.014。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、实验材料和仪器

1.实验动物

C57BL/6J小鼠，雄性，6周龄，体重20-22g，购自于南方医科大学实验动物管理中心(许可证：SCXK(粤)2021-0041)，动物饲养于暨南大学医学实验动物中心，饲养温度23±2℃，湿度50±10％，标准小鼠饲料。各组实验动物自由进食、饮水。

2.主要实验试剂

枸杞糖肽(宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司)，6-OHDA(Sigma，H4381)，左旋多巴(Sigma，D9628)，阿扑吗啡(Sigma，A4393)，BCA检测试剂盒，TH抗体(Abcam，ab112)，p-ERK抗体(Proteintech，28733-1-AP)，ERK抗体(Proteintech，11257-1-AP)，Delta FosB抗体(Cell Signaling Technology，14695S)，GAPDH抗体(杭州弗德生物科技有限公司，FD0063)，β-Actin抗体(杭州弗德生物科技有限公司，FD0060)，HRP标记的羊抗兔二抗(杭州弗德生物科技有限公司，FDR007)，HRP标记的羊抗兔二抗(杭州弗德生物科技有限公司，FDR007)。

3.主要实验仪器

小鼠立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，小鼠转棒仪(意大利UgoBasile公司)，高速低温离心机(德国Sartorius公司，A-14C)，化学发光显影仪(Tanon-5200)，电子天平(德国Sartorius公司，BS210)。

二、实验方法和结果

1.LID模型制备

首先使用6-OHDA构建PD模型：小鼠适应性喂养七天后，称重后用1％戊巴比妥钠深度麻醉，用剃毛刀剃去头部毛发并将小鼠固定于脑立体定位仪中，调节左右耳杆使其固定更加稳固。沿着中线切开小鼠头部皮肤露出小鼠脑壳，使用双氧水擦拭充分暴露出前卤(Bregma)和后卤(Lambda)。以前卤味坐标原点，参考《小鼠脑立体定位图谱》，注射坐标位点为AP：+0.3，L：+2.3，DV：-2.9，用颅骨钻小心钻出小孔(避免损伤脑组织)，以0.1μL/min的速度缓慢注射1.5μL的5μg/μL的6-OHDA，注射完毕后留针5min，缓慢回针，进行头皮缝合，完成脑定位注射。注射21天后，腹腔注射APO(0.5mg/kg)诱导小鼠向健侧旋转，检测三次，每次10min，取平均值，筛选旋转次数达70转以上者列为成功模型，其他小鼠被淘汰(图1)。

其次，使用左旋多巴(levodopa)构建LID模型。对上述PD模型每天腹腔注射左旋多巴(7.5mg/kg)，以6-OHDA验证PD造模成功为Day 0，共持续42天。

2.实验分组和体重监测

实验小鼠共分为5组：取8只无处理的小鼠设为空白组(Sham)。将PD造模成功的小鼠随机平均分为4组，每组8只，分别为：6-OHDA组、6-OHDA+levodopa组，6-OHDA+levodopa+LbGp低剂量(30mg/kg，灌胃)组和6-OHDA+levodopa+LbGp高剂量(60mg/kg，灌胃)组。实验流程如图2所示。

体重监测：如图3所示，连续6周的体重数据显示，本实验采用的造模和给药方法对小鼠体重无明显影响。

3.行为学方法及结果：异常不自主运动评分(AIM)

方法说明：AIM评分分为3个部分，包括轴向、肢向和口面部。每次在左旋多巴给药后每30min观察一次，每次观察1min，共持续120min。(1)轴向AIM：颈部上身向损伤对侧扭转运动；(2)肢向AIM：对侧前肢重复性跳动或者肌张力障碍姿势；(3)口面部AIM：空颌运动和对侧舌头突出。根据观察期内运动障碍出现的强度对每个亚型从1-4进行打分，0分：没有出现运动障碍；1分：偶尔出现(小于30s)；2分：经常出现(大于30s)；3分：症状持续存在，给予外界刺激停止；4分：持续存在，刺激也不停止。总AIM评分是将每个观察期各个部分的得分进行累计。

实验结果：根据异常不自主运动评分(AIM)原则，分别评价了枸杞糖肽对左旋多巴诱导的LID的作用，如图4-图7所示，包括轴向AIM评分(图4)、口面部AIM评分(图5)、肢向AIM评分(图6)和AIM总分(图7)。与单独6-OHDA组相比，左旋多巴(levodopa)给药组小鼠在第7天、第21天和第42天的AIM评分均有增加，给药时间越长，AIM评分越高，表明左旋多巴的长期给药诱导了PD模型出现LID行为障碍。低剂量枸杞糖肽(30mg/kg)治疗对于第7天的各项AIM评分的改善作用没有显著性差异，但是低剂量枸杞糖肽(30mg/kg)在第21天和第42天均能显著缓解小鼠的各项AIM评分，同时，高剂量枸杞糖肽(60mg/kg)在第7天、第21天和第42天的AIM评分中与模型组小鼠相比均有显著性差异(^***p<0.001vs.6-OHDA组，^#p<0.05、^##p<0.005、^###p<0.001vs.6-OHDA+levodopa组，ns＝not significant vs.6-OHDA+levodopa组。各组N＝8只小鼠)。以上数据证明枸杞糖肽治疗能改善左旋多巴诱导的LID。

4.病理学方法及结果：Western blotting蛋白免疫印迹

方法说明：在冰上快速取小鼠大脑双侧纹状体，剪取10mg左右的组织于1.5mL EP管中，每个样品加入两颗钢珠，再按照V/W(10μL：1mg)的比例加入预先混好蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液(蛋白酶抑制剂：蛋白裂解液＝1:100，磷酸酶抑制剂：蛋白裂解液＝1:50)，在预冷铅板上将组织匀浆并超声，提取总蛋白。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定样品的蛋白浓度。取30μg蛋白根据目的蛋白分子量在配置好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，接着电转移至PVDF膜中，使用5％脱脂奶粉室温封闭2h；一抗(TH、p-ERK、ERK、GAPDH、β-Actin)4℃冰箱孵育过夜；回收一抗，使用TBST缓冲液洗冲洗，将各条带条孵育上HRP标记的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗，室温孵育2h；TBST缓冲液冲洗，使用ECL显色液在成像系统进行拍照；使用Image J软件分析系统处理结果。

实验结果：酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)是中脑多巴胺合成的限速酶，可作为多巴胺神经元的标志物。与正常组相比，6-OHDA组小鼠纹状体TH的表达显著下降，表明多巴胺能神经元的数量明显减少。左旋多巴不能减少TH的丢失，而枸杞糖肽则能改善TH的丢失，证明枸杞糖肽可以保护多巴胺能神经元，如图8所示(^**p<0.005、^***p<0.001，各组N＝3只小鼠)。LID的发生与Delta FosB密切相关。与6-OHDA组相比，长期给予左旋多巴显著增加了模型小鼠的纹状体Delta FosB的表达，而枸杞糖肽则能显著改善Delta FosB的增加，证明枸杞糖肽可以改善左旋多巴诱导的LID程度，如图9所示(^*p<0.005，各组N＝3只小鼠)。在LID异动症中，磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated proteinkinases，ERK1/2)被激活。与6-OHDA组相比，长期给予左旋多巴增加了p-ERK1/2的表达，即促进了ERK1/2的磷酸化激活，而枸杞糖肽则能显著抑制ERK1/2的磷酸化激活，证明枸杞糖肽可以改善左旋多巴诱导的LID程度，如图10所示(^*p<0.005、^**p<0.005，各组N＝3只小鼠)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.枸杞糖肽在制备预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述帕金森病运动并发症为左旋多巴诱导的。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述帕金森病运动并发症包括运动波动和异动症。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于：所述运动并发症包括轴向、肢向和口面部的异常不自主运动，其中轴向异常不自主运动为颈部上身向损伤对侧扭转运动，肢向异常不自主运动为对侧前肢重复性跳动或者肌张力障碍姿势，口面部异常不自主运动为颌运动和对侧舌头突出。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于：将枸杞糖肽作为左旋多巴的伴侣药物，用于预防或治疗左旋多巴诱导的异动症。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述枸杞糖肽包含以下一种或多种：LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4或LbGp5。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述枸杞糖肽包含LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5，其中LbGp1、LbGp2、LbGp3、LbGp4和LbGp5的质量比为(0.01-0.02)：(0.005-0.01)：(0.01-0.02)：(0.02-0.03)：(0.01-0.02)。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其特征在于：所述枸杞糖肽预防或治疗药物诱导的帕金森病运动并发症的剂量为1-100mg/kg。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其特征在于：所述药物包含枸杞糖肽和药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物的剂型为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂、颗粒剂、注射液、粉针剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂或栓剂。

Images