CN103908567B - 一种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，提供了一种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂及其应用。本发明的复方制剂，各药效成分的重量份为：西洛他唑45～55；甲钴铵 0.9～1.1；知母百合浸膏粉 180～220。本发明还提供了上述复方制剂的制备及制药用途。本发明的复方制剂能用于治疗糖尿病痛性神经病变，不仅疗效佳，副作用小，而且不具有成瘾性。

Description

一种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及一种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂及其应用。

背景技术

全世界有2.4亿糖尿病患者，糖尿病已成为严重危害人类健康的第三大疾病。糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是最常见的糖尿病慢性并发症之一，患病率约为60%左右。DPN起病隐匿，过程缓慢，受累范围广泛，可涉及躯体神经及自主神经。常见症状有麻木、感觉过敏、烧灼样疼痛、电击或针刺样痛、深部肌肉痛和运动障碍等，以下肢多见，夜间加剧，甚至导致足部溃疡、坏疽，以至截肢，严重影响患者的生活质量。

肢体麻木感、针刺样刀割样疼痛、痛觉过敏等主观症状往往是糖尿病神经病变患者就医的首要原因，严重者还可伴有心境和情绪方面的异常，如焦虑和抑郁，后者是影响生活质量的主要因素。有研究发现糖尿病患者发生抑郁症的比例是非糖尿病患者的2倍，约30%的糖尿病患者存在不同程度的抑郁症状，而DPN患者伴抑郁的概率则远高于该比例。日本千叶医科大学开展的一项调查研究显示，合并抑郁症的糖尿病患者比非抑郁患者更有可能出现神经病变，糖尿病的并发症（尤其是神经病变）与糖尿病患者的抑郁独立相关。焦虑、抑郁等情感障碍加重并夸大了糖尿病周围神经病变患者的主观症状，严重影响生活质量，使治疗变得更加棘手。

目前，一些针对糖尿病神经病变发病机理的药物被证实有一定疗效，如前列腺素E等改善微循环药物，西洛他唑等抗血小板聚集等改善神经组织血供药物，甲基维生素B₁₂等改善神经营养药物、新一代醛糖还原酶抑制剂依帕司他，抗氧化剂α-硫辛酸等。然而，对于主观症状较重、伴有焦虑、抑郁等情绪障碍的糖尿病痛性神经病变患者，临床疗效并不理想。现临床上常用于治疗神经痛的药物有以下几种：

中枢性镇痛药物：主要作用于中枢痛觉传导通路的阿片受体，提高疼痛阈值，常见的有曲马多、可待因、美沙酮等，但因具有成瘾性限制了其使用。一般认为在非阿片类药物治疗失败后才考虑应用，或临时应用于间断性剧烈疼痛的患者。

抗抑郁药物如选择性5-HT再摄取抑制剂（SSIs）、5-HT/NE再摄取抑制剂（SNRI）、单胺氧化酶抑制剂（MAOs）和三环类抗抑郁药（TCAs），虽然能收到良好的短期效果，但是由于其严重的嗜睡、抗胆碱能的副作用并不适合患者长期使用。

抗癫痫药物治疗DPN已多年，主要有卡马西平、苯妥英钠、加巴喷丁等，其通过降低神经细胞膜的钠离子通透性，抑制神经细胞多突触传导，从而降低神经元的过度兴奋，恢复膜的稳定性而缓解疼痛，但临床疗效并不理想。

由于副作用大、疗效不佳、具有成瘾性等问题，上述药物并不推荐用于糖尿病周围神经病变的早期治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂及其制备方法与应用。

所述的这种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂及其制备方法要解决现有技术中治疗糖尿病痛性神经病变的药物效果不佳而且又有副作用的技术问题。

本发明提供了一种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂，各药效成分的重量份为：

西洛他唑 45～55

甲钴铵 0.9～1.1

知母百合浸膏粉 180～220

较佳的，所述复方制剂中，各药效成分的重量份为：

西洛他唑 50

甲钴铵 1

知母百合浸膏粉 200

较佳的，所述知母百合浸膏粉为将知母、百合按配比混合后，经水提醇沉、喷雾干燥制得，具体包括如下步骤：

1）水提取：将知母、百合按配比混合后，加水煎煮、收集合并煎煮液、浓缩，得水提取浓缩液，转入固液分离工序；

2）固液分离：将1）中所得水提取浓缩液进行固液分离；

3）醇沉淀：将2）中经固液分离所得水提取浓缩液加适量乙醇水溶液进行沉淀，过滤，得精制液；

4）浓缩：将3）中所得精制液进行水分蒸发浓缩，制备知母百合浸膏；

5）喷雾干燥：将4）中所得知母百合浸膏，经喷雾干燥得知母百合浸膏粉。

更佳的，步骤1）中，所述知母和百合的重量比为1:2。

进一步的，所述的知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides的干燥根茎。

进一步的，所述的百合为百合科多年生草本植物百合Lilium的干燥地下鳞茎。

本发明中，复方制剂的原料配方十分关键，在获知原料药配方后，本技术领域的技术人员即可采用各种常规方式将其混配后作为用于治疗糖尿病痛性神经病变的药物或者生产该类药物的原料。

本发明还提供了上述的复方制剂在制备治疗糖尿病痛性神经病变药物中的应用。

进一步的，本发明的用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂还包括一种或多种常规的药学上可接受的辅料。主药药效成分与药学上可接受载体的总重量比例可为1∶0.1～10。

药学上可接受的辅料包括但并不限于药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括但不限于乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明的复方制剂，可以制备成任何一种药剂学上所说的剂型。

本发明的复方制剂可以制备成口服制剂，如胶囊、片剂、分散片、口含片、咀嚼片、泡腾片、缓释片、颗粒剂等。优选为胶囊。

本发明的复方制剂可采用常规方法制备，如将各有效成分混匀，或者根据各种制剂的常规制法，将药效成分与相应辅料混配后制备获得。本发明的复方制剂物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的复方制剂的有效治疗剂量为：以药效成分的总重量为基准计，口服安全有效量通常为约0.502g药效成分/50千克体重·d。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂具有以下优点：

1.首次发现：一方面，知母百合对西洛他唑甲钴胺改善糖尿病大鼠周围神经病变的作用起到了协同或者增效作用；另一方面，西洛他唑与甲钴胺对知母百合的抗抑郁、抗焦虑作用具有促进作用，也就是说西洛他唑、甲钴胺与知母百合在主观症状的改良上产生了协同或增效作用。

2.当前现有的糖尿病痛性神经病变治疗药物不仅效果不佳，而且副作用较大。本发明采用西洛他唑、甲钴胺、知母、百合作为复方制剂的药效成分治疗糖尿病痛性神经病变，不仅药物效果好而且副作用低，不具有成瘾性。

3.采用本发明的复方制剂，可扩张血管、改善微循环；调整自主神经系统的功能紊乱，消除疼痛诱发的情感障碍，减轻过度的交感神经兴奋以及镇痛、抗焦虑、抑郁治疗，有效缓解症状并改善生活质量和预后。

附图说明

图1为大鼠尾神经神经电生理检查。

图2为大鼠尾神经MCV测定记录结果。

图3表示光镜下（×400）各组小鼠尾神经有髓神经纤维阳性面积测定界面，其中A为正常对照组（NC）；B为糖尿病模型组（DM）；C为知母百合组；D为西甲组；E为复方制剂胶囊小剂量组（CR1）；F为复方制剂胶囊大剂量组（CR2）。

具体实施方式：

本发明承下述基金的资助完成：军队中医药科研专项课题：2010z228；国家自然科学基金青年项目：81100586、81300672；上海市卫生局青年科研项目：20114Y115；上海市卫生局中医药科研基金：2012J002A；上海市科委自然科学基金面上项目：10ZR1439400。

本发明所采用的原料药（或药材）均可从普通医药商店或中药材销售公司购买得到，其规格符合国家医药标准或符合中国药典等有关规定。

本发明的复方制剂可以采用制剂的常规方法制备成任何常规内服制剂，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、软胶囊、丸剂、合剂、糖浆剂、凝胶剂及缓控释制剂等。为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学上可接受的辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂等。

以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

本发明的知母百合浸膏粉为将知母、百合按配比混合后，经水提醇沉、喷雾干燥制得，具体包括如下步骤：

1）水提取：将知母、百合按重量比1:2混合后，加8倍水煎煮2次，每次小时，收集合并两次煎煮液、浓缩，得水提取浓缩液，转入固液分离工序；

2）固液分离：将1）中所得水提取浓缩液采用80目振动筛装置进行固液分离；

3）醇沉淀：将2）中经固液分离所得水提取浓缩液加适量95%乙醇水溶液进行沉淀，过滤，得精制液；

4）浓缩：将3）中所得精制液在薄膜浓缩机上进行水分蒸发浓缩，转到收膏锅内进一步浓缩，收至每ml浓缩液相当于药材6g，得知母百合浸膏；

5）喷雾干燥：将4）中所得知母百合浸膏，经喷雾干燥，进风温度150℃，出风温度145℃，得知母百合浸膏粉。

实施例1复方制剂胶囊制备

表1-1

制备工艺：按照上述配方制备1000粒产品，具体制备方法如下：

按照通常胶囊的操作，按表1-1的配方称取知母百合浸膏粉、西洛他唑、甲钴胺，干法制粒，装入合适胶囊、封口制得1000粒胶囊。

实施例2改善糖尿病大鼠周围神经病变的研究

1、研究目的：观察本发明的复方制剂胶囊对糖尿病大鼠周围神经病变的改善作用。

2、受试药物：由实施例1配方1所制备。

3、动物来源，种属，品系：Sprague-Dawley（SD）大鼠体重：200－240g；性别：雄性；动物总数：55只；购自中国科学院上海实验动物中心。

4、动物造模及分组：所有SD大鼠适应性喂养3天，随机挑选8只SD大鼠作为正常对照组（NC），其余47只SD大鼠用于造模。禁食不禁水12h后，STZ（链脲佐菌素）溶于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.2）配制成浓度为1％的溶液，以60mg/kg剂量单次由腹腔注射，正常对照组（NC）以等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，72小时后尾静脉采血，用ACCU-CHEK快速血糖测定仪（罗氏公司）测血糖，血糖高于16.7mmol/L的大鼠入选糖尿病大鼠模型组。每2周复查血糖，低于16.7mmol/L的大鼠剔除。喂养8周后，共成模40只。将糖尿病大鼠随机分为对照组（DM）、复方制剂胶囊小剂量组（CR1）、大剂量组（CR2）、知母百合组和西甲组，每组8只动物。

5、方法：

（1）药物干预：复方制剂胶囊小剂量组（CR1）和大剂量组（CR2）大鼠每日分别以复方制剂胶囊0.5g/kg和2g/kg加2ml双蒸水配制成的溶液灌胃；知母百合组以实施例所得知母百合浸膏粉788mg/kg加2ml双蒸水配制成的溶液灌胃；西甲组以西洛他唑348mg/kg+甲钴胺29mg/kg加2ml双蒸水配制成的溶液灌胃；正常对照组（NC）及糖尿病模型对照组（DM）给予等剂量的双蒸水灌胃。每日一次。

（2）神经电生理指标测定：药物干预16周后，用10％水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉，固定于平板上，使用DANTEC Cantata肌电图诱发电位仪采用单极针电极近神经法测定各组大鼠尾神经电生理指标。

（3）运动神经传导速度（MCV）、潜伏期及波幅的测定：如图1所示，刺激电极阴极（红色）置于尾神经远端、阳极（白色）置于近端，两者相距1cm；记录电极（红色）置于鼠尾末端近端，与刺激电极阴极相距14cm，参考电极（白色）置于鼠尾末端远端，两者相距1cm；接地（黄色）置于刺激电极与记录电极之间，逐渐增加刺激强度（3～6mA），使记录到的神经动作电位达到最大。运动神经传导速度（m/s）＝记录电极与刺激电极阴极间距离（14cm）×10/潜伏期（ms），波幅测定取峰-峰值，如图2。

（4）感觉神经传导速度（SCV）、潜伏期及波幅的测定：电极放置：将测MCV时的记录电极与刺激电极互换，刺激强度固定于1.2mA，感觉神经传导速度（m/s）＝记录电极与刺激电极阴极间距离（14cm）×10/潜伏期（ms）。

（5）标本收集：用药16周并完成神经电生理指标测定后，立即处死大鼠，钝性分离暴露出尾神经，截取长约1cm的尾神经中段放入甲醛溶液固定。

（6）病理观察及图像分析：尾神经标本行Weil铁明矾苏木精染色，光镜下观察，运用IMS病理图像分析系统测定各组尾神经病理标本有髓神经纤维阳性面积、有髓神经纤维髓鞘及轴突面积。

（7）统计学处理：实验结果以x±s表示，用SAS软件进行组间方差分析，P＜0.05为差异有显著性意义。

6、结果：

（1）各组大鼠运动神经电生理指标的变化：结果见表2-1。

糖尿病模型组（DM）与正常对照组（NC）比较，运动神经传导潜伏期延长（P＜0.01），MCV减慢（P＜0.01），电位波幅下降（P＜0.05）。知母百合治疗组运动神经传导潜伏期、MCV以及电位波幅较糖尿病模型组（DM）改善不显著。西甲治疗组运动神经传导潜伏期、MCV以及电位波幅较糖尿病模型组（DM）均有显著性改善（P＜0.05）。复方制剂小剂量、大剂量治疗组运动神经传导潜伏期、MCV以及电位波幅较糖尿病模型组（DM）均有显著性改善（P＜0.05）。大、小剂量治疗组之间上述3项神经电生理指标无统计学差异（P＞0.05），但是效果均优于西甲组。

表2-116周后各组大鼠运动神经传导指标比较（n=8，x±s）

NC：正常对照组；DM:糖尿病模型组；CR₁：复方制剂胶囊小剂量组；CR₂：复方制剂胶囊大剂量组；MCV：运动神经传导速度；*P<0.05vs NC；**P<0.01vs NC；^△P<0.05vs DM。

（2）各组大鼠感觉神经电生理指标的变化：结果见表2-2。

与运动神经检测结果类似，糖尿病模型组（DM）与正常对照组（NC）比较，感觉神经的传导潜伏期延长（P＜0.001），SCV减慢（P＜0.001），电位波幅下降（P＜0.05）；知母百合治疗组感觉神经传导潜伏期、SCV以及电位波幅较模型组未出现显著性改善、基本无效。西甲治疗组复方制剂大、小剂量治疗组感觉神经传导潜伏期、SCV以及电位波幅较模型组（DM）均有显著性改善（P＜0.05）。复方制剂大、小剂量治疗组感觉神经传导潜伏期、SCV以及电位波幅较糖尿病模型组（DM）均有显著性改善（P＜0.001，P＜0.05），电位波幅与正常对照组比较也无统计学差异（P＞0.05）；但与运动神经检测结果不同的是，大、小剂量治疗组之间感觉神经传导潜伏期、SCV均有统计学差异（P＜0.05），其中大剂量组上述两项指标均接近正常对照组，差异无统计学意义（P＞0.05），而小剂量治疗组感觉神经传导潜伏期仍较正常对照组延长（P＜0.05），SCV也较对照组减慢（P＜0.05）。但是，复方制剂大、小剂量治疗组的感觉神经传导潜伏期、SCV以及电位波幅改善效果均优于西甲组。

表2-216周后各组大鼠感觉神经传导指标比较（n=8,x±s）

SCV：感觉神经传导速度；*P<0.05vs NC，**P<0.001vs NC；^△P<0.05,^△△P<0.001vsDM；^▲P<0.05vs CR1

（3）各组大鼠的神经病理检查结果

光镜观察结果如图3所示，与正常对照组（NC）比较，其他各组动物均有不同程度的脱髓鞘、轴突萎缩变性以及有髓神经纤维密度减小等周围神经病理改变，以模型组（DM）最为显著。图像定量分析结果（表3-3）显示，模型组（DM）有髓神经纤维阳性面积较正常对照组（NC）明显减少（P＜0.0001）；知母百合治疗组有髓神经纤维阳性面积较模型组（DM）未有显著性改善，基本无效。西甲治疗组有髓神经纤维阳性面积较模型组（DM）显著增加（P＜0.0001）。复方制剂大、小剂量治疗组有髓神经纤维阳性面积较模型组（DM）均显著增加（P＜0.0001），大剂量治疗组（CR2）与正常对照组（NC）比较无统计学差异（P＞0.05），小剂量治疗组（CR1）仍低于正常对照组水平（P＜0.0001），大、小剂量治疗组之间差异也有统计学意义（P＜0.0001）。但是复方制剂大、小剂量治疗组的有髓神经纤维阳性面积改善效果均优于西甲组。

病理图像定量分析结果（表2-3）还显示，模型组（DM）与正常对照组（NC）比较，有髓纤维髓鞘面积和轴突面积均显著减小（P＜0.0001，P＜0.01）；知母百合治疗组有髓纤维髓鞘面积较模型组（DM）未出现明显改善，基本无效。西甲治疗组有髓纤维髓鞘面积较模型组（DM）显著增加（P＜0.01）。复方制剂大、小剂量治疗组有髓纤维髓鞘面积较模型组（DM）均显著增加（P＜0.0001，P＜0.01），但仍低于正常对照组水平（P＜0.05），且小剂量治疗组又少于大剂量治疗组（P＜0.05）；大、小剂量治疗组有髓纤维轴突面积较模型组也有显著增加（P＜0.01），但不同剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05）。但是，复方制剂大、小剂量治疗组有髓纤维髓鞘面积改善效果均优于西甲组。

表2-316周后各组大鼠有髓神经纤维阳性面积、髓鞘面积、轴突面积比较（x±s，A/μm²）

a:Visual fields observed；b:Fibers observed；*P<0.05，**P<0.01,***P<0.0001vs NC;

^△△P<0.01,^△△△P<0.0001vs DM;^▲P<0.05,^▲▲▲P<0.0001vs CR1group

7、结论

（1）糖尿病模型组（DM）与正常组（NC）相比，糖尿病大鼠存在明显的脱髓鞘、轴突萎缩变性以及有髓神经纤维密度减小等周围神经病理学改变，电生理检查表现为神经传导潜伏期延长，电位波幅下降，MCV、SCV减慢。

（2）经药物干预后，知母百合治疗组与糖尿病模型组（DM）比较，MCV、SCV、神经传导潜伏期以及电位波幅未出现明显改善，有髓神经纤维阳性面积与髓鞘面积和轴突面积也没有显著增加，基本无效。

（3）经药物干预后，西甲治疗组与糖尿病模型组（DM）比较，MCV、SCV、神经传导潜伏期以及电位波幅均有改善，有髓神经纤维阳性面积增加，其中髓鞘面积和轴突面积均显著增加，该结果从电生理学和神经病理两方面说明西甲组对糖尿病大鼠周围神经病变有改善作用。

（4）复方制剂胶囊大、小剂量组与糖尿病模型组（DM）比较，MCV、SCV、神经传导潜伏期以及电位波幅均有改善，有髓神经纤维阳性面积增加，其中髓鞘面积和轴突面积均显著增加，该结果从电生理学和神经病理两方面说明复方制剂胶囊对糖尿病大鼠周围神经病变有改善作用，并且其改善作用要优于西甲组。

（3）复方制剂大剂量组与小剂量组相比，有髓纤维阳性面积、髓鞘面积增大有显著性，说明有髓纤维阳性面积、髓鞘面积这两项指标可以反映复方制剂胶囊治疗剂量增加导致的病理变化的改善，因此我们认为复方制剂胶囊对DPN的疗效在这两项指标上具有剂量依赖性。

（4）本研究用复方制剂胶囊治疗糖尿病大鼠周围神经病变，周围神经电生理及病理定量指标均显著改善，其中有髓纤维阳性面积、髓鞘面积的改善均与剂量呈正相关，说明复方制剂胶囊有效保护了糖尿病大鼠的周围神经，对于DPN有较好的治疗作用，早期足量应用效果更佳。并且通过对比试验，说明复方制剂胶囊中的知母、百合对西洛他唑、甲钴胺改善糖尿病大鼠周围神经病变的作用起到了协同或者增效作用。

实施例3对糖尿病小鼠焦虑抑郁缓解作用的研究

1、研究目的：观察本发明的复方制剂胶囊对糖尿病小鼠焦虑抑郁的缓解作用。

2、受试药物：由实施例1中配方1所制备

3、动物：来源，种属，品系：清洁级雄性ICR小鼠体重：18－20g；性别：雄性；动物总数：120只；购自上海SIPPR-BK实验动物有限公司。

4、动物分组及给药：

所有小鼠适应性喂养3天，随机挑选12只小鼠作为正常对照组（NC），其余小鼠用于造模。禁食不禁水12h后，STZ（链脲佐菌素）溶于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.2）配制成浓度为1％的溶液，以60mg/kg剂量单次由腹腔注射，正常对照组（NC）以等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，72小时后尾静脉采血，用ACCU-CHEK快速血糖测定仪（罗氏公司）测血糖，血糖高于16.7mmol/L的小鼠入选糖尿病模型组。

将不同药物按照下述浓度配成CMC混合液，给药容积为0.2ml/10g。

每天上午相同时间点灌胃给药一次，连续给药7天。于末次给药后1小时，开始进行实验。实验中用视频观察动物的活动表现。正式实验前先进行预实验，让动物适应实验环境1次，第二天再进行正式实验。

实验期间，保持动物房室温在22℃左右，相对湿度70％左右，保持房间安静。

将动物随机分为以下10组，每组12只，每组具体给药情况如下：

（1）正常对照组：饮用水，0.2ml/10g；

（2）糖尿病模型阴性对照组：饮用水，0.2ml/10g；

（3）糖尿病模型阳性对照组：氟西汀混合液（112mg/kg）或安定注射液（2.0mg/kg）（即地西泮组）；

（4）知母百合组（共分为3小组）：每组给予不同浓度的知母百合浸膏粉（由实施例1制备）：

知百1组：394mg/kg，n=12；

知百2组：788mg/kg，n=12；

知百3组：1970mg/kg，n=12。

（5）复方制剂胶囊组：

为实施例1中所制备

复方制剂胶囊小剂量组（相当于临床剂量）：简称复方制剂1组，给予464mg/kg复方制剂胶囊：含西洛他唑69.6mg/kg；甲钴胺5.8mg/kg；知母百合浸膏粉394mg/kg；

复方制剂胶囊中剂量组（相当于临床剂量2倍）：简称复方制剂2组，给予928mg/kg复方制剂胶囊：含西洛他唑139.2mg/kg；甲钴胺11.6mg/kg；知母百合浸膏粉788mg/kg；

复方制剂胶囊大剂量组（相当于临床剂量5倍）：简称复方制剂3组，给予2320mg/kg复方制剂胶囊：含西洛他唑348mg/kg＋甲钴胺29mg/Kg＋知母百合浓浸膏粉1970mg/kg；

（6）西甲组：给予西洛他唑348mg/kg＋甲钴胺29mg/kg。

5、方法：

（1）悬尾实验：将小鼠尾（在距尾尖1cm处）用胶布粘在高出桌面5cm的木条上，使其呈倒立状态，四周以板隔离小鼠视线。小鼠为了克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时间后出现不动，显示失望状态。记录6min内小鼠的不动时间为失望时间（记录时以持续3s以上为有效失望时间）。

（2）强迫游泳实验：动物放置在透明的有机玻璃的圆柱体内（20cm高×12cm直径），水深15cm，水温23-25℃。在正式24h实验前先将每只动物放在圆柱体内15min。观察5分钟内动物身体保持不动时间，不动的判断标准为动物除了头部的轻微运动外，身体保持不动，不再尝试从水中挣脱。

（3）升高十字迷宫实验：实验时每只动物放置在升高十字迷宫的中央，面对着闭合臂。计算5min内动物进入开放臂的次数和滞留开放臂的总时间。动物滞留臂的状态通过动物四肢是否完全在臂内判断。每只动物实验结束后用10%酒精溶液仔细清洗实验装置。

（4）开场实验：开场实验用于研究动物探究活性。评价的指标为5min内通过中央格子的次数（判断标准为以完全四肢进入格子）。每只动物实验结束后用10%酒精溶液仔细清洗实验装置。

（5）明暗穿箱实验：实验开始时每只动物放置在明室的中央面对着暗室。记录5min内的动物出于暗室和明室的总时间，以及进入各室的次数。每只动物实验结束后用10%酒精溶液仔细清洗实验装置。

（6）统计学方法：检测数据以均数±标准差(x±S)表示，各组均数间差别比较采用单向方差分析，各组均数间差别的多重比较采用Dunne t检验，以α＝0.05作为检验标准。SPSS10.0统计软件处理数据。

6、结果

（1）抗抑郁作用

1）悬尾实验的小鼠不动时间结果如表3-1所示。

糖尿病模型组小鼠较正常对照组悬尾实验的不动时间显著延长（P＜0.05）。与阴性对照组相比，知百1组、知百2组、知百3组、复方制剂1组，复方制剂2组及复方制剂3组的不动时间均明显缩短（P<0.05），而各组的不动时间与阳性对照组（氟西汀组）相比无显著性差异（P>0.05），同时各组之间的不动时间也无显著性差异（P>0.05）。西甲组与阴性对照组相比无显著性差异（P>0.05），但复方制剂各组与知百各组的不动时间平均缩短效果更优。

表3-1复方制剂胶囊急性给药对悬尾实验中小鼠不动时间的影响（x±S,n=12）

*与阴性对照组比较P<0.05；^△与正常对照组比较P<0.05

2）小鼠强迫游泳实验的不动时间结果表3-2所示。

糖尿病模型组小鼠较正常对照组强迫游泳实验不动时间显著延长（P＜0.05）。与阴性对照组相比，知百1组、知百2组、知百3组、复方制剂1组，复方制剂2组及复方制剂3组的不动时间均明显缩短（P<0.05），而各组的不动时间与阳性对照组（氟西汀组相）相比无显著性差异（P>0.05），同时各组之间的不动时间也无显著性差异（P>0.05）。西甲组与阴性对照组相比无显著性差异（P>0.05），但复方制剂各组与知百各组的不动时间平均缩短效果更优。

表3-2复方制剂胶囊急性给药对小鼠强迫游泳实验不动时间的影响（x±S,n=12）

*与阴性对照组比较P<0.05；^△与正常对照组比较P<0.05

（2）抗焦虑作用

1）小鼠升高十字迷宫实验结果如表3-3所示

在升高十字实验中，糖尿病模型组小鼠较正常对照组进入开放臂的次数和滞留时间均显著减少（P＜0.05）。与阴性对照组相比，知百1组、知百2组、知百3组、复方制剂1组，复方制剂2组和复方制剂3组的进入开放臂的次数（open-arms entries，OE），滞留开放臂的时间（open-arms time，OT），均明显增加（P<0.05），而三组的OE、OT与地西泮组相比无显著性差异（P>0.05），同时复方制剂各剂量组比知百各剂量组组之间的OE、OT改善效果更优。

表3-3复方制剂胶囊急性给药对升高十字迷宫实验小鼠焦虑状态的影响（x±S,n=12）

*与阴性对照组比较P<0.05，^△与正常对照组比较P<0.05，OE：进入开放臂的次数；OT：滞留开放臂的时间

2）小鼠开场实验结果如表3-4所示

在开场实验中，糖尿病模型组小鼠较正常对照组跨越中央的次数显著减少（P＜0.05）。与阴性对照组相比，知百1组、知百2组、知百3组、复方制剂1组，复方制剂2组和复方制剂3组的穿越中央的次数均明显增加（P<0.05），而知母各组和复方制剂各组与地西泮组相比无显著性差异（P>0.05），同时复方制剂各剂量组比知百各剂量组之间的穿越中央的次数改善效果更优。

表3-4复方制剂胶囊急性给药对开场实验中小鼠焦虑状态的影响（x±S,n=12）

*与对照组比较P<0.05，^△与正常对照组比较P<0.05

3）小鼠明暗穿箱实验结果如表3-5所示

在明暗穿箱实验中，糖尿病模型组小鼠较正常对照组跨越中央的次数显著减少，滞留明室的时间显著缩短（P＜0.05）。与阴性对照组相比知百1组、知百2组及知百3组的跨室次数及滞留滞留明室的时间均明显增加（P<0.05），而知百三组的跨室次数及滞留滞留明室的时间与地西泮组相比无显著性差异（P>0.05），同时知百三组之间的跨室次数及滞留明室的时间相比较无显著性差异（P>0.05）。表3-5复方制剂胶囊急性给药对明暗穿箱实验中小鼠焦虑状态的影响（x±S,n=12）

*与对照组比较P<0.05，^△与正常对照组比较P<0.05

6、结论

通过小鼠的悬尾实验、强迫游泳实验证实：西洛他唑与甲钴胺均无明显抗抑郁作用，知母百合和复方制剂胶囊具有明显的抗抑郁作用，并且复方制剂的抗抑郁效果优于知母百合。

通过小鼠的高架十字迷宫、开场实验和明暗穿箱实验证实：西洛他唑与甲钴胺无明显抗焦虑作用，知母百合和复方制剂胶囊具有明显的抗焦虑作用，而且复方制剂的抗焦虑效果优于知母百合。

因此，通过上述实验说明，西洛他唑与甲钴胺对知母百合的抗抑郁、抗焦虑作用具有促进作用，说明西洛他唑、甲钴胺与知母百合在主观症状的改良上产生了协同或增效作用。

实施例4对ICR小鼠急性毒性试验

1、试验目的：根据《化学药物急性毒性研究指导原则》，用小鼠进行急性毒性试验，观察复方制剂胶囊灌胃（ig）给药对ICR小鼠的急性毒性反应及死亡情况，了解毒性损害可逆与否。

2、试验方法：40只小鼠雌雄分别按体重随机分为2组进行急性毒性观察，给药当日上、下午各给药1次，最大给药浓度0.25g/ml，最大给药容积50ml/kg，单次给药剂量12.5g/kg，总给药量25.0g/kg；溶媒对照组ig给予0.5%CMC-Na溶液，给药容积均为50ml/kg。给药后观察期14天。具体方法如下：

（1）供试品及溶媒

1）供试品：由实施例1配方1制备

2）溶媒：

溶媒1：名称：CMC-Na；配制方法：用去离子水配制成0.5%CMC-Na溶液。

溶媒2：名称：去离子水，本中心通过全自动超纯水机制备。

3）供试品配制方法：用溶媒配制成所需浓度。

（2）试验动物

1）种系、质量：ICR小鼠，SPF级；

2）来源：由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；

3）试验用动物数：40只；雌雄各半；

4）试验开始时年龄：4～7周龄；

5）试验开始时体重：♀：18.0～20.6g，♂：18.4～21.8g。

（3）实验动物饲养、管理的环境条件

1）环境条件

动物饲养室级别：SPF级；

饲养房间温湿度：温度：20.7～22.5℃，湿度：52.9～58.0％；

换气次数：20次以上/小时；

照明时间：12小时/天；

清扫及消毒：全部作业结束后清扫，而后由动物管理室进行消毒。用爱尔施牌消毒片、84消毒液和新洁尔灭进行轮换消毒，每周一次轮流交换消毒液种类。

2）饲养条件

饲养鼠盒种类：PC聚碳酸酯鼠盒(L×W×H：320×200×130mm)，底铺垫料；

饲养密度：实验时将鼠盒放在小鼠笼架上饲养；

每盒/笼动物数：检疫期：5～6只/盒，试验期：5只/盒；给药后，动物发生死亡，则按剂量组实际存活动物数雌雄分别饲养，每盒不超过5只；

给饲料方法：持续供给，不限量自由摄取；

给水方法：饮水瓶不间断供水，自由摄取；

小鼠鼠盒更换频度：3次/周。

（4）试验方法

1）给药途径及方法

灌胃（ig）给药，灌胃针头孔径规格8号，实验给药前12～14小时禁饲供水，两次给药期间禁饲供水。

2）剂量设计及理由

根据预试，动物对本发明的复方制剂胶囊有很好的耐受，故给药当日上、下午各给药1次，最大给药浓度0.25g/ml，最大给药容积50ml/kg、单次给药剂量12.5g/kg，总给药量25.0g/kg；溶媒对照组ig给予0.5%CMC-Na去离子水溶液，给药容积50ml/kg。

3）供试品配制方法

称取供试品25g加溶媒配至100ml

4）供试品配制后含量测定：供试品配制后含量测定结果见表4-1。

表4-1供试品配制后含量测定结果

标示浓度（g/ml）	上层	中层	下层	范围	结论
						0.25	95.00%	94.40%	102.20%	小于±15%	符合要求

5）给药的时间、频度

给药频度为2次/天，2次间隔4～6小时。

6）给药途径、频度及时程的选择理由

临床给药途径为口服给药，根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》要求，及考虑啮齿类动物的特殊性，故选择灌胃给药，以提高供试品的吸收速度和吸收率，为安全性评价提供更为确切的信息。给药频度为24小时内2次给药。

（5）试验操作、检查和测定

1）一般症状的观察

观察时程和次数：从购入动物日到实验结束每日观察，给药当日给药后密切观察，以后每天上、下午各观察一次，给药后连续观察14天。

观察例数：全部动物

观察方法：隔笼观察

观察内容：从以下几个方面观察动物的一般状态有无异常

行动相关：

姿势：横卧、俯卧、斜向、歪头

步态：麻痹症、弛缓性、痉挛型、失调性、跛行

状态：兴奋、抑制

外观相关：

营养状态：肥满(肥胖)、良好、消瘦、恶液质

被毛：光泽、粗毛、脱毛、竖毛

眼：眼结膜、色(苍色、赤色、贫血、充血)，干燥度、混浊、眼漏(浆液性、粘液性、脓性、出血性)

口：口腔，牙齿，色，流涎，牙齿异常鼻：鼻腔，色，鼻漏

耳：色，外伤，炎症，分泌

四肢：外伤，浮肿，发赤，紫绀，爪异常

外阴伤：发赤，肿胀，恶露，分泌物，出血，污物

功能相关：

呼吸：呼吸频率，均匀度，缓慢，不规则，呼吸困难，咳嗽

反射：声反射、光反射

尿：色

粪：色、下痢等

2）体重测定

测定次数：检疫观察期开始（购入日），检疫观察期结束（实验分组、给药前），给药后d1，d7，d14各测定1次体重。

例数：全部动物

测定方法：用电子天平进行体重测定。

3）分组方法

健康小鼠40只，雌雄分别按体重随机分成2组，每组20只，雌雄各半。

4）观察指标

观察动物给药后的毒性反应及死亡情况。毒性反应重点观察症状、程度，毒性反应起始时间、持续时间及恢复时间等。

5）观察期

给药后观察14天。

（6）数据处理

急性毒性试验时直接求得最大耐受量MTD。

3、试验结果：复方制剂胶囊小鼠灌胃给药25.0g/kg剂量后动物未见明显异常。溶媒对照组给药后未见明显异常。动物d1、d7及d14体重均有增加，且增长幅度与溶媒对照组相近。d14时小鼠处死后经剖检肉眼观察未见异常。

4、试验结论：复方制剂胶囊灌胃给药对小鼠的MTD＞25.0g/kg。

表4-2复方制剂胶囊灌胃（ig）给药对ICR小鼠急性毒性试验的体重影响

实施例5对SD大鼠急性毒性试验

1、试验目的：根据《化学药物急性毒性研究指导原则》，观察复方制剂胶囊灌胃（ig）对SD大鼠可能产生的急性毒性反应及死亡情况，了解毒性损害可逆与否。

2、试验方法：40只大鼠雌雄分别按体重随机分为2组进行急性毒性观察，给药当日上、下午各给药1次，最大给药浓度0.25g/ml，最大给药容积20ml/kg，单次给药剂量5g/kg，总给药量10g/kg；溶媒对照组ig给予0.5%CMC-Na溶液，给药容积均为20ml/kg。给药后观察期14天。具体方法如下：

（1）供试品及溶媒

1）供试品：由实施例1配方1制备

2）溶媒

溶媒1：名称：CMC-Na；配制方法：用去离子水配制成0.5%CMC-Na溶液。

溶媒2：名称：去离子水，本中心通过全自动超纯水机制备。

3）供试品配制方法：用溶媒配制成所需浓度。

（2）试验动物

1）种系、质量：SD大鼠，SPF级；

2）来源：由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；

3）试验用动物数：40只；雌雄各半；

4）试验开始时年龄：6～8周龄；

5）试验开始时体重：♀：122.6～142.9g，♂：130.4～162.4g。

（3）实验动物饲养、管理的环境条件

1）环境条件

动物饲养室级别：SPF级；

饲养房间温湿度：温度：22.0～24.1℃，湿度：51.8～57.0％；

换气次数：20次以上/小时；

照明时间：12小时/天；

清扫及消毒：全部作业结束后清扫，而后由动物管理室进行消毒。用爱尔施牌消毒片、84消毒液和新洁尔灭进行轮换消毒，每周一次轮流交换消毒液种类。

2）饲养条件

饲养鼠笼种类：不锈钢金属笼鼠笼(L×W×H：300×400×210mm)；

饲养密度：实验时将鼠笼放在大鼠笼架上饲养；

每盒/笼动物数：检疫期：5～6只/笼，试验期：5只/笼；给药后，如动物发生死亡，则按剂量组实际存活动物数雌雄分别饲养，每笼不超过5只；

给饲料方法：持续供给，不限量自由摄取；

给水方法：饮水瓶不间断供水，自由摄取；

大鼠托盘更换频度：1次/2天。

3）剂量设计及理由

根据预试，动物对复方制剂胶囊有很好的耐受，故给药当日上、下午各给药1次，最大给药浓度0.25g/ml，最大给药容积20ml/kg、单次给药剂量5g/kg，总给药量10g/kg；溶媒对照组ig给予0.5%CMC-Na溶液，给药容积20ml/kg。

4）供试品配制方法

称取供试品50g加溶媒配至200ml

5）供试品配制后含量测定：供试品配制后含量测定结果见表5-1。

表5-1供试品配制后含量测定结果

标示浓度（g/ml）	上层	中层	下层	范围	结论
						0.25	95.00%	94.40%	102.20%	小于±15%	符合要求

6）给药的时间、频度

给药频度为2次/天，2次间隔4～6小时。

7）给药途径、频度及时程的选择理由

临床给药途径为口服给药，根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》要求，及考虑啮齿类动物的特殊性，故选择灌胃给药，以提高供试品的吸收速度和吸收率，为安全性评价提供更为确切的信息。给药频度为24小时内2次给药。

（4）试验操作、检查和测定

1）一般症状的观察

观察时程和次数：从购入动物日到实验结束每日观察，给药当日给药后密切观察，以后每天上、下午各观察一次，给药后连续观察14天。

观察例数：全部动物

观察方法：隔笼观察

观察内容：从以下几个方面观察动物的一般状态有无异常

行动相关：

姿势：横卧、俯卧、斜向、歪头

步态：麻痹症、弛缓性、痉挛型、失调性、跛行

状态：兴奋、抑制

外观相关：

营养状态：肥满(肥胖)、良好、消瘦、恶液质

被毛：光泽、粗毛、脱毛、竖毛

眼：眼结膜、色(苍色、赤色、贫血、充血)，干燥度、混浊、眼漏(浆液性、粘液性、脓性、出血性)

口：口腔，牙齿，色，流涎，牙齿异常鼻：鼻腔，色，鼻漏

耳：色，外伤，炎症，分泌

四肢：外伤，浮肿，发赤，紫绀，爪异常

外阴伤：发赤，肿胀，恶露，分泌物，出血，污物

功能相关：

呼吸：呼吸频率，均匀度，缓慢，不规则，呼吸困难，咳嗽

反射：声反射、光反射

尿：色

粪：色、下痢等

2）体重测定

测定次数：检疫观察期开始（购入日），检疫观察期结束（实验分组、给药前），给药后d1，d7，d14各测定1次体重。

例数：全部动物

测定方法：用电子天平进行体重测定。

3）分组方法

健康大鼠40只，雌雄分别按体重随机分成2组，每组20只，雌雄各半。

4）观察指标

观察动物给药后的毒性反应及死亡情况。毒性反应重点观察症状、程度，毒性反应起始时间、持续时间及恢复时间等。

5）观察期

给药后观察14天。

（5）数据处理

急性毒性试验时直接求得MTD。

3、试验结果：复方制剂胶囊大鼠灌胃给药10g/kg剂量后动物未见明显异常。溶媒对照组给药后未见明显异常。动物d1、d7及d14体重均有增加，且增长幅度与溶媒对照组相近。d14时大鼠处死后经剖检肉眼观察未见异常。

表5-2复方制剂胶囊灌胃（ig）给药对SD大鼠急性毒性试验的体重影响

4、试验结论：复方制剂胶囊灌胃给药对大鼠的MTD＞10g/kg。

Claims (10)

1.一种用于治疗糖尿病痛性神经病变的复方制剂，各药效成分的重量份为：

西洛他唑 45～55

甲钴铵 0.9～1.1

知母百合浸膏粉 180～220；

所述知母百合浸膏粉的制备方法为：将知母、百合按配比混合后，经水提醇沉、喷雾干燥获得知母百合浸膏粉；所述的知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides的干燥根茎；所述的百合为百合科多年生草本植物百合Lilium的干燥地下鳞茎。

2.如权利要求1所述的复方制剂，各药效成分的重量份为：

西洛他唑 50

甲钴铵 1

知母百合浸膏粉 200。

3.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，所述知母百合浸膏粉的制备方法，具体包括如下步骤：

1)水提取：将知母、百合按配比混合后，加水煎煮、收集合并煎煮液、浓缩，得水提取浓缩液，转入固液分离工序；

2)固液分离：将1)中所得水提取浓缩液进行固液分离；

3)醇沉淀：将2)中经固液分离所得水提取浓缩液加适量乙醇水溶液进行沉淀，过滤，得精制液；

4)浓缩：将3)中所得精制液进行水分蒸发浓缩，制备知母百合浸膏；

5)喷雾干燥：将4)中所得知母百合浸膏，经喷雾干燥得知母百合浸膏粉。

4.如权利要求3所述的复方制剂，其特征在于，所述知母和百合的重量比为1:2。

5.如权利要求1-4任一项权利要求所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂还包括一种或多种常规的药学上可接受的辅料。

6.如权利要求5所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂中，主药药效成分与药学上可接受载体的重量比例为1∶0.1～10。

7.如权利要求1所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂为口服制剂。

8.如权利要求7所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂为胶囊。

9.如权利要求1-8任一项权利要求所述的复方制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为将各有效成分按配比混匀或根据各种制剂的常规制法将药效成分与相应辅料混配。

10.如权利要求1-8任一项权利要求所述的复方制剂在制备治疗糖尿病痛性神经病变药物中的应用。