CN102600371B - 一种预防帕金森病的中药组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种预防帕金森病的中药组合物，它是由下列重量份的原料药制成：天麻10-22份、黄芪10-23份、熟地黄10-25份、白芍药10-32份、当归10-28份、钩藤15-25份。本发明还涉及上述中药组合物在制备预防帕金森病中的用途。本发明的优点在于：本发明的中药组合物其配伍符合中药“君臣佐使”原则，从病原根本入手，对症下药，辅助预防帕金森病疗效确切；由纯中药制成，具有无毒副作用、价格低等优点，易于被患者接受；药味数目少，原材料丰富，制备工艺简单，对环境友好，在预防帕金森病中有良好的应用前景。

Description

一种预防帕金森病的中药组合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种预防帕金森病的中药组合物及其用途，具体地说，是以中草药为原料制备的中成药。

背景技术

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中老年人常见的神经系统退行性疾患，主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。中医认为PD属于“颤证”，多发生于中老年“天癸”竭時，“天癸”竭表征肾精匮乏，荣卫双虚，上不养肝木，外不濡筋脉，水不涵木则阴虚阳亢、心悸、汗出、潮热、烦躁频发；筋脉失柔现晨僵、四肢拘挛、震颤、强直、疼痛、运动迟缓。综观历代医家的经验，旁及现代医学研究，通过临证观察，我们认为，治以益气化痰、柔肝熄风法。益气补肾以消痰浊，柔肝善阴平定震颤。

经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的预防帕金森病药物。但左旋多巴长期应用3-5年后，大约5%的PD患者会逐渐产生症状波动和（或）运动障碍等左旋多巴的“长期综合征”，即PD运动并发症，加之实验室发现高浓度多巴胺（dopamine，DA）和左旋多巴会由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死，因此，联合其他药物共同预防PD运动并发症十分迫切。

近年研究表明，PD发生与表达D1受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32（dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000，DARPP-32）的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了运动并发症的发病。

目前在PD运动并发症的预防方面，主要采用COMT抑制剂、金刚烷胺、DR激动剂、L-dopa甲酯或乙酯等。如中国专利文献CN 200880108979.7，公布日2010年8月18日，公开了一种“用于改善帕金森病的运动并发症或精神症状的药剂”，所述的药剂具有5-羟色胺1A受体部分激动剂作用，同时对多巴胺D3受体具有激动剂作用，对于在反复给药左旋多巴时伴随产生的运动并发症具有改善和延迟发病的效果。但是西药预防副作用较大，不如中药预防安全可靠。我国在中医药预防PD方面积累了丰富经验，总结其预防原则有益气活血法，育阴潜阳法，平肝熄风法，揉筋熄风法，活血化瘀法和通络熄风等法则，用于预防PD的中药组合物也有多种，但是关于预防PD运动并发症的中药组合物却很少，如中国期刊《中华中医药杂志》，2011年6月第26卷第6期，刊出的“补肾活血颗粒预防帕金森病运动并发症临床研究”，公开了补肾活血颗粒可以改善PD患者运动并发症症状，但是并未充分公开所述的补肾活血颗粒的药物组成和配比。因此，必须积极探索能有效预防帕金森病运动并发症、安全可靠的药物，但是目前关于这类药物还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种预防帕金森病的中药组合物。

本发明的再一的目的是，提供一种上述中药组合物的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种预防帕金森病的中药组合物，它是由下列重量份的原料药制成：天麻10-22份、黄芪10-23份、熟地黄10-25份、白芍药10-32份、当归10-28份、钩藤15-25份。

所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成：天麻12-18份、黄芪13-18份、熟地黄13-18份、白芍药16-26份、当归12-18份、钩藤18-22份。

所述的中药组合物是由下列重量份的原料药制成：天麻18份、黄芪18份、熟地黄18份、白芍药22份、当归16份、钩藤20份。

所述的中药组合物的药剂是片剂、胶囊剂、颗粒、口服液、合剂或糖浆剂。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的中药组合物在制备预防帕金森病药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明的中药组合物其配伍符合中药“君臣佐使”原则，遵循“益气化痰、柔肝熄风法”的治疗方法，从病原根本入手，对症下药，辅助预防帕金森病效果明显；

2、本发明的中药组合物由纯中药制成，具有无毒副作用、价格低等优点，易于被患者接受；

3、本发明的中药组合物药味数少，原材料丰富，制备工艺简单，对环境友好，在预防帕金森病中有良好的应用前景。

附图说明

附图1是中药组合物对PD大鼠模型AIM总分的影响。

附图2是中药组合物对PD大鼠模型剂峰旋转次数的影响。

附图3是PD大鼠模型纹状体区GRK6的免疫组化图。

附图4是PD大鼠模型纹状体区GRK6的免疫组化柱状图。

附图5是PD大鼠模型纹状体区GRK6表达的Western图谱。

附图6是PD大鼠模型纹状体区GRK6表达的定量图。

附图7是PD大鼠模型模型纹状体区β-arrestin1的免疫组化图。

附图8是PD大鼠模型模型纹状体区β-arrestin1表达的Western图谱。

附图9是PD大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32（Thr75）的免疫组化图。

附图10是PD大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32（Thr75）表达的Western图谱。

附图11是PD大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2的免疫组化图。

附图12是PD大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达表达的Western图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  预防帕金森病的中药组合物的制备（一）

天麻10份、黄芪23份、熟地黄10份、白芍药32份、当归10份、钩藤25份，常规方法煎煮。

实施例2  预防帕金森病的中药组合物的制备（二）

天麻22份、黄芪10份、熟地黄25份、白芍药10份、当归28份、钩藤15份，常规方法煎煮。

实施例3  预防帕金森病的中药组合物的制备（三）

天麻10份、黄芪10份、熟地黄25份、白芍药32份、当归10份、钩藤15份，常规方法煎煮。

实施例4  预防帕金森病的中药组合物的制备（四）

天麻22份、黄芪23份、熟地黄25份、白芍药10份、当归28份、钩藤15份，常规方法煎煮。

实施例5  预防帕金森病的中药组合物的制备（五）

天麻10份、黄芪23份、熟地黄10份、白芍药10份、当归10份、钩藤25份，常规方法煎煮。

实施例6  预防帕金森病的中药组合物的制备（六）

天麻22份、黄芪10份、熟地黄10份、白芍药32份、当归28份、钩藤25份，常规方法煎煮。

实施例7  预防帕金森病的中药组合物的制备（七）

天麻12份、黄芪18份、熟地黄13份、白芍药26份、当归12份、钩藤25份，常规方法煎煮。

实施例8  预防帕金森病的中药组合物的制备（八）

天麻18份、黄芪13份、熟地黄18份、白芍药16份、当归18份、钩藤18份，常规方法煎煮。

实施例9  预防帕金森病的中药组合物的制备（九）

天麻12份、黄芪13份、熟地黄18份、白芍药26份、当归12份、钩藤22份，常规方法煎煮。

实施例10  预防帕金森病的中药组合物的制备（十）

天麻18份、黄芪18份、熟地黄18份、白芍药22份、当归16份、钩藤20份，常规方法煎煮。

需要说明的是，实施例1-10所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。

实施例11  预防帕金森病中药组合物片剂/胶囊的制备

取实施例1-10任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮0.5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料（按照常规的方法选用药用辅料），真空干燥，粉碎制粒，压制成片剂或填充装胶囊。

实施例12  预防帕金森病中药组合物颗粒的制备

取实施例1-10任一所述的中药组合物，加7-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮0.5-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加入药用辅料（按照常规的方法选用药用辅料），真空干燥，粉碎制粒，干燥，整粒，得20g颗粒，分装10g/袋。

实施例13  预防帕金森病中药组合物合剂/口服液/糖浆剂的制备

取实施例1-10任一所述的中药组合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小时，滤出药汁；再加6-10倍量水，煎煮1-2小时，滤出药汁；合并二次煎液，静置，滤取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2-3倍量酒精，搅拌沉淀过夜；取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料（按照常规的方法选用药用辅料），制成合剂、口服液或糖浆剂。

实施例14  预防帕金森病中药组合物疗效的动物实验

一、实验方法

1.PD大鼠模型制备

取65只大鼠进入实验，其中5只为假手术组，即sham组，于前脑内侧束（right medical forebrain，MFB）注射生理盐水。腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，严格平头颅位固定大鼠于脑立体定向仪，参照包新民所著大鼠脑立体定向图谱（DeWire SM, Lefkowitz RJ, Shenoy SK, et al. Beta arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol. 2007, 69: 483-510.），确定右侧前脑内侧束坐标：①前囟后3.7 mm，矢状缝右侧1.7 mm，颅骨骨膜下7.8 mm，门齿线2.4 mm；②前囟后4.4 mm，矢状缝右侧1.2 mm，颅骨骨膜下7.8 mm，门齿线2.4 mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10μl的微量注射器抽取6-OHDA 6μl（含0.2％维生素C的生理盐水配置，浓度4 μg/μl），每点注射3μl，留针10 min后退针，缝合创面。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡（0.5 mg／kg），平均旋转频率>7次/min为成功PD模型。

2.分组与治疗

将25只成功的PD模型大鼠随机分为3大组。（1）PD对照组：PD模型大鼠腹腔注射 0.2%维生素C液29天；（2）西药处理组：腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼，注射剂量为50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg苄丝肼，二者均溶于含0.2%维生素C的消毒生理盐水中，2次/d（上午9点和下午5点），持续 29d；（3）中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组：给予如组（2）中的左旋多巴甲酯/苄丝肼的基础上分别加用实施例10制备的中药组合物，按照50g原料药浓缩至100ml的比例煎煮，中药组合物小剂量组使用剂量为7.2 ml/kg，中药组合物中剂量组使用剂量为9 ml/kg，中药组合物大剂量组使用剂量为10.8 ml/kg，每日1次灌胃，连续4周。

3.行为学测定

在治疗过程中于第2、8、15、22、29天上午用药后进行大鼠行为学观察和评分。AIM评定：AIM分成4个组分（上肢AIM、口面部AIM、轴性AIM和旋转AIM）进行评定，每部分又根据其有无和严重程度分为5个等级（0-4）：0 无；1 持续时间小于30s；2 持续时间大于30s，小于60s；3 持续时间大于60s，外界刺激可使之停止；4 持续时间大于60s，外界刺激不能使之停止。用药后每20min评估一次，每次观察1min。AIM总分按观察时间内总积分的平均值进行统计，理论上1只大鼠一次用药后各组分AIM最大评分为4分，总AIM评分为16分。剂峰旋转次数：注射左旋多巴后，每5min记录旋转次数，最多的旋转次数为剂峰旋转次数。

 4.免疫组化显示纹状体β-arrestin1、GRK6、DARPP-32（Thr75）和ERK1/2的变化

结束注射后12h，3%戊巴比妥钠麻醉，左心室灌注4%多聚甲醛固定，断头取脑后相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5μm。石蜡切片脱蜡至水；3%双氧水室温避光孵育5min，以消除内源性过氧化氢酶活性；pH7.7的1nmol/l 乙二胺四乙酸-三羟甲基氨基甲烷-氯化氢（EDTA-Tris-HCl）微波加热修复；1%牛血清白蛋白室温封20min；兔抗鼠GRK6抗体、兔抗鼠β-arrestin1多克隆抗体、兔抗鼠DARPP-32抗体、抗磷酸化DARPP-32（Thr75）抗体、兔抗大鼠总ERKl/2和兔抗大鼠磷酸化ERKl/2单克隆抗体4℃湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗，37℃孵育20min；滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min；联苯二胺（3,3ˊ-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB）显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用0.01mol/l TBS充分漂洗，TBS代替一抗作为阴性对照。在显微镜下观察免疫组化切片，各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜（10×40）下观察，采用OLYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5.1图象处理软件进行半定量分析，计算阳性细胞指数（IOD）=阳性细胞面积×校正光密度值（测量区光密度－背景光密度）。

5.Western blotting法检测β-arrestin1、GRK6、DARPP-32（Thr75）和ERK1/2的表达

最后一次注射后3h，3%戊巴比妥钠麻醉，迅速断头取脑，冰上剥离双侧纹状体，超声裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度后，置-80℃冻存备用。40μg蛋白样本经10％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，以电转膜仪转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封闭液（5％脱脂奶粉）室温封闭2h，按照相应浓度稀释抗GRK6抗体（1∶500）、抗β-arrestin1抗体（1∶500）、抗总DARPP-32抗体（1∶1000）或抗磷酸化DARPP-32（Thr75）抗体（1∶1000）、抗总ERKl/2抗体（1∶1000）或抗磷酸化ERKl/2抗体（1∶500）或抗β-actin （l∶1000），4℃轻摇孵育过夜。次日加入二抗，室温下摇床孵育1 h；滴加ECL显色混合液，Bio-Rad凝胶成像仪曝光、显像。Western blot图像采用SmartView2000图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。

6.统计分析方法

实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所得计量资料以均数±标准差（                                                ±S）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

1.中药组合物对PD大鼠模型行为的影响

1.1中药组合物对PD大鼠模型各组分AIM评分的影响

中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组和西药处理组对PD大鼠模型各组分AIM评分的影响结果如表1所示。

就口面部AIM评分而言，第2天各组间均值无显著差异。第8、15、22、29天各组间均值差异显著（F=4.98、F=22.70、F=30.96、F=23.27，P<0.01）。其中，中药组合物小剂量组在第22天口面部AIM评分较西药处理组降低，差异有统计学意义（t=2.50，P<0.05），其余几天差异均无统计学意义；中药组合物中剂量组第8、15、22、29天口面部AIM评分较中药组合物小剂量组明显降低，差异有统计学意义（t=2.86、t=3.80、t=4.38、t=6.54，均P<0.05）；中药组合物中剂量组与中药组合物大剂量组比较，仅于第22天中药组合物大剂量组较中药组合物中剂量组口面部AIM评分降低，差异有统计学意义（t=2.50，P<0.05）。

就上肢AIM评分而言，第2、8天各组均值无明显差异，第15、22、29天各组间均值差异有统计学意义（F=15.12、F=32.86、F=35.80，P<0.01）。用药第2天和第8天中药组合物小剂量组上肢AIM评分与西药处理组比较无显著性差异，至用药第15、22、29天中药组合物小剂量组上肢AIM评分低于西药处理组，差异有统计学意义（t=4.45、t=4.47，均P<0.05）。第15、22、29天中药组合物中剂量组比中药组合物小剂量组上肢AIM评分明显降低，差异有统计学意义（t=3.40、t=4.04、t=3.95，均P<0.01）。中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组之间比较，差异无统计学差异。

就轴向AIM评分而言，第15、22、29天各组间均值差异有统计学意义（F=3.30、F=25.06、F=36.41，P<0.01）。中药组合物小剂量组用药至第22、29天轴向AIM值比西药处理组降低，差异有统计学意义（t=3.93、t=3.04，均P<0.05）；中药组合物中剂量组与中药组合物小剂量组比较，仅于第29天差异有统计学意义（t=3.05, P<0.05）；中药组合物大剂量组明显降低了轴向AIM值，但与中药组合物中剂量组比较，仅于第29天有差异（t=2.83，P<0.05），其它时间点差异无统计学差异。

就旋转AIM评分而言，第8、15、22、29天各组间均值差异显著（F=10.50、F=11.62、F=18.92、F=61.26，P<0.01）。中药组合物小剂量组与西药处理组旋转AIM评分比较，差异无统计学意义。中药组合物中剂量组用药至第15、22、29天，旋转AIM评分比西药处理组明显降低，差异有统计学意义（t=3.43、t=5.11、t=7.63，均P<0.01）；中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组比较，第8、15、29天差异明显（t=3.81、t=2.52、t=3.58，均P<0.05）。

表1 中药组与西药组AIM评分的比较（

±S，分）

时间

组别

鼠数（只）

口面部

上肢

轴向

旋转

2d

中药组合物-大剂量组

5

1.40±0.24

1.61±0.26

2.37±0.15

2.60±0.23

中药组合物-中剂量组

5

1.39±0.19

1.50±0.28

2.50±0.22

2.70±0.34

中药组合物-小剂量组

5

1.48±0.17

1.54±0.19

2.40±0.16

2.52±0.23

西药处理组

5

1.44±0.18

1.51±0.22

2.49±0.17

2.67±0.28

8d

中药组合物-大剂量组

5

1.50±0.22

1.64±0.22

2.42±0.24

2.60±0.06

中药组合物-中剂量组

5

1.52±0.18

1.66±0.16

2.58±0.29

2.93±0.19

中药组合物-小剂量组

5

1.84±0.21

1.81±0.19

2.70±0.41

3.14±0.20

西药处理组

5

1.82±0.17

1.93±0.20

2.71±0.41

3.20±0.25

15d

中药组合物-大剂量组

5

1.30±0.11

1.50±0.22

2.37±0.20

2.56±0.15

中药组合物-中剂量组

5

1.47±0.14

1.71±0.22

2.69±0.24

2.80±0.19

中药组合物-小剂量组

5

1.82±0.17

2.09±0.12

2.71±0.37

3.00±0.24

西药处理组

5

2.11±0.22

2.17±0.15

2.90±0.28

3.34±0.28

22d

中药组合物-大剂量组

5

1.29±0.13

1.49±0.23

2.24±0.18

2.53±0.15

中药组合物-中剂量组

5

1.44±0.13

1.65±0.20

2.27±0.13

2.57±0.11

中药组合物-小剂量组

5

1.96±0.20

2.13±0.14

2.62±0.28

3.11±0.21

西药处理组

5

2.40±0.37

2.56±0.16

3.18±0.15

3.38±0.29

29d

中药组合物-大剂量组

5

1.20±0.09

1.53±0.21

2.11±0.78

2.29±0.10

中药组合物-中剂量组

5

1.31±0.21

1.60±0.18

2.33±0.16

2.56±0.14

中药组合物-小剂量组

5

2.04±0.13

2.13±0.20

2.76±0.26

3.24±0.14

西药处理组

5

2.36±0.36

2.60±0.13

3.16±0.13

3.47±0.23

1.2中药组合物对PD大鼠模型AIM总分的影响

用药第8、15、22、29天进行评分，发现中药组合物小剂量组用药至第15、22、29天，AIM总分分别为（9.73±0.52）、（9.80±0.37）及（10.15±0.32）分，较西药处理组（10.48±0.40）、（11.41±0.17）分及（11.58±0.24）分明显降低（t=2.88、t=9.25、t=7.77，均p<0.05）。而中药组合物中剂量组用药第8、15、22、29天AIM总分分别为（8.82±0.36）、（8.71±0.47）、（8.13±0.37）和（7.89±0.57），均低于中药组合物小剂量组总分，差异有统计学意义（t=3.32、t=3.19、t=7.56、t=7.85，均p<0.05）；于第8、15、22天，中药组合物大剂量组AIM总分分别为（8.20±0.27）、（7.74±0.34）、（7.55±0.38）分，较中药组合物中剂量组低，差异有统计学意义（t=3.12、t=3.44、t=2.57，均p<0.05），而第29天中药组合物大剂量组（7.71±1.13）分与中药组合物中剂量组（7.89±0.57）比较，差异无统计学意义（见图1，#表示中药组合物小剂量组与西药处理组比较，均P<0.05；*表示中药组合物中剂量组与中药组合物小剂量组比较，均P<0.05；+表示中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组比较，均P<0.05）。

1.3中药组合物对PD大鼠模型剂峰旋转次数的影响

于第8、15、22、29天进行剂峰旋转次数检测，发现中药组合物小剂量组评分分别是（123.6±11.91）、（132±10.07）、（151±15.73）和（155.8±7.40）次，与西药处理组差别不大；而中药组合物中剂量组与中药组合物小剂量组比较，中药组合物中剂量组剂峰旋转次数分别为（85.4±15.60）、（82.0±21.76）、（87±10.20）及（73±15.18），均低于中药组合物小剂量组，差异有统计学意义（t=4.13、t=4.57、t=7.51、t=10.96，均p<0.05）；中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组比较，第22、29天中药组合物大剂量组剂峰旋转次数（51.2±6.76）和（53.8±7.79）次，较中药组合物中剂量组低，差异有统计学意义（t=6.73、t=2.52，均p<0.05）（见图2，#表示西药处理组与中药组合物小剂量组比较，均P<0.05；*表示中药组合物中剂量组与中药组合物小剂量组比较，均P<0.01；+表示中药组合物大剂量组与中药组合物中剂量组比较，均P<0.05）。

2.中药组合物对PD大鼠模型纹状体区信号蛋白的影响

2.1中药组合物对PD大鼠模型纹状体区GRK6的影响

免疫组化结果显示GRK6于细胞膜上表达。各组未损伤侧均值比较，差异无统计学意义（F=0.17，P>0.05），而各组损伤侧均值差异显著（F=4.48，P<0.05）。PD对照组的大鼠损伤侧GRK6表达量为（4.50±0.85）×10³，较sham组的正常大鼠的（6.10±0.55）×10³明显降低（t=9.99，P<0.01）；长期使用左旋多巴治疗，即西药处理组的大鼠GRK6表达进一步减少至（3.53±0.71）×10³，与PD对照组的大鼠比较，差异有统计学意义（t=2.99，P<0.05）；而加用本发明的中药组合物预防的大鼠，包括中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组，纹状体损伤侧GRK6表达与PD对照组大鼠比较，均无进一步降低，与西药处理组的大鼠比较，中药组合物小剂量组（4.13±1.20）×10³与西药处理组无差异，中药组合物中剂量组、中药组合物大剂量组损伤侧GRK6的表达量分别是（4.31±0.95）×10³、（4.68±1.24）×10³，与西药处理组比较，GRK6表达量明显较多（t=3.79、t=4.84，均P<0.05）（见图3和图4，图3中：1为sham组，2为PD对照组，3为西药处理组，4为中药组合物小剂量组，5为中药组合物中剂量组，6为中药组合物大剂量组；U为未损伤侧，L为损伤侧；*表示PD对照组与sham组比较P<0.01，#表示西药处理组与PD对照组比较P<0.05，+表示中药组合物小、中、大剂量组与西药处理组比较，均P<0.05）。

Western结果与免疫组化结果基本一致。就每只大鼠而言，检测结果以损伤侧/未损伤侧的比值表示，β-actin作为内参。与sham组的（100.48±5.57）%比较，PD对照组的大鼠GRK6表达量减少至（81.32±5.94）%，差异显著（t=7.37，P<0.01）；左旋多巴长期治疗即西药处理组的大鼠，GRK6表达量进一步降低至（73.66±3.43）%，差异有统计学意义（t=3.11，P<0.05）；而加用本发明的中药组合物预防的大鼠，即中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组，纹状体GRK6表达量与PD对照组的大鼠比较，差异无统计学意义。与长期使用左旋多巴的大鼠即西药处理组比较，中药组合物中剂量组纹状体GRK6表达量（83.68±4.50）%明显较高，差异有统计学意义（t=7.26，P<0.01），中药组合物小剂量组（77.12±3.15）%和中药组合物大剂量组（80.36±4.74）%与其比较，差异不显著（见图5和图6，图5中：1、2为sham组，3、4为PD对照组，5、6为西药处理组，7、8为中药组合物小剂量组，9、10为中药组合物中剂量组，11、12为中药组合物大剂量组； 1、3、5、7、9、11为未损伤侧，2、4、6、8、10、12为损伤侧；*表示与sham组比较，p<0.01；#表示与PD对照组比较，p<0.05；+表示中药组合物小、中、大剂量组与西药处理组比较，p<0.01）。

2.2中药组合物对PD大鼠模型模型纹状体区β-arrestin1的影响

免疫组化显示β-arrestin1表达于细胞膜，各组损伤侧均值差异显著（F=5.76，P<0.05）。PD对照组的大鼠β-arrestin1蛋白的阳性细胞指数为（3.27±0.75）×10⁴，低于sham组大鼠的（4.54±0.63）×10⁴，但差异无统计学意义。左旋多巴长期治疗后即西药处理组的大鼠，β-arrestin1表达进一步降低，阳性细胞指数为（2.54±0.49）×10⁴，与PD对照组的大鼠比较，差异有统计学意义（t=3.99，P<0.05）。加用本发明的中药组合物的大鼠，即中药组合物小剂量组、中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组，β-arrestin1阳性细胞指数未出现进一步的下降，特别是中药组合物中剂量组大鼠β-arrestin1阳性细胞指数为（3.57±0.56）×10⁴，比PD对照组的大鼠增多（t=6.80，P<0.01）。中药组合物大剂量组、中药组合物小剂量组β-arrestin1阳性细胞指数分别为（3.24±0.68）×10⁴和（3.10±0.59）×10⁴，与PD对照组比较，无显著差异（见图7，图7中：1为sham组，2为PD对照组，3为西药处理组，4为中药组合物小剂量组，5为中药组合物中剂量组，6为中药组合物大剂量组；U为未损伤侧，L为损伤侧）。

Western结果与免疫组化结果基本一致。每只大鼠Western结果以损伤侧/未损伤侧的比值表示，β-actin作为内参。PD对照组的大鼠β-arrestin1蛋白表达量为（76.46±5.12）%，比sham组大鼠（101.56±6.79）%明显减少（t=11.48，P<0.01）。左旋多巴长期治疗，即西药处理组的大鼠，β-arrestin1表达量进一步降低，为（65.40±6.68）%，与PD对照组的大鼠比较，差异有统计学意义（t=8.31，P<0.01）。加用本发明的中药组合物预防后，中药组合物小剂量组β-arrestin1表达量为（69.54±3.36）%，较PD对照组的大鼠降低（t=3.42，P<0.05），呈现出与西药处理组相似的趋势；而中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组分别为（73.52±3.82）%和（72.36±6.66）%，未出现进一步的下降。同时，中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组纹状体β-arrestin1表达量明显高于长期使用左旋多巴即西药处理组的大鼠，差异有统计学意义（t=3.11、t=3.70，P<0.05）。中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组之间比较，差异无统计学意义（见图8，图8中：1、2为sham组，3、4为PD对照组，5、6为西药处理组，7、8为中药组合物小剂量组，9、10为中药组合物中剂量组，11、12为中药组合物大剂量组；1、3、5、7、9、11为未损伤侧，2、4、6、8、10、12为损伤侧）。

2.3中药组合物对PD大鼠模型纹状体区磷酸化DARPP-32（Thr75）表达的影响

免疫组化显示各组损伤侧均值差异显著（F=472.10，P<0.01）。sham组大鼠磷酸化DARPP-32（Thr75）表达水平为（7.06±0.47）×10⁶，PD对照组升高至（11.44±0.16）×10⁶，差异有统计学意义（t=14.07，P<0.01）。左旋多巴长期治疗后即西药处理组，磷酸化DARPP-32（Thr75）表达为（3.35±0.30）×10⁶，比PD对照组明显降低，差异有统计学意义（t=39.99，P<0.01）。加用本发明的中药组合物的大鼠，中药组合物大、中、小剂量组磷酸化DARPP-32（Thr75）表达分别为（12.35±0.19）×10⁶、（11.90±0.47）×10⁶和（7.30±0.27）×10⁶，中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组均未出现明显的降低，仅中药组合物小剂量组降低。中药组合物大剂量组和中药组合物中剂量组之间比较，差异无统计学意义（见图9，图9中：A为sham组，B为PD对照组，C为西药处理组，D为中药组合物小剂量组，E为中药组合物中剂量组，F为中药组合物大剂量组）。

Western结果与免疫组化结果基本一致，sham组大鼠磷酸化DARPP-32（THr75）表达的灰度值为（2.04±0.24）×10⁶，PD对照组大鼠为（3.00±0.20）×10⁶，二组比较差异有统计学意义（t=28.95，P<0.01）。加用小剂量本发明的中药组合物没有起到预防作用，中药组合物小剂量组磷酸化DARPP-32（THr75）表达量为（1.80±0.15）×10⁶，较PD对照组的大鼠降低（t=19.77，P<0.01）；加用中剂量本发明的中药组合物预防的大鼠纹状体磷酸化DARPP-32（THr75）表达量为（3.15±0.15）×10⁶，与PD对照组的大鼠比较，差异无统计学意义（P>0.05）。中药组合物大剂量组磷酸化DARPP-32（THr75）表达量为（3.81±0.17）×10⁶，较PD对照组的大鼠稍有增高（t=38.57，P<0.01），同时，中药组合物大剂量组比中药组合物中剂量组表达增多（t=21.78，P<0.01）（见图10，图10中：1为sham组，2为PD对照组，3为西药处理组，4为中药组合物小剂量组，5为中药组合物中剂量组，6为中药组合物大剂量组）。

2.4中药组合物对PD大鼠模型纹状体区磷酸化ERK1/2表达的影响

免疫组化显示各组损伤侧均值差异显著（F=117.49，P<0.01）。PD对照组的大鼠磷酸化ERK1/2表达水平为（4.37±0.23）×10⁴，低于sham组大鼠的（5.23±0.34）×10⁴，差异有统计学意义（t=15.32，P<0.01）。左旋多巴长期治疗后即西药处理组的大鼠，磷酸化ERK1/2表达升高至（8.09±0.37）×10⁴，与PD对照组比较，差异有统计学意义（t=34.13，P<0.01）。加用本发明的中药组合物的大鼠，中药组合物小剂量组磷酸化ERK1/2表达为（6.69±0.36）×10⁴，呈上升趋势，中药组合物中剂量组和中药组合物大剂量组表达量为（4.49±0.34）×10⁴和（4.23±0.25）×10⁴，均未出现明显的上升。中药组合物大剂量组和中药组合物中剂量组之间比较，差异不明显。（见图11，图11中：A为sham组，B为PD对照组，C为西药处理组，D为中药组合物小剂量组，E为中药组合物中剂量组，F为中药组合物大剂量组）。

Western结果与免疫组化结果基本一致，PD对照组的大鼠磷酸化ERK1/2表达的灰度值为（2.85±0.17）×10⁶，比sham组大鼠的（3.51±0.12）×10⁶减少（t=20.77，P<0.01）；加用大、中、小剂量本发明的中药组合物预防的大鼠纹状体磷酸化ERK1/2表达的灰度值分别为（3.30±0.19）×10⁶、（3.15±0.16）×10⁶和（4.40±0.16）×10⁶，与PD对照组的大鼠比较均有不同程度的升高，差异均有统计学意义（t=13.81、t=3.41、t=45.12，P<0.01）。其中，中药组合物中剂量组磷酸化ERK1/2表达量升高幅度最小，中药组合物小剂量组升高幅度最大（见图12，图12中：1为sham组，2为PD对照组，3为中药组合物小剂量组，4为中药组合物中剂量组，5为中药组合物大剂量组）。

本研究发现中剂量的本发明中药组合物能抑制PD大鼠模型口面部、上肢AIM评分的进行性升高，且长期观察发现大剂量中药组合物与中剂量中药组合物没有差别。而就轴向和旋转AIM评分而言，结果表明大剂量中药组合物具有抑制AIM评分进行性升高的作用，较中剂量的中药组合物更有效。说明中剂量中药组合物即可明显减少PD模型大鼠运动并发症的发生，而大剂量中药组合物对轴向和旋转症状的疗效更显著且稳定。小剂量组中药组合物用药至2周时抑制了AIM总评分的进行性升高，发挥了预防作用，中剂量中药组合物能在早期减少左旋多巴制剂产生的AIM，且长期观察发现大剂量与中剂量没有差别，说明中剂量中药组合物对减少左旋多巴产生的AIM效果显著且稳定。总之，由AIM评分结果可见本发明的中药组合物对于PD运动并发症的发生有预防作用。

在既往的研究中，多数学者认为，随着PD病程进展，基底节DA不断出现代偿功能，PD患者早期基底节DA受体出现超敏，受体数目增加（上调效应）。DA受体属于GPCRs家族，当DA受体长期暴露于激动剂，同样水平的激动剂将不能使受体的效应器激活，即激动剂激活了GPCRs后，还启动了一个负反馈的过程，称为受体的失敏。这个过程使膜信号减弱，避免了过分刺激细胞引起的潜在伤害。本研究结果显示，PD时GRK6表达量较sham组降低，提示DA受体超敏与GRK6的降低密切相关。此外，西药处理组GRK6表达量较PD对照组进一步降低。这可能是GRK6随着左旋多巴的长期使用而降低，无法抑制超敏受体异常信号的激活，最终导致运动并发症的产生。更为重要的是，中剂量中药组合物能抑制GRK6表达的降低，抑制了DA受体的超敏作用，阻止了异常信号的传递，从而起到预防运动并发症发生的作用，剂量增大未出现更明显的预防作用。同样，PD时β-arrestin1蛋白表达较sham组降低，可能是由于PD多巴胺能神经元大量丢失和变性，残留的多巴胺神经元发挥代偿作用，使DA受体敏感性增加。而长期使用左旋多巴治疗的西药处理组β-arrestin1表达量较PD对照组进一步降低，这可能是PD时β-arrestin1对异常信号转导抑制减弱，从而导致了异常信号激活，引起了运动并发症。加用本发明的中药组合物的大鼠，小剂量中药组合物可以预防β-arrestin1蛋白表达的进一步降低，而中剂量中药组合物不仅抑制β-arrestin1蛋白表达的进一步降低，还使该值增多，预防异动并发症发生的作用较显著，大剂量中药组合物未出现更明显的预防作用。说明中剂量组中药组合物可以增加β-arrestin1蛋白表达，起到预防运动并发症发生的作用。

多巴胺和环磷腺苷（cAMP）调节的磷酸化蛋白-32（dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000，DARPP-32）表达于纹状体投射神经元，在多巴胺的信号传导中有重要作用。PKA可以促进DARPP-32的Thr34位点的磷酸化；同时可能通过激活蛋白磷酸酶-2A（PP-2A），使Thr75位点脱磷酸化。DARPP-32的Thr34位点磷酸化后，转变为蛋白磷酸酶1（PP-1）的高效抑制剂，从而调控蛋白的磷酸化状态，进一步影响下游信号传导。DARPP-32的Thr75位点磷酸化后成为PKA的抑制剂，其磷酸化程度的降低减轻了对PKA的抑制作用。由此可见磷酸化位点的不同可予DARPP-32以相反的生理效应。前期研究发现，运动并发症模型大鼠纹状体区ERK的磷酸化增强，DARPP-32Thr75位点磷酸化降低，提示PKA信号通路的ERK和DARPP-32介导的信号转导增强。细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinases，ERK）是丝裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）家族中的一成员，被认为是从细胞表面到细胞核的信号转导的重要调制点。ERK经MAPK的激酶MEK在Thr202及Tyr204位点上磷酸化修饰（又称ERK1/2，P44/P42），后可参与更广泛的细胞内信号转导的调节。缓解运动并发症的药物（如腺苷A_2A受体拮抗剂、大麻素CB1受体激动剂）可以减弱ERK和DARPP-32的异常磷酸化，提示ERK和DARPP-32 参与了运动并发症的发生，其功能的增强可以激活下游的转录因子，影响纹状体区基因表达，也可调控参与纹状体功能调节的一些重要蛋白的磷酸化水平。因此本发明就中药组合物对大鼠纹状体区总DARPP-32（Thr75）和磷酸化DARPP-32（Thr75）蛋白表达的影响进行了观察，发现各组纹状体区总DARPP-32（Thr75）表达量并未发生改变。左旋多巴长期治疗后，磷酸化DARPP-32（Thr75）表达比PD对照组明显降低，加用中剂量本发明的中药组合物即能逆转磷酸化DARPP-32（Thr75）表达量的降低。原因可能是运动并发症发生时DA受体敏感性增高，PKA通路激活，从而降低了DARPP-32蛋白Thr75位点的磷酸化表达，中药组合物的使用上调了磷酸化DARPP-32（Thr75）的表达，对PKA通路抑制增加，减少了异常的运动行为。同时，本发明通过免疫组化和Western blot技术观察PD大鼠纹状体区总ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白表达的变化，发现各组总ERK蛋白表达无明显变化。就磷酸化ERK1/2蛋白而言，PD对照组磷酸化ERK1/2蛋白的表达量较sham组大鼠降低，左旋多巴长期治疗后磷酸化ERK1/2表达显著升高，提示运动并发症发生时存在ERK通路的激活。本发明的中药组合物辅助治疗后，中剂量组和大剂量组表达量均未出现明显的上升，表明中剂量本发明的中药组合物抑制了ERK通路的异常激活，起到了预防运动并发症的作用。

总之，中剂量本发明的中药组合物逆转了PD模型大鼠各组分AIM评分的进行性升高，减少了PD模型大鼠剂峰旋转次数，通过增加GRK6、β-arrestin1蛋白表达量，逆转磷酸化DARPP-32（Thr75）表达量的降低及磷酸化ERK1/2表达显著升高，改善了运动并发症胞内异常的信号转导分子的功能，减少了PD运动并发症的发生，在预防PD和延缓疾病发展方面具有极大的应用价值。

从中医角度来说，本发明的中药组合物配伍符合“君臣佐使”原则，益气养血、化痰息风，气血充则风痰止，肝气疏则震颤平，遵循“益气化痰、柔肝熄风法”的治疗原则。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种预防帕金森病的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料药制成：天麻10-22份、黄芪10-23份、熟地黄10-25份、白芍药10-32份、当归10-28份、钩藤15-25份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料药制成：天麻12-18份、黄芪13-18份、熟地黄13-18份、白芍药16-26份、当归12-18份、钩藤18-22份。

3. 根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料药制成：天麻18份、黄芪18份、熟地黄18份、白芍药22份、当归16份、钩藤20份。

4.根据权利要求1-3任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物的药剂是片剂、胶囊剂、颗粒、合剂或糖浆剂。

5. 根据权利要求1-3任一所述的中药组合物，其特征在于，所述的中药组合物在制备预防帕金森病药物中的应用。

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