CN116196320A - 车前草苷d在抑制微孢子虫、制备预防或治疗微粒子病相关药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种车前草苷D在抑制微孢子虫、制备预防或治疗微粒子病相关药物中的应用。本发明首次提出将车前草苷D用于抑制微孢子虫，车前草苷D可以高效结合Sar1蛋白，通过阻断Sar1蛋白的功能抑制家蚕微粒子病病原‑家蚕微孢子虫的复制，从而达到预防或治疗家蚕微粒子病的目的。当车前草苷D在细胞中使用时，终浓度达到0.1 µM以上即可抑制家蚕微孢子虫；当用于制备预防或治疗微粒子病药物时，浓度达到0.2mM（130ppm）及以上则能显著降低家蚕微粒子病的发病率。

Description

车前草苷D在抑制微孢子虫、制备预防或治疗微粒子病相关药 物中的应用

技术领域

本发明涉及本发明涉及分子生物学与病理学领域，尤其涉及车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病相关药物中的应用。

背景技术

家蚕微粒子病普遍是由家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)经口感染蚕体引起的具有毁灭性的传染性病害。由于其潜伏期长，特别是可以通过胚种传播，因此对蚕桑产业的基础蚕种的生产威胁巨大，一旦蚕种生产企业将超标带毒蚕种销售给蚕农喂养后极易造成家蚕微粒子病的爆发，由于家蚕微孢子虫的孢子对环境的强预防或治疗逆性，容易造成对整个养蚕区域的长时间污染，给蚕农带来经济损失。当前，蚕种场蚕种生产支出的近一半都用于微粒子病的防控上，目前家蚕微孢子虫是世界蚕种生产唯一的法定检疫对象。

目前家蚕微粒子病的治疗药物以苯并咪唑类药物-多菌灵和阿苯达唑为主，作用于家蚕微孢子虫β-微管蛋白的多菌灵是40多年前发现的预防或治疗家蚕微粒子病药物，其治疗效果受病原感染系数、感染时间、用药时间等因素的影响，且因其具致癌性目前在欧美国家已禁用。阿苯达唑(克微一号)通过抑制微孢子虫摄取葡萄糖而达到防治效果，但是目前已经出现了一些预防或治疗药性的问题，所以有必要应用新的策略来发现新的预防或治疗家蚕微孢子虫药物。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种车前草苷D在抑制微孢子虫中的应用；本发明另一目的是提供一种车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病药物中的应用。

技术方案：本发明所述的车前草苷D在抑制细胞内微孢子虫中的应用。

所述车前草苷D的结构如(I)所示，分子式为C₂₉H₃₆O₁₆，分子量：640.5866。

车前草苷D是一种中药小分子单体，其在家蚕细胞内可以针对性地结合家蚕微孢子虫的核心蛋白Sar1，通过阻断Sar1蛋白的功能抑制家蚕微粒子病病原-家蚕微孢子虫的复制，从而达到预防或治疗家蚕微粒子病的目的。

进一步地，所述微孢子虫为家蚕微孢子虫Nosema bombycis或其变异株系。

进一步地，所述车前草苷D的浓度为0.1μM以上。

本发明所述的车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病药物中的应用。

进一步地，所述微粒子病为家蚕微粒子病。

进一步地，所述家蚕微粒子病由家蚕微孢子虫Nosema bombycis或其变异株系引发。

进一步地，其特征在于，所述预防或治疗微粒子病药物中车前草苷D的浓度为0.1-2mM。

进一步地，所述药物还包括其他药学上可接受的辅料。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明首次提出将车前草苷D在用于抑制微孢子虫，车前草苷D可以高效结合Sar1蛋白通过阻断Sar1蛋白的功能抑制家蚕微粒子病病原-家蚕微孢子虫的复制，从而达到预防或治疗家蚕微粒子病的目的。当车前草苷D在细胞中使用时，终浓度达到0.1μM以上即可抑制家蚕微孢子虫的；当用于制备预防或治疗微粒子病药物时，浓度达到0.2mM(130ppm)及以上则能显著降低家蚕微粒子病的发病率。

附图说明

图1为利用不同浓度车前草苷D处理家蚕细胞后细胞内的家蚕微孢子虫的基因组拷贝数结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1不同车前草苷D浓度对家蚕微孢子虫在细胞内的抑制实验

1.细胞的接种及车前草苷D的储存液配制

(1)将家蚕卵巢细胞系BmN(家蚕生理与病理实验室保存)在含有10％FBS(胎牛血清)的TC100昆虫细胞培养基中27℃条件下持续培养；

(2)车前草苷D的储存液配制

用DMSO配制浓度为10mM的车前草苷D的储存液；

(3)家蚕微孢子虫的体外发芽与感染

用1ml 0.1mol/L的KOH溶液重悬家蚕微孢子虫孢子(家蚕生理与病理实验室保存)，并于30℃温育30min，之后与12ml的BmN细胞悬液充分混合；静置5min后等量注入12孔细胞培养板，于27℃静置1h，使其完全贴壁后，除去培养基，重新加入新鲜培养基后27℃条件下密封培养。

2.当车前草苷D的终浓度为0，0.1，0.5和1μM时，对家蚕微孢子虫在细胞内的抑制实验。

家蚕微孢子虫的体外发芽和感染后，除去培养基，重新加入含终浓度为0，0.1，0.5和1μM车前草苷D的新鲜培养基(使用步骤(2)中的车前草苷D的储存液配制)，27℃培养72小时后分别收集细胞，利用DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP422)提取总DNA，用定量PCR技术检测细胞内家蚕微孢子虫的基因组拷贝数。结果如图1所示车前草苷D浓度在0.1μM-1μM之间时，都能够显著抑制家蚕微孢子虫的复制。

实施例2不同车前草苷D浓度对微粒子病发病率的影响实验

供试蚕品种：秋丰×白玉(中国农业科学院蚕业研究所保存)；

龄期：4龄起蚕；

设区：不同浓度各处理重复3区，每区50头蚕。

车前草苷D溶液配置：用DMSO配制终浓度为0、0.1、0.2、0.5、2mM的车前草苷D溶液。

对照组：用无菌水将家蚕微孢子虫稀释为10⁶孢子/mL的悬浮液，用其浸泡桑叶10秒，晾干后给供试蚕喂饲12小时(感染)。随后饲喂正常桑叶，饲养至熟蚕、上蔟、结茧。

实验组：用无菌水将纯化后的家蚕微孢子虫稀释为106孢子/mL的悬浮液，浸泡桑叶，晾干后给供试蚕喂饲12小时(感染)。随后用含药桑叶(分别使用0.1、0.2、0.5、2mM车前草苷D溶液浸泡10秒)饲喂已经添毒的家蚕6小时，再利用正常桑叶饲养，以后每天饲喂含药桑叶1次，其他时间饲喂正常桑叶，饲养至熟蚕、上蔟、结茧。

羽化出蛾6天后放入60℃烘箱烘干6小时，逐蛾研磨镜检。实验过程中死蚕、死蛹也用显微镜检查是否死于微孢子感染，因其他因素死亡的蚕数从各区总数中扣除，不作统计。最终调查各区的微孢子虫感染率，并分别计算出治疗率。结果见表1。当喂食的桑叶中车前草苷D浓度为0时，家蚕的感染率为100％；当喂食的桑叶中车前草苷D浓度为0.1mM时，微粒子病发病率为22.97％，药物治疗率为77.03％，证明车前草苷D有一定的治疗效果；当喂食的桑叶中车前草苷D浓度在0.2～0.5mM时，微粒子病发病率均为0％，药物治疗率均为100％；然而当喂食的桑叶中车前草苷D浓度达到2mM时，一半以上蚕在结茧前死亡，且并未检出微孢子虫，表示该浓度车前草苷D对家蚕具有毒性。

表1不同浓度车前草苷D对家蚕微粒子病的治疗率

实施例3不同车前草苷D浓度的毒性实验

供试蚕品种：秋丰×白玉(中国农业科学院蚕业研究所保存)；

龄期：4龄起蚕；

取1000头蚕，用含药桑叶(分别使用0、0.2、0.5、2mM车前草苷D溶液浸泡)每日饲喂家蚕1次，其他时间饲喂正常桑叶，饲养至熟蚕、上蔟、结茧。饲养期间每天记录家蚕的生长情况，记录死蚕或病蚕头数、结茧数、化蛾数、死笼数等生命指标，全茧量、茧层量、茧层率等经济指标。待蚕蛹羽化出蛾后，使雌雄蛾交配，产卵，调查卵量和蚕卵孵化率。结果见表2。

表2车前草苷D对家蚕毒性效果调查

由表2的试验数据可知，利用本发明的车前草苷D浸泡桑叶给家蚕添食，在有效使用浓度内(0.2-0.5mM)，与对照组(0mM)比较，家蚕的正常生长不会造成影响，家蚕的虫蛹生命率(结茧数和化蛾数)、茧质(全茧量和茧层率)和卵质(卵量和孵化率)数据没有显著差异。

Claims (8)

1.一种车前草苷D在抑制微孢子虫中的应用。

2.根据权利要求1所述的车前草苷D在抑制微孢子虫中的应用，其特征在于，所述微孢子虫为家蚕微孢子虫Nosema bombycis或其变异株系。

3.根据权利要求1所述的车前草苷D在抑制微孢子虫中的应用，其特征在于，所述车前草苷D的浓度为0.1 µM以上。

4.一种车前草苷D在制备预防或治疗由微孢子虫感染引起的微粒子病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病药物中的应用，其特征在于，所述微粒子病为家蚕微粒子病。

6.根据权利要求5所述的车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病药物中的应用，其特征在于，所述家蚕微粒子病由家蚕微孢子虫Nosema bombycis或其变异株系引发。

7.根据权利要求4所述的车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病药物中的应用，其特征在于，所述预防或治疗微粒子病药物中车前草苷D的浓度为0.1-2mM。

8.根据权利要求4所述的车前草苷D在制备预防或治疗微粒子病药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括其他药学上可接受的辅料。

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