CN111588735A - 纳米银在制备抑制家蚕主要病原物家蚕微粒子药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纳米银在制备抑制家蚕主要病原物家蚕微粒子药物中的应用，所述纳米银呈球形，尺寸为3‑24nm，晶格间距为0.23nm；通过不同浓度的纳米银溶液，对家蚕幼虫的毒性进行测试，结果显示各组之间家蚕幼虫体重、茧层率以及产卵数均没有显著差异，表明100μg/mL以下浓度的纳米银溶液对家蚕幼虫安全；对纳米银抗微粒子机制进行解析，发现纳米银会严重破坏家蚕微粒子的结构，与孢壁作用增加其通透性，从而破坏的一些DNA、蛋白质等物质，使其侵染能力大大削弱，降低了家蚕微粒子的致病能力，从而达到对家蚕微粒子的消毒效果；对家蚕家蚕微粒子的防治具有重要意义。

Description

纳米银在制备抑制家蚕主要病原物家蚕微粒子药物中的应用

技术领域

本发明涉及蚕桑生产技术领域，具体涉及一种蚕桑生产上对家蚕微粒子有抑制作用的药物。

背景技术

家蚕微粒子(Nosema bombycis，N.b)能够感染家蚕(Bombyx mori)引起家蚕微粒子病(Pèbrine)，给蚕业造成重大的经济损失。当前防控家蚕微粒子的手段主要有：母蛾镜检淘汰有毒蚕种、饲养过程中严格消毒处理、感染后通过防微灵及阿苯达唑等化学药物治疗。由于家蚕微粒子的结构特殊，现有治疗药物效果尚不稳定，一直以来家蚕微粒子的防治工作以预防为主。但是现有的预防措施也很难达到一个理想的效果，迫切需要研发一种新型高效的防控方法。

纳米银(Ag nanoparticles，AgNPs)是粒径为纳米级的金属银单质，由于其独特的表面效应，体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等，已广泛应用于化工、纺织、轻工、电子、生命科学、医学等研究领域，并呈现出极其重要的应用价值。纳米银具有广谱的抗菌特性，抗菌效果持久，且不易产生耐药性，能够有效的杀灭细菌、真菌、支原体等致病微生物。但是对于家蚕主要的病原微生物之一的家蚕微粒子是否也具有广谱的消毒效果，至今还没有确切的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种纳米银在制备抑制家蚕主要病原物家蚕微粒子药物中的应用；本发明的目的之二在于提供纳米银在制备抑制微孢子虫的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、纳米银在制备抑制家蚕主要病原物家蚕微粒子药物中的应用。

优选的，所述纳米银呈球形，尺寸为3-24nm，晶格间距为0.23nm。

优选的，所述纳米银的有效浓度低于100μg/mL。

优选的，所述纳米银由以下方法制备：向硝酸银溶液中加入牛血清蛋白，然后在沸水浴中不断搅拌，并调节pH调至9～11反应30-60min。

优选的，所述硝酸银溶液的质量分数为1％。

2、纳米银在制备抑制微孢子虫的药物中的应用。

优选的，所述纳米银呈球形，尺寸为3-24nm，晶格间距为0.23nm。

本发明的有益效果在于：本发明通过使用纳米银溶液可对家蚕主要病原微生物家蚕微粒子有较显著的抑制作用，此方法简单快捷，易被广大蚕农所接受，从而达到对家蚕微粒子的防控目的。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1纳米银制备过程。

图2纳米银对家蚕体重的影响。

图3纳米银对家蚕经济性状的影响。

图4纳米银对家蚕产卵能力的影响。

图5纳米银对家蚕微粒子的消毒作用。

图6不同浓度纳米银对家蚕微粒子发芽率的影响。

图7透射电子显微镜观察纳米银作用后家蚕微粒子的结构。(PV：后极泡；N：细胞核；PT：极管；EX：孢子外壁；EN：孢子内壁；AD：锚定板)

图8扫描电子显微镜观察纳米银作用后家蚕微粒子的形态。

图9qRT-PCR检测纳米银孵育后家蚕微粒子的基因组释放情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、纳米银的制备

纳米银的制备：按硝酸银溶液质量分数为1％将硝酸银加入超纯水的烧杯中，随后加入1g牛血清蛋白，将烧杯置于沸水浴中并不断搅拌，并通过NaOH溶液使pH调至10左右，控制终体积为50ml，反应30min～60min，使纳米银趋于稳定，获得纳米银浓度为100μg/mL。

实施例2、纳米银表征

因为纳米银的理化性质和生物特性可以伴随着自身尺寸和形状的改变而变化，它们的大小与形状通常被认为是非常重要的。通过透射电子显微镜观察，对使用材料纳米银的大小及分布进行了表征分析(图1)，透射电子显微镜图像分别代表不同放大倍数的纳米银。结果显示，纳米银呈球形，尺寸范围大致在3-24nm，其中主要集中分布在3-18nm，并测量到纳米银的晶格条纹，其晶格间距为0.23nm，这与银的平面距离是一致的。分析结果表明，纳米银是以金属形式存在，而不是以银的化合物形式存在。

实施例3、纳米银对家蚕生长发育的影响

为了进一步检测纳米银对家蚕幼虫生长发育的影响，本研究选取了1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL 5个浓度的纳米银，每天对桑叶进行浸泡处理，采用超纯水浸泡的桑叶为对照组，从5龄起蚕开始添食，直至上蔟，分别记录各组五龄一天、五龄三天、五龄六天每头家蚕的体重。结果显示，1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL纳米银处理后，各处理组与对照之间的家蚕幼虫体重均无明显差异，说明100μg/mL以下浓度的纳米银对家蚕幼虫的体重没有影响(图2)。

为了进一步检测了纳米银对家蚕经济性状及产卵能力的影响，基于以上5个浓度的纳米银处理，对上蔟7天后的茧层率进行统计分析。结果显示，1μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL纳米银处理后的家蚕与对照组之间的茧层率均无明显差异(图3)。对各组母蛾的产卵数进行统计发现，各处理组与对照组之间的母蛾产卵数均在400-450粒之间(图4)。以上结果表明100μg/mL以下浓度的纳米银对家蚕个体的生长发育以及经济性状没有明显的影响，后续实验将参考这一安全浓度范围。

实施例4、纳米银对家蚕微粒子的抑制作用

家蚕微粒子较厚的孢壁结构是药物发挥作用的一大难题，为了鉴定纳米银对家蚕微粒子的消毒效果，本研究选取了1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL三个跨度较大的纳米银浓度。将家蚕微粒子与不同浓度的纳米银孵育半个小时后，添食4龄起大造，添食浓度为10⁶个/头，分别在感染家蚕微粒子0d、2d、4d、6d和8d后取材并统计每天的死亡情况。结果显示，正常感染家蚕微粒子的对照组、1μg/mL纳米银处理组和10μg/mL纳米银处理组在感染后第6-10天出现批量死亡，到第10天的时候，家蚕微粒子对照组的存活率为20％，1μg/mL纳米银处理组与10μg/mL纳米银处理组的存活率均高于对照组，100μg/mL纳米银处理组的存活率高达90％。统计结果表明，纳米银处理后的家蚕微粒子感染率降低，提高了家蚕存活率(图5)。以上结果表明，纳米银对家蚕微粒子具有一定的消毒效果，且纳米银浓度越大，消毒作用越强。

实施例5、纳米银对家蚕微粒子的作用机制

家蚕微粒子侵染宿主的首要前提是孢子激活，弹出极管，进而通过极管将孢原质注入宿主细胞内，从而实现在宿主细胞内的增殖，因此家蚕微粒子的发芽率直接影响了家蚕微粒子对宿主细胞的侵染率。利用本实验室所制的多克隆抗体NbPTP2标记家蚕微粒子发芽后的极丝。选取1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL三个浓度的纳米银分别与家蚕微粒子孵育后，再对家蚕微粒子进行人工发芽刺激，通过间接免疫荧光实验观察纳米银对家蚕微粒子发芽情况的影响。结果显示，与未经过纳米银处理的家蚕微粒子发芽情况相比，纳米银孵育后的家蚕微粒子的发芽率降低，且纳米银浓度越高，家蚕微粒子发芽率越低，100μg/mL纳米银作用后，显微镜下观察到每个视野没有或者只有1～2个极丝弹出的现象(图6)。这也表明纳米银会抑制家蚕微粒子的极丝弹出，从而抑制家蚕微粒子在宿主体内的增殖复制。

实施例6、纳米银处理后家蚕微粒子的结构与形态观察

为了进一步探索纳米银对家蚕微粒子的作用机制，我们观察了纳米银处理后家蚕微粒子的结构与形态变化。将纳米银孵育过的家蚕微粒子制片，透射电子显微镜观察样品处理前后的结构差异。结果显示，正常家蚕微粒子的外层即孢子外壁表面不光滑，有突起，而纳米银处理过后的家蚕微粒子孢子外壁变得光滑，孢子外壁与孢原质膜之间的透明电子层变厚，同时孢子内部如细胞核、锚定盘、后极泡、极管等结构特征不明显，内容物紊乱(图7)。

设定不同的纳米银孵育时间段，每个时间段的样品分成两份，在样品制片过程中干燥步骤分别采取自然干燥和60℃干燥15min(图8)，检测纳米银作用家蚕微粒子多久后开始出现形态变化。结果显示，在自然干燥的条件下，纳米银孵育1min、3min、10min时，家蚕微粒子的形态与正常家蚕微粒子的形态无明显差别，直到纳米银孵育30min后，部分家蚕微粒子出现局部破裂、干瘪的现象；在60℃干燥的条件下，正常家蚕微粒子呈椭圆形，形态正常，但纳米银孵育1min及更长的时间后，观察到家蚕微粒子全部干瘪。以上结果表明纳米银在接触到家蚕微粒子后就立刻开始作用于孢壁，随着时间的延长，使家蚕微粒子出现破裂、干瘪的现象。

实施例6、纳米银对家蚕微粒子细胞核及蛋白质的影响

根据扫描电子显微镜观察到家蚕微粒子干瘪的状态，猜测纳米银增加了家蚕微粒子孢壁通透性，而导致样品在高温干燥下失去内容物而皱缩。为了验证这一推测，我们对家蚕微粒子的细胞核进行了染色观察。结果显示，正常的成熟家蚕微粒子体内含有双核，而纳米银孵育过后的家蚕微粒子只有少数含有细胞核，大部分未观察到细胞核的存在。同时对纳米银孵育家蚕微粒子后的纳米银上清进行检测，即纳米银充当核裂解液的角色，提取基因组，qRT-PCR结果显示，纳米银孵育家蚕微粒子后的上清中检测到家蚕微粒子的DNA(图9)。以上结果表明，纳米银会增加家蚕微粒子的孢壁通透性，破坏细胞核，释放出家蚕微粒子的遗传物质。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.纳米银在制备抑制家蚕主要病原物家蚕微粒子药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纳米银呈球形，尺寸为3-24nm，晶格间距为0.23nm。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纳米银的有效浓度低于100μg/mL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纳米银由以下方法制备：向硝酸银溶液中加入牛血清蛋白，然后在沸水浴中不断搅拌，并调节pH调至9～11反应30-60min。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述硝酸银溶液的质量分数为1％。

6.纳米银在制备抑制微孢子虫的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述纳米银呈球形，尺寸为3-24nm，晶格间距为0.23nm。

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