CN116158346A - 一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蚕豆的组培领域，具体涉及一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，包括如下步骤：(1)种子消毒：将蚕豆种子用水冲洗干净，消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗，再用酒精浸泡消毒，用无菌水冲洗；(2)无菌苗培养；(3)蚕豆外植体的防褐培养及愈伤组织诱导培养；步骤(1)所述的消毒剂为升汞溶液、过氧化氢溶液或次氯酸钠溶液中的一种；步骤(3)所述的防褐溶液为半胱氨酸溶液、柠檬酸溶液或双蒸水中的一种，所述的方法具有操作简便、消毒剂廉价易得，安全性好，且废液处理容易，绿色环保、蚕豆无菌苗获得率高，品质好、防褐处理过后的外植体褐化率为0，且具有较高的愈伤组织诱导率。
Description
技术领域
本发明涉及蚕豆的组培领域，具体涉及一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法。
背景技术
蚕豆(Vicia faba L.)为粮、菜、饲、药兼用作物。由于其天然异交率高、对非生物胁迫敏感，产量很不稳定。利用常规育种方法进行蚕豆品种改良周期长、效率低。转基因技术具有时间短、见效快的特点，但必须建立高效稳定的再生体系。然而蚕豆离体培养再生体系和遗传转化体系建立困难，国内外已有的相关蚕豆组织培养的研究结果还停留在十多年前，普遍存在外植体的褐化严重、污染率高、愈伤组织诱导低、重复性差等问题，严重制约着转基因技术在蚕豆遗传改良中的应用。
国内蚕豆组织培养始于上世纪八十年代，对于种子消毒方法、无菌苗及外植体防褐化处理的研究较少。黄德俐等[1]在1985年蚕豆子叶愈伤组织诱导中，并没有涉及到褐化现象，其外植体种子仅利用酒精消毒，但污染率较高；潘重光等[2]在1986年报道了不同激素对蚕豆叶片离体培养的影响，并未提到外植体的消毒与防褐化处理方法；许冬瑾等[3]发表专利：一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其消毒步骤复杂，所用的升汞消毒剂安全性低且有残留难除去；刘素英等[4]2010年研究了蚕豆不同外植体、培养基、基因型及放置方式对不定芽诱导效果的影响，未对外植体褐化现象研究，且用升汞消毒安全性低且有伤害；汪秀峰[5]在蚕豆组织培养的诱导培养基中加入聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinglpyrrolidone，PVP)，外植体的“抗褐”能力增强；屈巧玲等[6]在2005年发现培养基中添加0.5g/L的活性炭(Activated Charcoal，A.C.)，对外植体的褐化有一定程度的抑制。唐惕等[7]在蚕豆上胚轴愈伤组织的生长中，用液体培养基洗涤切口可减轻组织的褐化程度。
本发明旨在提供一种操作简便，消毒剂安全有效易除去，且对植物和人均无害的，保证蚕豆种子发芽长成无菌苗的培养方法；以及防止蚕豆无菌苗外植体褐化的愈伤组织诱导培养方法。
[1]黄德琍，潘重光，陈德鑫，赵则胜.蚕豆子叶愈伤组织的诱导和植株再生的研究简报[J].上海农学院学报，1984(02):114.
[2]潘重光,赵则胜,赵长生,陈德鑫.不同激素浓度组合对蚕豆(Vicia faba)叶片离体培养的影响[J].上海农学院学报，1986(02):107-113.
[3]许冬瑾,严新,顾晓波,杜永魏.一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法[P].云南：CN108260529A，2018-07-10.
[4]刘素英,刘洋.蚕豆组织培养再生植株的研究[J].安徽农业科学,2010,38(08):3909-3910+3913.
[4]汪秀峰.植物组织培养“抗褐”之初探[J].安徽农业科学，1999(04):325-326.
[5]屈巧玲,胡润田,康诗腾,许凌波,王亦菲,陆瑞菊.蚕豆快繁体系的构建及抗逆性研究[C]//.全国作物生物技术与诱变技术学术研讨会论文摘要集,2005:119.
[7]唐惕,毛慧珠.蚕豆上胚轴愈伤组织的生长和分化(简报)[J].实验生物学报，1982(01):105-111.
发明内容
本发明旨在提供一种操作简便，安全有效，条件稳定且保证蚕豆种子发芽长成无菌苗的培养方法及无菌苗外植体防止褐化诱导愈伤组织的方法。
在蚕豆组织培养过程中，由于外植体内的多酚氧化酶被激活，使细胞中的酚类物质氧化转变成棕褐色的醌类物质，不仅使外植体和培养基呈褐色，而且抑制其他酶的活性，严重影响外植体正常的生长和脱分化，甚至导致死亡。
查阅资料发现，蚕豆组织培养相关研究几乎都是将外植体直接消毒后进行接种操作，或是将种子消毒萌发后选取胚的部分做外植体，并没有将种子培养成无菌苗之后从无菌苗上选取外植体的案例。
本发明提供一套从蚕豆种子消毒、萌发、接种到长成无菌苗，后从无菌苗上选取外植体，再到易褐化外植体的处理方法。具体如下：
一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，包括如下步骤：
(1)种子的消毒：将蚕豆种子用水冲洗干净，消毒剂消毒，用无菌水冲洗，再用酒精浸泡消毒，用无菌水冲洗；
(2)无菌苗培养：将步骤(1)得到的蚕豆种子置于18～25℃无菌环境中用无菌水浸泡36h(每8h更换一次无菌水)，使其吸水膨胀后，将种皮剥去，横平放置接种于MS培养基上，置于23±2℃黑暗条件中，3d后移入光照环境中，10d后即可长成5～10cm高的蚕豆无菌苗；
(3)蚕豆外植体的防褐化培养：在超净工作台上，从无菌苗上取下所需外植体，放入防褐溶液中浸泡2h，然后用无菌滤纸吸干水分，接种到诱导培养基上，置于20±2℃黑暗环境中，即可长出愈伤组织；
步骤(1)所述的消毒剂为升汞溶液、过氧化氢溶液或次氯酸钠溶液中的一种；步骤(3)所述的防褐溶液为半胱氨酸溶液、柠檬酸溶液或双蒸水中的一种，步骤(3)所述的诱导培养基为MS+植物生长激素；激素浓度及名称为：0.5～4mg/L2,4-D；0.3～2.1mg/L6-BA。
优选的，步骤(1)所述的消毒剂为0.05～0.15％升汞溶液、5～15％过氧化氢溶液或5～10％次氯酸钠溶液中的一种。
优选的，步骤(1)所述的消毒剂为5～15％过氧化氢溶液，消毒时间为5-15min。
优选的，步骤(1)所述的消毒剂为10％过氧化氢溶液，消毒时间为10min。
优选的，步骤(3)所述的防褐溶液为0.1g/L半胱氨酸溶液。
优选的，步骤(3)所述的防褐溶液为0.1g/L半胱氨酸溶液，浸泡时间为0.5～3h。
优选的，步骤(1)所述的酒精浓度为75％，消毒时间为30s。
优选的，步骤(2)所述的光暗交替为：16h/8h(光照/黑暗),25℃/18℃(白天/黑夜)，光照强度2000Lx；MS培养基中含有3％蔗糖+0.7％琼脂。
优选的，步骤(3)所述的外植体包括茎和叶。
本发明的有益效果是：1、操作简便。
2、消毒剂价格实惠，安全性好，且废液处理容易，绿色环保。
3、蚕豆无菌苗获得率高，质量好。
4、防褐处理过后的外植体褐化率为0，且具有较高的愈伤组织诱导率。
附图说明
图1为本发明中金蚕3号种子经10％过氧化氢溶液消毒10min(A14处理)后，无菌水浸泡
激活后接种到MS培养基上所得；
图2为本发明中黑暗培养3d的金蚕3号无菌苗；
图3为本发明中移入光照培养(16h/8h,光照/黑暗)2d后的金蚕3号无菌苗；
图4为本发明中临蚕13号种子经自来水浸泡激活后，以5％次氯酸钠溶液消毒5min(A27处理)后，接种到MS培养基上3d后所得；
图5为本发明中以金蚕3号无菌苗茎段为外植体，经0.1g/L半胱氨酸溶液浸泡1h(C1处理)后，接种到诱导培养基上20d后所得；
图6为本发明中以金蚕3号无菌苗茎段为外植体，经1％柠檬酸溶液浸泡5min(C2处理)后，接种到诱导培养基上20d后所得；
图7为本发明中以金蚕3号无菌苗茎段为外植体，经双蒸水浸泡1h(C3处理)后，接种到诱导培养基上20d后所得；
图8为本发明中以金蚕3号无菌苗茎段为外植体，经0.1g/L半胱氨酸溶液浸泡2h(T4处理)后，接种到添加激素2.5mg/L2,4-D及2.4mg/L+6-BA(P32)诱导培养基上20d后所得；
图9为无菌苗培养过程
图10为愈伤组织培养过程
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
临蚕13号：由临夏回族自治州农业科学院选育而成的蚕豆品种，.2019年通过非主要农作物品种登记，登记编号：GPD蚕豆(2019)620002。
以下实施例中，2,4-二氯苯氧乙酸，具有代表性的合成植物生长素(auxin)，是一种生长素类似物，简称2，4-D。在普通的植物生长素定量法中显示有高的活性，但在采用植物生长素标准定量法的燕麦伸长试验中，其效颇低。
以下实施例中，6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，别名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素。
实施例一、无菌苗培养
选取种皮完好、无虫眼的蚕豆干种子；用流动的自来水冲洗5min后，置于超净工作台上，用10％的过氧化氢溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3遍，再用75％酒精浸泡消毒30s，无菌水冲洗3遍。然后在烧杯中将消毒好的蚕豆种子用无菌水浸泡，置于18～25℃无菌环境中浸泡36h(浸泡期间每8h更换一次无菌水)，使其充分吸水膨胀。将浸泡后充分吸水的种子剥去种皮，弃掉子叶开裂的次级种子。挑选充分吸水且子叶完好的蚕豆种子，横平放置(如图1所示)接种于MS培养基上，每瓶接种1粒(防止交叉污染)。置于23±2℃黑暗环境中，d后(如图2所示)移入光照培养，光周期16h/8h(光照/黑暗)，昼夜温度(25℃/8℃)和光照强度2000lx的环境中培养。10d后即可长成5～10cm高的蚕豆无菌苗。以下为具体方法筛选过程：
1.试验材料及处理
试验材料为临蚕13号、金蚕3号两个品种。金蚕3号购自甘肃省酒泉市科丰种苗有限责任公司；临蚕13号，由甘肃省临夏州农科院蚕豆研究所提供。
试验处理分为两个阶段：第一阶段(表1)以不同消毒剂(升汞、过氧化氢、次氯酸钠)及消毒剂的处理时间、浓度分别设计，共27个处理，每个处理设三个重复(每个重复接种20粒)。第二阶段(表2)以第一阶段筛选出的处理再进一步优化设计，共6个处理，每个处理3个重复(每个重复处理接种60粒)。
表1第一阶段消毒处理
表2第二阶段消毒处理
2.先自来水浸泡激活种子，后消毒处理
选取种皮完好、无虫眼的临蚕13号、金蚕3号干种子；用流动的自来水冲洗5min后，分别用自来水在烧杯中置于18～25℃环境中浸泡36h(浸泡期间每8h更换一次自来水)，使其充分吸水膨胀。然后移于超净工作台上，依照表1分别进行消毒处理，后用无菌水冲洗3遍，再用75％酒精浸泡消毒30s，再用无菌水冲洗3遍。后将消毒好的种子分别剥去种皮，弃掉子叶开裂的次级种子。挑选充分吸水且子叶完好的种子，横平放置(如图1所示)接种于MS培养基(3％蔗糖+0.7％琼脂)上，每瓶接种1粒(防止交叉污染)。置于23±2℃黑暗环境中，3d后移入光照强度2000lx，光周期16h/8h，温度25℃/18℃(白天/夜晚)环境中。10d后分别统计污染率、发根率、发芽率及成苗率。
污染率(％)＝污染种子数/接种的总种子数×100％
发根率(％)＝发根种子数/接种的总种子数×100％
发芽率(％)＝发芽种子数/接种的总种子数×100％
成苗率(％)＝成苗种子数/接种的总种子数×100％
试验数据采用Excel2020整理，后用IBMSPSSStatistics25进行单因素方差分析与Duncan氏新复极差法(LSR)进行多重比较分析。分析了不同处理对蚕豆无菌苗生长过程中的污染率、发根率、发芽率以及无菌苗成苗率的差异显著性影响(α＝0.05)。所有分析结果用平均值和标准误来表示。
表3先浸泡后消毒的临蚕13号发育情况
注：同一列不同小写字母表示不同处理之间的显著性差异(α＝0.05)。下同
表4先浸泡后消毒的金蚕3号发育情况
临蚕13号的结果如表3所示，金蚕3号的结果如表4所示。通过统计数据分析可知，先用自来水浸泡激活种子，后消毒处理的这种步骤下，临蚕13号、金蚕3号皆表现为：①次氯酸钠溶液处理的种子污染率高、成苗率低，其中A27(5min；次氯酸钠溶液；5％)污染率最高、成苗率最低(如图4所示)；②次氯酸钠溶液处理的种子发芽率普遍低，其中A16(10min；次氯酸钠溶液；10％)发芽率最低；③升汞溶液处理的种子污染率低，但会影响发根率和发芽率，且对发根率的影响更大，最终成苗率不高；④过氧化氢溶液处理的种子污染率偏低，也会影响发根率和发芽率，且对发根率的影响更大，但总体影响小于升汞的影响，最终成苗率高。
总之，先自来水浸泡激活种子，后消毒处理的这种步骤，消毒剂对种子发根发芽的影响较大，影响最终成苗率。不同消毒剂效果表现为，污染率：升汞＜过氧化氢＜次氯酸钠。成苗率：过氧化氢＞升汞＞次氯酸钠。消毒剂处理时间越长、浓度越大，对发根发芽的影响越大。
3.先消毒处理干种子，后无菌水浸泡激活
选取种皮完好、无虫眼的临蚕13号、金蚕3号干种子；用流动的自来水冲洗5min后，置于超净工作台上，依照表1分别进行消毒处理，后用无菌水冲洗3遍，然后用75％酒精浸泡消毒30s，再用无菌水冲洗3遍。然后在烧杯中将消毒好的种子用无菌水浸泡，置于18-25℃无菌环境中浸泡36h(浸泡期间每8h更换一次无菌水)，使其充分吸水膨胀。将浸泡后充分吸水的种子剥去种皮，弃掉子叶开裂的次级种子。挑选充分吸水且子叶完好的种子，横平放置(附图1)接种于MS培养基上，每瓶接种1粒。置于23±2℃黑暗环境中，3d后移入光周期为16h/8h，光照强度2000lx，昼夜温度25℃/18℃的环境中。10d后分别统计污染率、发根率、发芽率及成苗率。
表5先消毒后浸泡的临蚕13号发育情况
表6先消毒后浸泡的金蚕3号发育情况
实验结果如表5和表6所示，通过统计数据分析可知，在先消毒处理干种子，后无菌水浸泡激活的这种步骤下，临蚕13号、金蚕3号皆表现为：①次氯酸钠溶液处理的种子污染率高，其中A27(5min；次氯酸钠溶液；5％)污染率最高；②升汞和过氧化氢溶液处理的种子污染率较低，但升汞消毒后不易除去，对种子发根发芽有影响，导致最终成苗率低于过氧化氢处理；
总之，先消毒处理干种子，后无菌水浸泡激活的这种步骤，消毒剂对种子发根发芽的影响明显降低。筛选出A6、A13、A14、A15、A22、A23这六个优选处理，污染率为0，成苗率100％。
4.优选处理方法，扩大接种数目
已知，从27个处理中，筛选出的A6、A13、A14、A15、A22、A23六个处理方法先消毒干种子，后无菌水浸泡激活，再剥去种皮接种到MS培养基上的蚕豆种子污染率最低、成苗率最高。但由于第一阶段所设计的接种数目较小(每个处理接种20粒)，筛选出的最优消毒剂过氧化氢溶液的处理时间以及浓度尚未明确，所以又设计了第二阶段扩大这六个处理的接种数目(每个处理接种60粒)。
表7第二阶段消毒的种子发育情况
通过统计数据分析可知，A14(10min，过氧化氢溶液，10％)处理的种子消毒效果最好(污染率0)，成苗率最高(临蚕13号成苗率99.61％；金蚕3号成苗率99.83％)。
总体来看，金蚕3号的消毒成苗效果略优于临蚕13号，这受品种本身的基因型限制。
实施例二、外植体防褐化处理
在超净工作台上，从金蚕3号无菌苗上切取茎段，进行防褐化处理，然后用无菌滤纸吸干水分，接种到诱导培养基(MS+激素)上，置于20±2℃黑暗环境中，20d后即可长出愈伤组织。以下为具体方法筛选过程：
1.试验材料及处理
试验材料为上述消毒方法所得到的金蚕3号无菌苗的茎段。
试验处理分为两个阶段：第一阶段以三种不同防褐处理方法设计，共3个处理，每个处理设三个重复(每个重复接种16块)。第二阶段以第一阶段筛选出的处理方法再进一步细化时间设计，共6个处理，每个处理3个重复(每个重复接种30块)。
2.不同防褐处理方法
在超净工作台上，将从金蚕3号无菌苗上切取的茎段分别以C1(0.1g/L半胱氨酸溶液浸泡1h)、C2(1％柠檬酸溶液浸泡5min)、C3(双蒸水浸泡1h)处理后，用无菌滤纸吸干水分，再接种到诱导培养基上，置于20±2℃黑暗环境中，20d后观察记录褐化和长出愈伤组织的情况(表2.2)。
褐化率(％)＝褐化的外植体数/接种的总外植体数×100％
出愈率(％)＝长出愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数×100％
注：0.1g/L半胱氨酸溶液、1％柠檬酸溶液都需用无菌水在无菌环境下配制。试验数据整理分析同上述消毒处理。
表8不同防褐处理方法对外植体褐化及出愈率的影响
通过数据分析可知，C1(0.1g/L半胱氨酸溶液浸泡1h)处理后的外植体，褐化率最低，出愈率最高。
图5为本试验中外植体经C1处理后，接种到诱导培养基上20d后所得；
图6为本试验中外植体经C2处理后，接种到诱导培养基上20d后所得；
图7为本试验中外植体经C3处理后，接种到诱导培养基上20d后所得；
3.不同浸泡时间
在超净工作台上，将从金蚕3号无菌苗上切取的茎段分别在0.1g/L半胱氨酸溶液中浸泡不同时间T1(0.5h)、T2(1h)、T3(1.5h)、T4(2h)、T5(2.5h)、T6(3h)处理后，用无菌滤纸吸干水分，再接种到诱导培养基上，置于20±2℃黑暗环境中，20d后观察记录褐化情况；分别在20d、30d、40d记录长出愈伤组织的情况。
表9.0.1g/L半胱氨酸溶液浸泡不同时间对外植体褐化及出愈的影响
通过数据分析可知，T4(0.1g/L半胱氨酸浸泡2h)处理的外植体(图8)，褐化率最低且出愈率最高、出愈时间最早。
实施例三、愈伤组织诱导
在超净工作台上，取经过上述T4防褐处理的外植体，用无菌滤纸吸干水分，接种到不同浓度激素配比的诱导培养基(MS)上，置于20±2℃黑暗环境中，20d后观察记录愈伤组织情况。以下为具体方法筛选过程：
1.试验材料及处理
试验材料为上述防褐化方法所得到的金蚕3号茎段。
试验处理为不同浓度2,4-D和6-BA配比的诱导培养基。基本培养基为MS培养基。2,4-D浓度为0.5-4mg/L，每0.5mg设一个梯度，共8个梯度；6-BA浓度为0.3-2.1mg/L，每0.3mg设一个梯度，共8个梯度；两种激素正交设计，共64个处理，每个处理3个重复(每个重复10瓶诱导培养基，每瓶接种4块外植体，共40块外植体)。
出愈率(％)＝长出愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数×100％
表10不同浓度激素浓度配比对出愈率的影响
通过数据分析可知，生长素类激素2,4-D的浓度在0.5～4mg/L，细胞分裂素类激素6-BA的浓度在0.3～2.1mg/L，以经过防褐处理的蚕豆茎段为外植体，均可以成功诱导出愈伤组织，且生长素类激素浓度与细胞分裂素类激素浓度的比值接近1的时候，愈伤组织的诱导率更高。
图8为本试验中外植体经实施例二中T4防褐化处理后，接种到P32(2.5mg/L2,4-D及2.4mg/L6-BA)诱导培养基上20d后所得。
图9为无菌苗培养过程，图10为愈伤组织培养过程。
综上所述，本发明提供了一种蚕豆无菌苗及外植体防褐化的愈伤组织培养方法，所述的方法使用的消毒剂廉价易得，安全性好，且废液处理容易，绿色环保，操作简便。蚕豆无菌苗获得率高，品质好。防褐处理过后的外植体褐化率为0，且具有较高的愈伤组织诱导率。
Claims (9)
1.一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子的消毒：将蚕豆种子用自来水冲洗干净，消毒剂消毒，用无菌水冲洗，再用酒精浸泡消毒，无菌水冲洗；
(2)无菌苗培养：将步骤(1)得到的蚕豆种子置于18-25℃无菌环境中用无菌水浸泡36h，使其吸水膨胀后，将种皮剥去，横平放置接种于MS培养基上，置于23±2℃黑暗培养，3d后移入光照2000lx，光周期16h/8h，23±2℃培养，10d后即可长成高5-10cm的蚕豆无菌苗；
(3)蚕豆外植体的防褐化培养：在超净工作台上，从无菌苗上取下所需外植体，放入防褐溶液中浸泡2h，然后用无菌滤纸吸干水分，接种到诱导培养基上，置于20±2℃黑暗中诱导，即可长出愈伤组织；
步骤(1)所述的消毒剂为升汞溶液、过氧化氢溶液或次氯酸钠溶液中的一种；步骤(3)所述的防褐溶液为半胱氨酸溶液、柠檬酸溶液或双蒸水中的一种，所述的诱导培养基为MS+植物生长激素；激素名称及浓度为：0.5～4mg/L 2,4-D,0.3～2.1mg/L 6-BA。
2.如权利要求1所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(1)所述的消毒剂为0.05～0.15％升汞溶液、5～15％过氧化氢溶液或5～10％次氯酸钠溶液中的一种。
3.如权利要求2所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(1)所述的消毒剂为5～15％过氧化氢溶液，消毒时间为5-15min。
4.如权利要求3所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(1)所述的消毒剂为10％过氧化氢溶液，消毒时间为10min。
5.如权利要求1所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的防褐溶液为0.1g/L半胱氨酸溶液。
6.如权利要求5所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的防褐溶液为0.1g/L半胱氨酸溶液，浸泡时间为0.5～3h。
7.如权利要求1所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(1)所述的酒精浓度为75％，浸泡消毒时间为30s。
8.如权利要求1所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(2)所述的光照培养：光照强度为2000Lx，光周期为16h/8h，温度为25℃/18℃(白天/黑夜)；MS培养基中含有3％蔗糖+0.7％琼脂。
9.如权利要求1所述的蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的外植体包括茎和叶。
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