CN116144658A - 用于构建神经退行性动物模型的sgRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于构建神经退行性动物模型的sgRNA及其应用。该sgRNA的应用包括利用CRISPR/Cas9技术将供体DNA、Cas9蛋白和合理设计并筛选最优的sgRNA引入非人哺乳动物的受精卵中，以获得工程化改造的受精卵；将所述工程化改造的受精卵移植到所述非人哺乳动物的雌性个体，并生产出G0代个体；和使所述G0代个体杂交至少1代，从而获得所述神经退行性疾病基因敲入模型。该模型区别于传统的转基因模型，能够客观真实地反映神经退行性疾病的临床症状、病理特征以及内在的分子机制，从而有利于筛选有效治疗神经退行性疾病的药物。

Description

用于构建神经退行性动物模型的sgRNA及其应用

技术领域

本申请涉及生物医学领域，更具体地，涉及一种用于构建神经退行性动物模型的sgRNA及其应用。

背景技术

肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶退化症(FTLD)是两种严重的神经退行性疾病。TDP-43处于疾病相关通路中重要节点位置，其蛋白错误定位和聚集的病理特性是诱发神经元病变死亡的直接原因，也是两种神经退行性疾病的标志性病理特征。传统构建动物模型是把人的突变基因通过转基因方式直接转入小鼠体内构成的转基因小鼠模型，但目前对于能够准确获得TDP-43突变并客观真实反应神经退行性疾病的临床症状、病理特征以及内在的细胞分子机制的TDP-43突变基因敲入模型存在迫切需求。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的实施例提出了用于构建神经退行性动物模型的分离的核酸及其应用。

一方面，本发明的实施例提供了一种分离的核酸，该分离的核酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明的实施例提供了如第一方面的实施例所述的分离的核酸在构建神经退行性动物模型中的用途，包括利用CRISPR/Cas9技术将供体DNA、Cas9蛋白和sgRNA引入非人哺乳动物的受精卵中，生产出G0代个体后杂交至少1代，从而获得神经退行性动物模型，其中供体DNA来自TDP-43-A315T蛋白突变体的核苷酸序列，sgRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，工程化改造的受精卵包含基于野生型Tardbp(TDP)等位基因的突变Tardbp等位基因，突变Tardbp等位基因编码包含315位苏氨酸T而不是野生型的315位丙氨酸A的TDP-43-A315T蛋白。

在一些实施方案中，供体DNA从5'端至3'端依次包含第一同源臂、编码315T的3个核苷酸和第二同源臂，其中所述编码315T的3个核苷酸选自ACG、ACA、ACC和ACT，优选ACC。

在一些实施方案中，sgRNA中包含PAM序列，所述PAM序列为TGG。

在一些实施方案中，供体DNA包含限制性内切酶位点KpnI。

在一些实施方案中，非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、犬、小型猪、非人灵长类动物，优选为C57BL/6J野生型小鼠。

在一些实施方案中，使G0代个体杂交3-6代。

在一些实施方案中，神经退行性动物模型为肌萎缩性脊髓侧索硬化症ALS模型和额颞叶退化症FTLD模型。

在一些实施方案中，神经退行性动物模型表现出后肢力量减弱、运动学习能力缺陷、运动神经元死亡或退化中的一种及以上的症状。

在一些实施方案中，神经退行性动物模型为突变敲入小鼠和/或分离自所述突变敲入小鼠的组织或细胞。

在一些实施方案中，所述神经退行性动物模型或其后代用于筛选ALS或FTLD相关疾病的药物。

利用根据本发明实施方案中提供的sgRNA构建的神经退行性动物模型具有以下有益效果：

制备出的模型能够客观真实地反映神经退行性疾病的临床症状、病理特征以及内在的分子机制，从而有利于筛选有效治疗神经退行性疾病的药物。神经退行性动物模型中TDP-43蛋白没有出现过量表达，该特征区别且优于传统TDP-43转基因ALS模型。

本发明实施方案的附加方面和优点将在以下描述中部分地给出，部分从以下描述中变得明显，或者从本公开的实施方案的实践中得知。

附图说明

图1是显示了根据本发明实施例的构建神经退行性动物模型的方法的示意图，其中(a)示出了人的TDP-43蛋白在甘氨酸富集区308-320位氨基酸在不同物种中的保守性；(b)示出了A315T点突变敲入模型的实验设计，其中第一行序列中下划线表示引导Cas9蛋白进行特异序列识别的20bp长度的sgRNA(tagcattaacccagcgatga)和PAM序列(TGG)；第二行序列是供体DNA，其中编码315位丙氨酸(A)的核苷酸gct被突变为编码苏氨酸(T)的核苷酸acc，由此产生限制性内切酶位点(KpnI)。

图2是显示了根据本发明一个实施例的神经退行性动物模型的基因型鉴定结果示意图，(a)示出了A315T点突变敲入小鼠稳定遗传系的PCR产物测序结果，DNA序列由编码丙氨酸(A)的GCT突变为编码苏氨酸(T)的ACC，+/+代表野生型，T/T代表纯合子突变型；(b)示出了PCR产物的酶切鉴定结果，在不加KpnI限制性内切酶时，所有基因型均显示一条未切割条带(300bp)；在加KpnI酶时，野生型仅显示一条未切割条带(300bp)，杂合子突变型显示一条未切割的条带(300bp)和一条突变后被切割的条带(100bp)，纯合子突变型仅显示一条突变后被切割的条带(100bp)。

图3是显示了根据本发明一个实施例的神经退行性动物模型中TDP-43蛋白在不同组织中的表达水平的结果示意图，+/+代表野生型，T/T代表纯合子突变型，GAPDH为内参。

图4是显示了根据本发明一个实施例的神经退行性动物模型小鼠的旷场实验行为学结果示意图。

图5是显示了根据本发明一个实施例的神经退行性动物模型小鼠的加速转棒仪行为学结果示意图，图左为4.5个月时加速转棒仪测试统计图，右为7.5个月的时加速转棒仪测试统计图。

图6是显示了根据本发明一个实施例的神经退行性动物模型小鼠脊髓运动神经元计数，左图显示小鼠脊髓切片中ChAT抗体的免疫荧光染色，绿颜色大胞体为脊髓前角中特异性标记的运动神经元，标尺长度为100微米；右图显示野生型和纯合子突变型小鼠脊髓前角运动神经元计数后的统计分析结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶退化症(FTLD)是两种严重的神经退行性疾病。肌萎缩性脊髓侧索硬化症是由于大量运动神经元死亡导致患者表现出渐进式的肌肉萎缩和运动功能丧失的疾病，确诊后的平均生存期仅为～2-5年。额颞叶退化症是仅次于阿尔兹海默症的一种早发性痴呆症(发病可早于65岁)，由于患者的部分脑区出现严重病变和萎缩，会表现出不同程度的行为异常，如社交行为障碍、语言交流障碍等，造成严重的家庭和社会负担。

TDP-43是重要的RNA结合蛋白，参与了RNA的各种代谢调控，其蛋白的功能缺失或获得性蛋白毒性在神经退行性疾病的发病过程中扮演了重要角色，以往基于TDP-43的动物模型大多是转基因模型，包括TDP-43的野生型和各种突变体在酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、啮齿动物以及非人类灵长动物等模式生物上构建的模型。

在神经退行性疾病的机理研究和相应药物筛选过程中，发明人发现现有的TDP-43-A315T的转基因模型由于是通过外源插入携带强启动子的致病基因使其在模式生物体内过表达，具有以下缺陷：1)启动子太强导致转入致病基因的表达水平远远高于内源性水平；2)随机插入可能扰乱基因组内部重要的基因或调控原件；3)转基因模型一般转入的是野生型或突变型的人类致病基因的cDNA，因此无法反映致病基因本身的剪切和拼接过程，只能反映蛋白水平的问题；4)在有些转基因模型中，即使过表达野生型的基因都能看到严重的疾病表型，不能反映基因突变的致病机理。基于此，发明人尝试利用CRISPR/Cas9技术并合理设计该sgRNA成功地将A315T突变准确定点敲入动物模型，杂交并进行基因型鉴定后获得了真正意义上的神经退行性动物模型。

利用本发明实施例提供的方法获得的神经退行性动物模型中A315T点突变并没有导致TDP-43蛋白表达水平的明显变化，这有利于反映基因突变而不是基因过表达导致的ALS或FTLD临床症状、病理特征以及内在的细胞分子机制，也对疾病发生和发展过程中的TDP-43致病机理研究，新的治疗手段开发具有重要意义。

实施例

实施例1

Cas9核酸酶通过携带sgRNA(small guide RNA)对特异性的DNA序列进行识别、切割，双链断裂的DNA通过各种机制进行DNA断裂修复，其中有一定的概率通过同源重组的途径实现修复，一旦供体DNA中含有DNA断裂处两侧的相同序列(同源臂)，就可能被重组到基因组断裂的位置，完成修复过程。此外，供体DNA除了包含同源重组臂之外，还应该包含被突变的密码子，这样，当供体DNA被重组至基因组断裂位置时，点突变也被敲入到相应的位点，实现了突变位点定点敲入模型的构建。

1.1选择TDP-43突变位点，针对人的TDP-43蛋白在甘氨酸富集区308-320位氨基酸进行在不同物种中的保守性分析，如图1(a)所示，A315位点的保守性很高，因此选择TDP-43-A315T突变点。

1.2合理设计sgRNA及供体DNA

(1)通过比较基因敲入成功率，确定合理设计的sgRNA序列(tagcattaacccagcgatga(SEQ ID NO:1)，20bp)以及识别过程中的重要PAM序列TGG(图1(b))。

a.基于TDP基因设计sgRNA，获得基于经验合理设计的sgRNA1至4和基于CRISPick数据库设计的sgRNA5至8。

b.将sgRNA1至4和sgRNA5至8分别与供体DNA、Cas9蛋白引入小鼠受精卵内培养胚胎。

c.提取胚胎细胞相应的DNA，获得正确基因敲入的小鼠胚胎能够根据转入的KpnI位点进行酶切。

d.使用KpnI酶处理后的DNA用于电泳。获得正确基因敲入的小鼠对应DNA电泳图中会出现被切割后的一条条带，位于100bp处，如图2(b)。统计正确敲入的小鼠胚胎数以及总胚胎数，计算基因敲入成功率。

在实际的基因编辑实现过程中，我们首先是利用了CRISPick数据库针对小鼠TDP-43基因的A315位点设计了sgRNA5至8(表2)，设计gRNA是否能够高效完成基因编辑的判断标准为剪切效率高且尽可能接近突变位点。虽然sgRNA5至8的评分和剪切效率是在A315位点100bp以内最高的，然而实际的基因编辑成功率非常低(表2)。在这种情况下，根据经验又重新合理设计了4条CRISPick数据库未推荐的sgRNA1至4，并进行了编辑效率的检测。由下表1与表2可见，在基于经验合理设计的sgRNA1至4和基于CRISPick数据库设计的sgRNA5至8中，sgRNA1指导下获得的正确基因敲入小鼠胚胎数量最多，其基因敲入成功率高达76.9％，明显高于其他sgRNA均低于11％的基因敲入成功率。因此，sgRNA1是一条特殊且高效的针对TDP-43特定突变位点基因敲入的sgRNA。

表1

表2

(2)供体DNA依次包含第一同源臂、编码315T的3个核苷酸和第二同源臂，还包含了敲入突变点后新产生的限制性内切酶酶切位点KpnI(图1(b))。

1.3受精卵经显微注射供体DNA、Cas9和sgRNA后移植到雌鼠体内，生下第0代小鼠(G0)。

1.4由于注射的局部均一性差异以及受精卵原核期的差异等因素，G0代小鼠理论上为嵌合体，因此需要进行杂交一代至G1代获得稳定遗传的品系。

1.5对突变点附近进行PCR测序鉴定，确证密码子由GCT成功突变为ACC，并且产生了新的酶切位点KpnI，如图1(b)、图2(a)。

1.6对PCR产物进行酶切鉴定，发现杂合子加KpnI酶后表现出野生型未切割的条带一条(300bp)和突变型被切割后的条带一条(100bp)，而纯合子加酶后只表现出突变型切割后的一条条带(100bp)，进一步证明了突变点的成功插入，如图2(b)。

1.7通过G1代的筛选和基因型鉴定，获得一个突变点敲入正确的可稳定遗传的神经退行性动物模型。

实施例2

2.1用蛋白免疫印迹的方法对构建的A315T点突变敲入模型进行蛋白表达水平的研究，比较了2.5个月鼠龄的野生型和纯合子突变型中TDP-43蛋白在不同组织中的表达情况。

结果显示，A315T点突变并没有导致TDP-43蛋白表达水平的明显变化(图3)。在以往TDP-43-A315T转基因小鼠模型的报道中，TDP-43的蛋白表达水平比内源性水平高了几倍甚至十几倍(Iga Wegorzewska,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2009Nov 3；106(44):18809–18814)，这种外源蛋白的过量表达是非生理性的，经常会引起很多人工伪表型，而本发明中的基因敲入模型保留了TDP-43蛋白的正常表达。因此说明基因突变敲入小鼠模型区别且优于转基因模型。

此外，通过初步比较TDP-43在不同组织中的表达情况发现，蛋白在肌肉组织中的表达量最低，而在肝脏和脾脏中的表达量相对较高，中枢神经系统(如大脑和脊髓)中的表达量处于中等水平，而脊髓中的表达量相对较低。虽然TDP-43蛋白在中枢神经系统中的表达量并不是最高，但是TDP-43的突变大多引起神经退行性疾病而非表达量较高的组织病变(如心脏、肝脏、脾脏)，说明蛋白在中枢神经系统中具有特异性的重要功能，一旦这些功能失常，很容易诱发神经系统病变。

2.2通过旷场试验检测小鼠的站立次数来分析其后肢力量。小鼠被放在旷场箱内自由活动10分钟，视频记录后经软件分析小鼠的运动轨迹。实验分析了小鼠后脚站立次数，用来反映其后肢力量。

如图4所示，通过检测4.5和7.5个月年龄的小鼠，发现随着年龄的增加，所有基因型小鼠的后脚站立次数都有所下降，说明在衰老的过程中后肢力量都在衰减。具体来，4.5个月时，杂合子和纯合子突变小鼠的后脚站立次数和野生型比较都出现了显著的减少(p<0.05)，而7.5个月时，两个突变型小鼠比野生型小鼠表现出更加严重的下降(p<0.005)，说明随着年龄的增长，A315T突变小鼠比野生型表现出更加严重的后肢力量减弱。

2.3通过加速转棒仪测试小鼠运动学习能力。使小鼠在一定高度的旋转棒上行走，并随旋转棒一起加速。由于小鼠有恐高症，悬空会刺激小鼠努力运动而不会滑落直到力竭，通过连续几天的测试来衡量小鼠的运动学习能力，即在旋转棒上的运动时间越长运动学习能力越强。

如图5所示，4.5个月时，杂合和纯合突变小鼠与野生型比较，在第二天就表现出了转棒仪运动时间的降低，虽然没有表现出显著性差异，但到第四天测试时纯合突变体与野生型比较出现了运动持续时间的显著性下降。而在7.5个月测试时，纯合突变小鼠在第三天就表现出了显著的运动学习能力缺陷，第四天表现出更加严重的问题。

2.4对小鼠进行运动神经元计数。截取了两年龄小鼠腰椎部第二腰椎到第五腰椎段脊髓进行连续切片，每段脊髓切片17-19张进行ChAT抗体染色，特异性标记运动神经元并进行数量统计。每只小鼠统计得到的所有运动神经元数量除以切片数量得到每张切片中运动神经元的平均数量，每个基因型统计三只小鼠，以此来反映运动神经元死亡或退化情况，

如图6所示，两年龄小鼠中，A315T纯合突变体小鼠的运动神经元数量和野生型小鼠比较出现了显著的降低。

综合以上行为学测试以及运动神经元计数结果，突变型小鼠已经出现了神经退行性疾病发病的行为和病理特征，如ALS，虽然没有造成小鼠的寿命受损，但这些特征表明TDP-43-A315T点突变的敲入小鼠模型能够用于研究TDP引起ALS的疾病机制研究，以及阻断TDP43病理特征的药物的药效检测。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。

在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸在构建神经退行性动物模型中的用途，其特征在于，包括：

利用CRISPR/Cas9技术将供体DNA、Cas9蛋白和sgRNA引入非人哺乳动物的受精卵中，以获得工程化改造的受精卵；

将所述工程化改造的受精卵移植到所述非人哺乳动物的雌性个体，并生产出G0代个体；和

使所述G0代个体杂交至少1代，从而获得所述神经退行性动物模型，

其中所述供体DNA来自TDP-43-A315T蛋白突变体的核苷酸序列，

其中所述sgRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，

其中所述工程化改造的受精卵包含基于野生型Tardbp等位基因的突变Tardbp等位基因，

其中所述突变Tardbp等位基因编码包含315位苏氨酸T而不是野生型的315位丙氨酸A的TDP-43-A315T蛋白。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述供体DNA从5'端至3'端依次包含第一同源臂、编码315T的3个核苷酸和第二同源臂，其中所述编码315T的3个核苷酸选自ACG、ACA、ACC和ACT。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述sgRNA下游连接PAM序列，所述PAM序列为TGG。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述供体DNA包含限制性内切酶位点KpnI。

6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、兔、犬、小型猪、非人灵长类动物。

7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，使所述G0代个体杂交3-6代。

8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述神经退行性动物模型为肌萎缩性脊髓侧索硬化症ALS模型或额颞叶退化症FTLD模型。

9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述神经退行性动物模型为突变敲入小鼠和/或分离自所述突变敲入小鼠的组织或细胞。

10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述神经退行性动物模型或其后代用于筛选ALS或FTLD相关疾病的药物。

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