CN116334138A - 一种囊性纤维化小鼠模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及动物模型构建的技术领域，具体公开了一种囊性纤维化小鼠模型及其构建方法和应用。上述小鼠模型的构建方法如下：通过对比人CFTR基因和鼠Cftr基因的同源性，确认人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点；将确认的变异位点通过CRISPR/Cas9技术作用于鼠受精卵，对鼠Cftr基因进行修饰，获得F0代小鼠；筛选出阳性F0代小鼠；继续传代，获得囊性纤维化小鼠模型。以及利用上述构建方法获得的囊性纤维化小鼠模型以及其在制备用于治疗CF的药物的过程中的应用。本申请构建的囊性纤维化小鼠模型针对中国人特有的CFTR基因变异类型，有望成为中国特有基因型CF患者的药物筛选平台。
Description
技术领域
本申请涉及动物模型构建的技术领域，更具体地说，涉及一种囊性纤维化小鼠模型及其构建方法和应用。
背景技术
囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是导致体内黏液变得更黏稠的遗传性疾病。人体内黏液的累积会导致人体的许多器官出现问题，尤其是肺部和胰腺的病变，另外，囊性纤维化患者还可能出现严重的呼吸问题、营养问题、消化问题以及发育问题。囊性纤维化一般会逐渐加重，良好的习惯以及必要的治疗措施，可以有效延长患者的寿命。CF动物模型是常见的研究CF治疗措施的平台，可用于治疗CF的药物筛选。
CF是由于CFTR双等位基因变异导致的常染色体隐性遗传病，是高加索人种最常见的常染色体隐性遗传病之一。目前，已经发现超过2000种CFTR基因变异，但是鲜有中国患者报道。研究发现，中国人的CFTR基因型与欧美人常见的CFTR基因型差异较大。欧美人中，70%以上的CFTR基因变异是F508del，也是人类最常见的CF突变基因，但这种CFTR基因变异在中国人中却很罕见。而在中国人中，最常见的CFTR基因变异是p.Gly970Asp（简称G970D），发生的频率约10%，但这种CFTR基因变异不见于欧美人。
然而，一方面，目前CF动物模型包括的CFTR基因变异有F508del、G551D、G480C、R117H等，但上述类型均为欧美人中常见的CFTR基因变异类型，故以上CF动物模型仅适用于欧美人中常见的CFTR基因变异类型对应的CF的药物筛选，并不适用于中国人特有的CFTR基因变异类型G970D。另一方面，欧美国家已经研发的针对CFTR功能修复的药物，并不适用于中国人特有的CFTR基因变异。此外，国际通用的CF动物模型为CFTR双等位基因纯合敲除基因模型，该模型无法模拟中国特有的CFTR基因变异类型的特有基因功能，且也没有针对中国特有的CFTR基因变异类型的CF动物模型以用于治疗CF的药物筛选。
中国特有的CFTR基因变异表现出与支气管扩张、胰腺炎以及男性不育等我国的常见病症有相关性。目前，也缺乏针对中国CF患者的临床研究体系和治疗药物的研发。因此，构建针对我国特有的CFTR基因变异类型的CF动物模型具有非常好的应用前景，有利于特异性靶向药物的开发。
发明内容
本申请提供一种囊性纤维化小鼠模型及其构建方法和应用。该囊性纤维化小鼠模型针对中国人特有的CFTR基因变异类型，有望成为中国特有基因型CF患者的药物筛选平台。
第一方面，本申请提供一种囊性纤维化小鼠模型的构建方法，采用如下的技术方案：
一种囊性纤维化小鼠模型的构建方法，具体包括以下步骤：
确认突变位点：通过对比人CFTR基因和鼠Cftr基因的同源性，确认人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点；
基因修饰：将确认的变异位点通过CRISPR/Cas9技术作用于鼠受精卵，对鼠Cftr基因进行修饰，获得F0代小鼠；
小鼠模型的构建：筛选出阳性F0代小鼠；继续传代，获得囊性纤维化小鼠模型。
本模型采用CRISPR/Cas9技术对鼠Cftr基因进行修饰。首先，通过体外转录获得sgRNA，同时利用基因工程手段构建包含目标变异位点的供体DNA片段donor。然后将Cas9蛋白、sgRNA以及donor通过显微注射的方式导入鼠受精卵中，由sgRNA和Cas9蛋白组成的复合物在细胞内形成，并与野生型等位基因中选定的靶位点结合。Cas9蛋白中的一个核酸酶活性位点切割靶向基因序列中的一条链，则会在靶向基因序列中产生单链断裂。在包含目标变异位点（G965D）的供体DNA片段存在的情况下，通过同源DNA重组修复，改变断裂部位的序列，匹配供体DNA片段的序列，从而实现对靶向基因的特定DNA修饰，获得包含目标变异位点（G965D）的靶向等位基因。
通过PCR验证和测序，验证和筛选出F0代阳性小鼠。然后将F0代阳性小鼠与C57BL/6J小鼠交配，从而获得可稳定遗传G965D变异的阳性F1代小鼠模型，即获得囊性纤维化小鼠模型。
本申请构建的模拟人CF疾病的囊性纤维化小鼠模型表现出明显的肠梗阻、生育能力下降、鼻窦炎等多种人CF患者临床表现，且遗传稳定性强。该囊性纤维化小鼠模型的表型与中国特有CF患者的基因型CFTR G970D的疾病表现类似，不仅可以作为中国特有基因型CF患者的药物筛选平台，而且为研究中国特有基因型的CF发病机制以及治疗手段提供经济、简单、可靠的动物模型。
优选地，所述人CFTR基因为人CFTR基因的18个转录本中的任意一种；所述鼠Cftr基因为鼠Cftr基因的6个转录本中的任意一种。
优选地，所述人CFTR基因在Ensembl的登录号为ENST00000003084.10；所述鼠Cftr基因在Ensembl的登录号为ENSMUST00000045706.11；所述人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点为G965D。
优选地，将鼠Cftr基因对应的核苷酸序列的965位点的密码子由GGT变异为GAT。
优选地，所述鼠受精卵的小鼠类型为C57BL/6J小鼠。
第二方面，本申请提供一种利用上述构建方法获得的囊性纤维化小鼠模型。
优选地，所述囊性纤维化小鼠模型表现出肠梗阻。
优选地，所述囊性纤维化小鼠模型表现出鼻窦炎。
第三方面，本申请提供一种囊性纤维化小鼠模型在制备用于治疗CF的药物的过程中的应用。
第四方面，本申请提供一种囊性纤维化小鼠模型构建的用于筛选治疗CF的药物的平台。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1. 本申请提供的囊性纤维化小鼠模型的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术将鼠Cftr 基因G965D致病变异全身性敲入。
2. 本申请提供的囊性纤维化小鼠模型表现出明显的呼吸道轧染、肠梗阻、生育能力下降、鼻窦炎等多种人CF患者临床表现，且遗传稳定性强。该模型在研究中国特有的囊性纤维化基因型的发病机制中提供了动物模型。
3. 本申请提供的囊性纤维化小鼠模型可以用于针对我国特有CFTR基因致病变异（G970D变异）患者的药物筛选。由于该基因型仅见于中国人，不见于高加索人种，因此，目前现有国外药物不适用于国内患者群体。该囊性纤维化小鼠模型的构建为我国特有CFTR基因致病变异（G970D变异）提供了药物筛选的平台。
4. 本申请提供的囊性纤维化小鼠模型的开发，一方面，解决了中国特有CFTRG970D致病变异修复药物研发所需的动物试验中必备的动物试验载体；另一方面，也为开发其他CFTR相关功能异常的治疗提供了小鼠模型。
附图说明
图1为人CFTR-201转录本和鼠Cftr-201转录本对应的碱基序列的部分对比结果。
图2为人CFTR-201转录本和鼠Cftr-201转录本对应的核苷酸序列的部分对比结果。
图3为鼠Cftr-201 G965D定点变异前、后的示意图（其中，深灰色区域为部分鼠Cftr exon17，浅灰色区域为部分鼠Cftr exon18，灰色碱基代表变异位点。第965位氨基酸跨exon17和exon18两个外显子。第965位氨基酸G的密码子GGT变异成GAT，氨基酸变异为D）。
图4为通过CRISPR/Cas9技术对鼠Cftr基因进行修饰的过程示意图。
图5为囊性纤维化小鼠模型变异位点的测序结果。
图6为同窝鼠中纯合鼠（囊性纤维化小鼠模型，右）与同窝鼠中杂合鼠（左）的身长对比结果。
图7为囊性纤维化小鼠模型、同窝鼠中杂合鼠以及野生鼠的体重对比结果（横坐标为日龄（Time/day），纵坐标为体重（Body Weight/g））。
图8为11.5周龄野生鼠的鼻窦MRI（左）与囊性纤维化小鼠模型的鼻窦MRI（右）的对比结果。
图9为囊性纤维化小鼠模型（右）、同窝杂合鼠（中）以及野生鼠（左）的胆囊HE染色的对比结果。
具体实施方式
本申请提供了一种囊性纤维化小鼠模型的构建方法。该构建方法具体包括以下步骤：
（1）确认突变位点：通过对比人CFTR基因和鼠Cftr基因的同源性，确认人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点。
人CFTR基因有18个转录本，鼠Cftr基因有6个转录本。
因此，需要从18个人CFTR基因的转录本中选择合适的转录本，并需要从6个鼠Cftr基因的转录本中选择已择定的人CFTR基因的转录本能够对应的鼠Cftr基因的转录本。
本申请选择转录本的标准是表达的蛋白最多。根据该标准，本申请选择在Ensembl的登录号为ENST00000003084.10的人CFTR基因，在Ensembl的登录号为ENSMUST00000045706.11的鼠Cftr基因。人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点为G965D。
（2）基因修饰：将确认的变异位点通过CRISPR/Cas9技术作用于鼠受精卵，对鼠Cftr基因进行修饰，获得F0代小鼠。
采用CRISPR/Cas9技术对鼠Cftr基因进行修饰。首先，通过体外转录获得sgRNA，同时利用基因工程手段构建包含目标变异位点的供体DNA片段donor。然后将Cas9蛋白、sgRNA以及donor通过显微注射的方式导入鼠受精卵中，由sgRNA和Cas9蛋白组成的复合物在细胞内形成，并与野生型等位基因中选定的靶位点结合。Cas9蛋白中的一个核酸酶活性位点切割靶向基因序列中的一条链，则会在靶向基因序列中产生单链断裂。在包含目标变异位点（G965D）的供体DNA片段存在的情况下，通过同源DNA重组修复，改变断裂部位的序列，匹配供体DNA片段的序列，从而实现对靶向基因的特定DNA修饰，获得包含目标变异位点（G965D）的靶向等位基因。
将鼠Cftr基因对应的核苷酸序列的965位点的密码子由GGT变异为GAT。
本申请中所用的鼠受精卵的小鼠类型为C57BL/6J小鼠。
（3）小鼠模型的构建：筛选出阳性F0代小鼠；继续传代，获得囊性纤维化小鼠模型。
本申请还提供了利用上述构建方法获得的囊性纤维化小鼠模型。该囊性纤维化小鼠模型表现出明显的肠梗阻、生育能力下降、鼻窦炎等多种人CF患者临床表现，且遗传稳定性强。该囊性纤维化小鼠模型不仅可以作为中国特有基因型CF患者的药物筛选平台，而且为研究中国特有基因型的CF发病机制以及治疗手段提供经济、简单、可靠的动物模型。
本申请提供了上述囊性纤维化小鼠模型在制备用于治疗CF的药物的过程中的应用。
本申请提供了一种利用上述囊性纤维化小鼠模型构建的用于筛选治疗CF的药物的平台。
术语解释
1.C57BL/6J小鼠：是一种常见的近交品系实验鼠，在遗传学实验中作为转基因鼠广泛用于模拟人类的基因缺陷性疾病。因其可用作同类系、易于繁殖和体格健壮等特性，是使用范围最广的一支鼠株品种。
2.CRISPR/Cas9技术：是一种基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。主要原理如下：（1）通过将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入一个细胞中，按计划改变靶向基因。sgRNA具有与靶向基因目标序列互补的区域；该区域可设计为任何所需序列。由CRISPR sgRNA和Cas9蛋白组成的复合物在细胞内形成，并与靶向基因中选定的靶位点结合。（2）Cas9蛋白中的两个核酸酶活性位点分别切割靶向基因序列中的两条链（一个核酸酶活性位点作用于一条链），产生双链断裂。双链断裂通常通过非同源末端连接来修复，这样通常会删除或改变连接发生部位的核苷酸。或，Cas9蛋白中的一个核酸酶活性位点失活，仅有一个核酸酶活性位点切割靶向基因序列中的一条链，则会在靶向基因序列中产生单链断裂。在存在与靶向基因序列相同但包含所需变异位点的重组供体DNA片段的情况下，同源DNA重组修复会改变断裂部位的序列，以匹配供体DNA的序列，从而实现对靶向基因的特定DNA修饰。
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种囊性纤维化小鼠模型的构建方法。
上述构建方法具体包括以下步骤：
（1）首先，通过对比人CFTR基因和鼠Cftr基因的同源性，确认鼠Cftr基因上与人G970D基因变异位点对应的变异位点。
本实施例以基因表达的蛋白最多为筛选原则，从18个人CFTR基因的转录本中选择人CFTR-201（在Ensembl的登录号为ENST00000003084.10）作为人CFTR基因，从6个鼠Cftr基因的转录本中选择鼠Cftr-201（在Ensembl的登录号为ENSMUST00000045706.11）作为鼠Cftr基因，来确认人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点。
变异位点的确认过程具体如下：
对比人CFTR-201和鼠Cftr-201的同源性，同源性的对比结果如图1和图2所示。
图1为人CFTR-201转录本和鼠Cftr-201转录本对应的碱基序列的部分对比结果。
图2为人CFTR-201转录本和鼠Cftr-201转录本对应的核苷酸序列的部分对比结果。
人CFTR-201转录本包含27个exons（外显子），翻译起始位点ATG位于exon1，翻译终止位点TAG位于exon27，编码1480aa。
鼠Cftr-201转录本包含27个exons，翻译起始位点ATG位于exon1，翻译终止位点TAG位于exon27，编码1476aa。
由图1和图2可知，通过对比人CFTR-201转录本和鼠Cftr-201转录本的碱基序列，人CFTR-201编码的第2909号碱基G对应鼠Cftr-201编码的第2894号碱基G。根据每3个碱基组成1个密码子，并对应1个核苷酸，可知，人CFTR-201基因c.2909G>A，p.G970D对应鼠Cftr-201基因c.2894G>A, p.G965D。
因此，在鼠Cftr-201的exon18制作G965D定点变异，对应的核苷酸序列的965位点的密码子由GGT变异为GAT。具体如图3所示。
图3为鼠Cftr-201 G965D定点变异前、后的示意图。其中，深灰色区域为部分鼠Cftr exon17，浅灰色区域为部分鼠Cftr exon18，灰色碱基代表变异位点。第965位氨基酸跨exon17和exon18两个外显子。第965位氨基酸G的密码子GGT变异成GAT，氨基酸变异为D。
（2）其次，将确认的变异位点通过CRISPR/Cas9技术作用于鼠受精卵，对鼠Cftr基因进行修饰，获得F0代动物。具体过程如图4所示。
图4为通过CRISPR/Cas9技术对鼠Cftr基因进行修饰的过程示意图。
基因修饰的过程具体如下：
a.分别获得sgRNA（CRISPR sgRNA）和donor。sgRNA通过体外转录的方式获得。通过基因工程手段构建donor，donor为包含目标变异位点的供体DNA片段。
b.然后将Cas9蛋白、sgRNA以及donor通过显微注射的方式导入C57BL/6J小鼠的受精卵中。
结合图4，由sgRNA和Cas9蛋白组成的复合物在细胞内形成，并与野生型等位基因（Wild-type allele）中选定的靶位点结合。Cas9蛋白中的一个核酸酶活性位点切割靶向基因序列中的一条链，则会在靶向基因序列中产生单链断裂。在包含目标变异位点（G965D）的供体DNA片段存在的情况下，通过同源DNA重组修复，改变断裂部位的序列，匹配供体DNA片段的序列，从而实现对靶向基因的特定DNA修饰，获得包含目标变异位点（G965D）的靶向等位基因（Targeted-type allele）。
通过培育基因修饰后的受精卵，从而获得F0代小鼠。
（3）小鼠模型的构建。
通过PCR验证和测序，验证和筛选出F0代阳性小鼠。然后将F0代阳性小鼠与C57BL/6J小鼠交配，从而获得可稳定遗传G965D变异的阳性F1代小鼠模型，即获得囊性纤维化小鼠模型。
对获得的囊性纤维化小鼠模型的变异位点进行测序，结果如图5所示。
图5为囊性纤维化小鼠模型变异位点的测序结果。
如图5所示，囊性纤维化小鼠模型的变异位点对应的密码子由GGT变异为GAT，表明囊性纤维化小鼠模型构建成功。
实施例2
本实施例确定了实施例1构建的囊性纤维化小鼠模型与人CF患者具有类似的临床症状。这些症状具体为：肠梗阻、鼻窦炎。
鉴定过程具体如下：
本实施例对实施例1构建的囊性纤维化小鼠模型的表型进行了鉴定。具体如下：
（一）一般情况
（1）身长
对比囊性纤维化小鼠模型（纯合鼠）与同窝杂合鼠的身长，结果如图6所示。
图6为同窝鼠中纯合鼠（囊性纤维化小鼠模型，右）与同窝鼠中杂合鼠（左）的身长对比结果。
由图6可知，构建的囊性纤维化小鼠模型较同窝鼠中纯合鼠发育迟缓，体型较小。
（2）体重
对比囊性纤维化小鼠模型（4只，Hom）、同窝杂合鼠（7只，Het）以及野生鼠（2只，WT）的体重，结果如图7所示。
图7为囊性纤维化小鼠模型、同窝杂合鼠以及野生鼠不同日龄的体重变化对比结果（横坐标为日龄（Time/day），纵坐标为体重（Body Weight/g））。
由图7可知，构建的囊性纤维化小鼠模型的体重小于同窝鼠中杂合鼠以及野生鼠的体重。
（3）出生率及存活率
统计7批同窝小鼠的基因型。总计小鼠44只，囊性纤维化小鼠模型（G965D纯合鼠）为12只，同窝杂合鼠总计32只。囊性纤维化小鼠模型（G965D纯合鼠）的出生率为27%（12只/44只×100%），即出生率约占1/4，出生率正常。
其中，2只囊性纤维化小鼠模型（G965D纯合鼠）因发育迟缓在出生后不到一个月的时候死亡。目前，囊性纤维化小鼠模型（G965D纯合鼠）的存活率为83.3%（（12-2）只/12只×100%）。
（二）呼吸系统
对比11.5周龄囊性纤维化小鼠模型与野生鼠的鼻窦MRI（鼻咽部位的核磁共振检查），结果如图8所示。
图8为11.5周龄野生鼠的鼻窦MRI（左）与囊性纤维化小鼠模型的鼻窦MRI（右）的对比结果。
由图8可知，与野生鼠相比，构建的囊性纤维化小鼠模型的鼻窦结构欠规整，鼻中隔偏曲，上颌窦中有粘液累积。说明构建的囊性纤维化小鼠模型表现出鼻窦炎，与人CF患者的临床症状相似。
（三）消化系统
对比囊性纤维化小鼠模型（Hom）、同窝杂合鼠（Het）以及野生鼠（WT）的胆囊HE染色（苏木精-伊红染色）结果，对比结果如图9所示。
图9为囊性纤维化小鼠模型（右）、同窝杂合鼠（中）以及野生鼠（左）的胆囊HE染色的对比结果。
由图9可知，与野生鼠（左）相比，囊性纤维化小鼠模型（右）和同窝杂合鼠（中）的胆囊粘膜腺体数目减少。
此外，目前成活的囊性纤维化小鼠模型中，一部分在饲养过程中出现肠梗阻死亡，这也与人CF患者的临床症状相似。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种囊性纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
确认突变位点：通过对比人CFTR基因和鼠Cftr基因的同源性，确认人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点；
基因修饰：将确认的变异位点通过CRISPR/Cas9技术作用于鼠受精卵，对鼠Cftr基因进行修饰，获得F0代小鼠；
小鼠模型的构建：筛选出阳性F0代小鼠；继续传代，获得囊性纤维化小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的囊性纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述人CFTR基因为人CFTR基因的18个转录本中的任意一种；所述鼠Cftr基因为鼠Cftr基因的6个转录本中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的囊性纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述人CFTR基因在Ensembl的登录号为ENST00000003084.10；所述鼠Cftr基因在Ensembl的登录号为ENSMUST00000045706.11；所述人G970D基因变异位点对应到鼠Cftr基因的变异位点为G965D。
4.根据权利要求3所述的囊性纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于：将鼠Cftr基因对应的核苷酸序列的965位点的密码子由GGT变异为GAT。
5.根据权利要求1所述的囊性纤维化小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述鼠受精卵的小鼠类型为C57BL/6J小鼠。
6.一种利用权利要求1-5中任一项所述的构建方法获得的囊性纤维化小鼠模型。
7.根据权利要求1所述的囊性纤维化小鼠模型，其特征在于：所述囊性纤维化小鼠模型表现出肠梗阻。
8.根据权利要求1所述的囊性纤维化小鼠模型，其特征在于：所述囊性纤维化小鼠模型表现出鼻窦炎。
9.一种权利要求6-8中任一项所述的囊性纤维化小鼠模型在制备用于治疗CF的药物的过程中的应用。
10.一种利用权利要求9所述的囊性纤维化小鼠模型构建的用于筛选治疗CF的药物的平台。
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| CN202310441762.4A CN116334138A (zh) | 2023-04-23 | 2023-04-23 | 一种囊性纤维化小鼠模型及其构建方法和应用 |
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