CN116784278A - 一种Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法及其应用，属于动物模型领域，FOXG1基因突变引起FOXG1综合征，属于孤独症谱系障碍，该基因不同位点、不同形式的突变导致的临床症状差异很大，第279位氨基酸点突变小鼠模型的构建方法包括Cas9/sgRNA设计与构建及其活性检测、打靶载体的构建、Cas9/sgRNA的显微注射、F0代小鼠鉴定、F1代小鼠基因型及Southern blot鉴定等。本发明根据临床病例将小鼠Foxg1基因进行定点突变，使得模型小鼠更加贴切真实地模拟疾病的发生和发展过程。本发明可为FOXG1第279位氨基酸点突变的研究提供具体模型，并用于研发FOXG1综合征的精准诊断及干预策略。
Description
技术领域
本发明属于动物模型领域，具体涉及一种Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
FOXG1综合征是一类神经发育障碍疾病，由叉头框转录因子FOXG1突变所致。患者表现出智力迟滞、语言障碍、刻板行为和社会交往能力低下等孤独症的核心症状。目前已报道了多种FOXG1突变病例，携带不同突变的患者其临床表征也各不相同，提示FOXG1不同位点的突变导致大脑不同程度的发育缺陷，但机制尚不明确，缺乏临床精准干预手段。
目前建立的Foxg1全身性以及条件性敲除小鼠均无法贴切地模拟临床患者的症状。Foxg1纯合敲除小鼠的端脑腹侧结构缺失，出生致死；Foxg1杂合子小鼠可存活至成年，但与临床杂合突变患者的症状大相径庭；各类利用Cre-loxp系统的Foxg1条件性敲除小鼠均不能贴切地模拟患者的临床症状和致病机理，因此建立针对不同突变位点、真实贴切地模拟患者临床症状的疾病小鼠模型，揭示其不同的发病机制，研发疾病的有效治疗药物以及精准干预手段，是当前对FOXG1综合征进行研究亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，本发明针对FOXG1第279位氨基酸点突变，通过CRISPR/Cas9方法构建一种新的、可稳定遗传的Foxg1点突变小鼠模型。279位氨基酸位于FOXG1进入线粒体的功能区域，该点突变小鼠模型，不仅可以帮助研究者深入研究FOXG1的生物学功能，亦可用于线粒体相关疾病的研究，并可用于研发FOXG1综合征以及线粒体相关疾病的精准诊断及干预手段。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法及其应用，包括如下步骤：
步骤一：Cas9/sgRNA设计与构建
Foxg1基因位于12染色体正链上，全场3.985kb，NCBI ID:15228；
分析FOXG1综合征病例突变位点，选择在278位氨基酸后引入终止密码子；
sgRNA设计在Intron1和3’UTR下游的非保守序列中，5’端和3’端的同源臂分别约为1.3kb和1.3kb。采用基于CRISPR/Cas9开发的EGE系统制备点突变基因敲入模式小鼠。
为了筛选到发生正确重组的基因打靶小鼠，我们采用PCR和Southernblot方法验证，并同时利用3’Probe和LRProbe验证F1代阳性小鼠。
基于sgRNA的设计原则：在5’靶位点(Intron1)和3’靶位点(3’UTR)区域分别设计八条sgRNA；
将已设计sgRNA序列合成Oligos，通过Gibson的方式连入pCS-4G载体，连接产物转化后送样测序。
步骤二：Cas9/sgRNA的活性检测
通过UCATM方式对sgRNA的活性进行检测，综合选择5’靶位点的sgRNA7和3’靶位点的sgRNA16进行下一步实验。
步骤三：打靶载体的构建
设计引物构建打靶载体，并通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。
步骤四：Cas9/sgRNA的显微注射
将Cas9/sgRNA及打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后等待F0小鼠出生。
步骤五：F0代Founder小鼠基因型鉴定
由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0小鼠为嵌合体。故以F0小鼠鼠尾进行PCR鉴定得到F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1小鼠基因型鉴定后确定。
步骤六：F1代小鼠基因型及Southernblot鉴定
选择上述F0代Founder小鼠与野生型小鼠交配，生出的小鼠为F1代，将F1代PCR鉴定为阳性小鼠的DNA进行Southernblot检测及测序，确认突变型等位基因正确重组，且没有随机插入，代表Foxg1基因点突变小鼠模型构建成功。
进一步，Foxg1基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，其中，
5’靶位点的sgRNA7：AGGCTAGGAGACAGCGATCGAGG
3’靶位点的sgRNA16：TAGCCAACCTGCTTCTCTACTGG
插入的突变型等位基因在编码区834位增加了一个T碱基，使其在279位氨基酸终止编码。
进一步，Foxg1基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，其中，对F0代小鼠进行鉴定的两对引物序列如SEQ ID NO.17-20所示：FOXG1-279-F1：TATCAAGACTGAGAGATCATTTAGC；
FOXG1-279-R1：AACCTGCTTCTCTCATGACCATGGT；
FOXG1-279-F2：CCTCGAACGCGTAGTACTGATATCT；
FOXG1-279-R2：TTATGTGCCCATCTCTTTGGGGTGA。
进一步，Foxg1基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，其中，F1代小鼠基因型鉴定和测序的引物序列如SEQ ID NO.21-24所示：
FOXG1-279-WT-F：GAGTTACTGAAGTGATCACCTGTTG；
FOXG1-279-GT-R：AACCTGCTTCTCTCATGACCATGGT；
FOXG1-279-GT-F(in)：AACCTGTCCCTCAACAAGTGCTTCG；
FOXG1-279-GT-R(in)：GGTGGAGAAGGAGTGGTTGTTGCC。
本发明的有益效果：
本发明通过本发明构建了属于孤独症谱系障碍的FOXG1综合征风险基因FOXG1第279位氨基酸点突变小鼠模型，由于采用Foxg1基因的定点突变来进行，使小鼠产生了基因组水平的改变，小鼠出生后其疾病在自然规律下发生发展。使得模型小鼠的疾病研究能够在与真实疾病的发生和发展更加接近的条件下进行，其研究的结果更具有参考价值。该模型小鼠不仅可以用于FOXG1综合征的研究，还可以用于神经发育疾病包括孤独症、小头症、智力障碍以及线粒体相关疾病的研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型的设计方案示意图；
图2是本发明Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型Southernblot筛选策略示意图；
图3是本发明5’端和3’端靶点区域分别设计的8条sgRNA对应的靶向序列；
图4是本发明pCS-4G载体图谱；
图5是本发明sgRNA的活性检测结果；
图6是本发明打靶载体构建图；
图7是本发明Foxg1 p.Lys279*点突变F0代小鼠PCR鉴定图；
图8是本发明Foxg1 p.Lys279*点突变F1代小鼠PCR鉴定图；
图9是本发明F1代小鼠PCR阳性小鼠Southernblot检测结果图；
图10是本发明Foxg1 p.Lys279*点突变F1代小鼠基因测序图：c.834dupT,p.Lys279*。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种Foxg1 p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，
实施例1：
1.靶点构建：
利用CRISPR/Cas9 gene targeting技术，构建针对目的基因的sgRNA，体外转录为mRNA，知道Cas9蛋白在特定位点剪切DNA双链。
(1)基因信息
Gene Bank Gene ID：15228
(2)设计构思
首先分析FOXG1综合征病例的突变位点和临床症状，该临床病例在287位氨基酸出现碱基突变，继续编码168个碱基后终止编码，其症状表现为癫痫、髓鞘形成延迟、胼胝体发育不全等。接下来根据物种、基因名称知道基因的编码区，分析与人相应的基因组结构，确定在小鼠Foxg1基因的278位氨基酸后引入终止密码子。sgRNA设计在IntronⅠ和3’UTR下游的非保守序列中。5’端和3’端的同源臂分别为1.3kb和1.3kb，设计如图1所示。为了筛选到发生正确重组的基因打靶小鼠，我们采用PCR和Southernblot方法验证，并同时利用3’Probe和LR Probe验证F1代阳性小鼠，具体设计如图2所示。
(3)靶点设计
基于sgRNA的设计原理，我们在5’端和3’端靶点区域分别设计8条sgRNA，8条sgRNA的序列如图3所示。按照设计的sgRNA序列合成Oligos，通过Gibson的方式连入pCS-4G载体，pCS-4G载体图谱如图4所示。待连接产物测序正确之后，利用UCATM方式对sgRNA的活性进行检测，活性检测结果如图5所示，最终选择以下两条活性最高的sgRNA进行下一步的实验，打靶质粒如图6SEQ ID NO.1-16所示。
5’靶位点
SgRNA1：AATCAGTGCCGCCGGCGTGCAGG
SgRNA2：CAGACGCTCCTGCACGCCGGCGG
SgRNA3：TGCACGCCGGCGGCACTGATTGG
SgRNA4：GCACTGATTGGTTCGGCAGTAGG
SgRNA5：GCCGAACCAATCAGTGCCGCCGG
SgRNA6：CCGAGCTACAGGCGCACACTAGG
SgRNA7：AGGCTAGGAGACAGCGATCGAGG
SgRNA8：CTGGGCCCCCGATTGGTCGACGG
3’靶位点
SgRNA9：TGGATCCTGTGGTGATTCTGTGG
SgRNA10：TCCTGTGGTGATTCTGTGGAAGG
SgRNA11：CTGTTGTAATGATTTATAGACGG
SgRNA12：CGTCTATAAATCATTACAACAGG
SgRNA13：GTACCTCTATGATGTAAAAATGG
SgRNA14：TCTATGATGTAAAAATGGAGGGG
SgRNA15：TCTGCAGTAATGCAATAAGCTGG
SgRNA16：TAGCCAACCTGCTTCTCTACTGG
5’靶位点的sgRNA7：AGGCTAGGAGACAGCGATCGAGG
3’靶位点的sgRNA16：TAGCCAACCTGCTTCTCTACTGG
2.胚胎供体小鼠(C57BL/6)超排卵
PMSG(孕马血清促性腺激素)处理供体雌性小鼠，48小时后注射hCG(人绒毛膜促性腺激素)，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射。
3.显微注射
按照所述设计的sgRNA序列合成oligos，所述oligos通过Gibson Assembly方法连入包含Cas9的pCS-4G载体。设计引物构建打靶载体，并进行纯化，然后与Cas9、sgRNA一起原核显微注射到小鼠受精卵中，注射样品配置成50：1的体系。
4.F0代Founder小鼠基因型鉴定
由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0小鼠为嵌合体。故以F0小鼠鼠尾进行PCR鉴定得到F0基因型仅供参考，鉴定结果如图7所示：通过PCR产物和测序表明：E11Y13-0040和11Y13-0042为点突变的阳性F0小鼠；E11Y13-0057和11Y13-0064为点突变的疑似阳性F0小鼠。但这次获得的小鼠不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1小鼠基因型鉴定后确定。
5.F1代小鼠基因型及Southernblot鉴定
选择上述阳性和疑似阳性F0代Founder小鼠与野生型小鼠交配，生出的小鼠为F1代，将F1代PCR鉴定为阳性小鼠的DNA进行Southernblot检测及测序，引物设计原则和F0一致，这部分的结果如8、9、10所示，通过PCR鉴定及点突变位点测序结果显示：1E11Y13-0002，1E11Y13-0003，1E11Y13-0006，1E11Y13-0019，1E11Y13-0021，1E11Y13-0023，1E11Y13-0028，1E11Y13-0032，1E11Y13-0057和1E11Y13-0068等为初筛点突变阳性F1小鼠。提取上述部分初筛点突变阳性的F1代小鼠鼠尾DNA进行Southern Blot检测及测序，检测结果表明：1E11Y13-0002，1E11Y13-0003，1E11Y13-0006，1E11Y13-0019，1E11Y13-0021，1E11Y13-0023，1E11Y13-0028，1E11Y13-0032，1E11Y13-0057和1E11Y13-0068均为正确重组，且没有随机突变代表Foxg1基因点突变小鼠模型构建成功。
实施例2：
对Foxg1 c.834dupT,p.Lys279*点突变系小鼠的应用。测序后对性成熟的小鼠进行交配繁育。该小鼠模型在成年阶段发现具备胼胝体发育不全等特征，借助该小鼠模型，可在不同的发育时间选择胼胝体穿越中线的关键时期进行探究，与野生型相比，构建该突变导致的相关基因网络的异常，分析其致病机制。
实施例3：
对Foxg1 c.834dupT,p.Lys279*点突变系小鼠的应用，观察该突变小鼠的行为特征，尝试进行药物干预。FOXG1综合征患者多伴随刻板行为，社会交往退缩，癫痫等表征，但目前尚无有效和治疗该疾病的药物，基于该突变小鼠模型，为研制相关药物提供支撑。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (10)
1.一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：选择Foxg1基因，在278位氨基酸后引入终止密码子，sgRNA设计在Intron1和3’UTR下游的非保守序列中，在5’端和3’端靶点区域分别设计8条sgRNA，并进行活性检测，选择活性最高的5’靶位点的sgRNA7和3’靶位点的sgRNA进行下一步的实验；
按照所述设计的sgRNA序列合成oligos，所述oligos通过GibsonAssembly方法连入包含Cas9的pCS-4G载体，设计引物构建打靶载体，并进行纯化，然后与Cas9、sgRNA一起原核显微注射到小鼠受精卵中得到F0代小鼠并进行基因型鉴定；
选择F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到F1代小鼠，通过基因型及Southern blot鉴定确定Foxg1基因点突变小鼠模型构建成功。
2.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，8条5’靶位点的sgRNA的序列分别为SEQ ID NO.1-8，8条3’靶位点的sgRNA序列如SEQ IDNO.9-16所示；
其中活性最高的5’靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO.7所示，活性最高的3’靶位点的sgRNA序列如SEQ ID NO.16所示。
3.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述活性检测具体通过UCATM方式对sgRNA的活性进行检测。
4.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，构建打靶载体时通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。
5.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，F0代小鼠基因型鉴定，以F0代小鼠鼠尾进行PCR鉴定其基因型。
6.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述F1代小鼠基因型及Southernblot鉴定，将F1代小鼠PCR鉴定为阳性小鼠的DNA进行Southernblot检测及测序，确认突变型等位基因正确重组，且没有随机插入，代表Foxg1基因点突变小鼠模型构建成功。
7.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述插入的终止密码子在编码区834位增加了一个T碱基，使其在279位氨基酸终止编码。
8.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，对F0代小鼠进行PCR鉴定的引物序列如：SEQ ID NO.17-20所示。
9.根据权利要求1所述的一种Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，F1代小鼠基因型鉴定和测序的引物序列如SEQ ID NO.21-24所示。
10.权利要求1-9任意所述Foxg1p.Lys279*点突变小鼠模型的构建方法在神经发育疾病研究上的应用。
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