CN110616232B - Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用，采用同源重组技术进行终止序列元件敲入，敲除小鼠睾丸特异表达的Sox30基因，获得的F3代纯合型小鼠均表现为雄性特异性不育，即该类小鼠形态及病理表现症状与人类男性NOA表现症状一致，可用于研究或模拟NOA疾病的动物模型。采用本申请方法构建的小鼠模型在出生45天时，即可表现出NOA病症，建模时间短。另外，杂合型F3代雄性小鼠与F3代纯合型雌性小鼠可以自由交配，产生大量存活纯合后代且纯合后代可通过诱导恢复敲除基因的表达进行回救分析，该建模过程通过自然繁殖完成，建模过程中无需其他操作，使建模过程简单、价格低廉，便于广泛推广使用。

Description

Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用。
背景技术
不育不孕作为影响人类繁衍的重要疾病已成为世界性的严重医学健康问题和沉重社会问题，受到人们的广泛关注。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)预测，在影响人类生活和健康的疾病中不孕不育将成为继肿瘤和心血管疾病之后的第三大疾病。根据WHO最新统计数据显示，全球患有不育症的夫妇数量约为8000万对，其中，男性患者约占50％，且男性原因导致的不育所占比例呈现逐年上升态势。在我国，随着国家“二孩”政策的开放，男性不育问题显得尤为突出。男性不育症的病因非常复杂，病理机制尚不明确。尽管部分男性不育是由己知原因，如阻塞性无精症(obstructive azoospermia，OA)、隐睾和精索静脉曲张等造成，但多数男性不育被诊断为未知原因的非阻塞性无精症(Non-obstructive azoospermia，NOA)。
现有的诸如“试管”婴儿(In vitro Fertilization)、卵泡胞内精子注射(Intracytoplasmic sperm injection)等辅助生殖技术，可协助己知病因的男性不育患者，例如OA患者，完成正常的生育过程。但是，目前超过80％的NOA患者无精、少精的发病病理和病因不明，现有的辅助生殖技术对NOA患者的治疗效果甚微，临床治疗具有较大困难。
因此，亟待一种有助于研究NOA患者无精、少精的发病病理和病因的动物模型。
发明内容
本申请提供了一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用，以解决现有的大部分NOA患者无精、少精的发病病理和病因不明，临床治疗具有较大困难的问题。
第一方面，本申请提供了一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，包括：
构建中间载体，具体包括，选择Sox30基因上第1个外显子和第2个外显子之间的intron1作为终止序列元件LSAIRESSL的插入位点，并以此插入位点的上、下游片段作为同源臂，其中，上游片段为H3，下游片段为H4；通过分子克隆法，将H3及H4克隆到序列元件LSAIRESSL的两端，得到中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4；
构建KI final打靶载体，具体包括，使用限制性内切酶AscI和NotI对构建的中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4进行双酶切，释放出片段H3-LSAIRESSL-H4；通过同源重组法，将片段H3-LSAIRESSL-H4插入到Sox30基因intron 1中的靶点，并将包含该靶点上、下游各5kb左右的片段克隆到高拷贝的基因打靶载体pL253骨架上，得到Sox30 KI final打靶载体；
ES细胞基因的打靶和筛选，具体包括，将KI final打靶载体进行线性化处理，并电转入ES细胞，然后，通过LR-PCR和Southern blot筛选中靶ES阳性克隆子；
获取嵌合鼠，具体包括，将上述步骤筛选的中靶ES阳性克隆子进行囊胚注射，产出F0代小鼠，并通过基因型鉴定，筛选出F0代小鼠中嵌合成功的小鼠，即F0代嵌合小鼠；
获取Sox30敲除和可恢复小鼠模型，具体包括，
将上述步骤获得的F0代嵌合小鼠进行交配繁育，获得F1代小鼠，并通过基因型鉴定，筛选出F1代小鼠中杂合子小鼠，即F1代杂合子小鼠；
将经鉴定筛选出的F1代杂合子小鼠与cre工具小鼠交配，获得F2代小鼠，并通过基因型鉴定，在F2代小鼠中筛选出cre阳性的杂合子小鼠，即F2代杂合子小鼠；
将F2代杂合子小鼠进行兄妹交配,获得F3代小鼠,并对F3代小鼠进行基因型鉴定，F3代小鼠包括野生型、杂合子和纯合子，筛选出F3代小鼠中的纯合子，即为Sox30敲除和可恢复小鼠模型。
可选地，构建中间载体之后还包括：对上述步骤构建的中间载体进行酶切和/或基因测序检测，判断预期插入的终止序列元件是否连接到该中间载体中。
可选地，构建KI final打靶载体之后还包括：对上述步骤构建的KI final打靶载体进行酶切和/或基因测序检测。
可选地，筛选F3代小鼠中的纯合子的过程包括：
验证F3代小鼠的生育能力，具体包括，
将F3代小鼠与已知具有生殖能力的野生型雌性和雄性小鼠按雄雌1：2进行交配，合笼至少5个月，经验证，F3代小鼠中，野生型、杂合型和纯合型雌性小鼠均可正常生育，野生型和杂合型雄性小鼠可正常生育，纯合型雄性小鼠不可正常生育。
可选地，验证Sox30敲除和可恢复小鼠的生育能力，还具体包括，验证F3代雄性小鼠的睾丸体积和重量，经验证，相较于F3代中的野生型和杂合型雄性小鼠，F3代中的纯合型雄性小鼠的睾丸体积和重量均较小。
可选地，验证Sox30敲除和可恢复小鼠的生育能力，还具体包括，验证F3代雄性小鼠的附睾和睾丸内是否存在精子，经验证，在F3代雄性小鼠中，野生型和杂合型雄性小鼠的附睾和睾丸均有精子的存在，纯合型雄性小鼠的附睾和睾丸中不存在精子。
可选地，获取Sox30敲除和可恢复小鼠模型之后，还包括：
恢复Sox30敲除和可恢复小鼠中Sox30基因的表达，具体包括，将成体的F3代纯合型雄性小鼠通过雌激素诱导法删除终止序列元件，获得loxp/loxp雄性小鼠，并验证loxp/loxp雄性小鼠的生精与生育变化。
第二方面，本申请还提供了一种基于上述的方法建立的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型在研究NOA患者无精、少精的发病病理和病因，诊断NOA疾病和治疗NOA药物的筛选中的应用。
本申请提供了一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用，采用同源重组技术将终止序列元件敲入小鼠Sox30基因的intron 1中，敲除小鼠睾丸特异表达的Sox30基因，获得的F3代纯合型小鼠均表现为雄性特异性不育、睾丸体积变小、睾丸和附睾中完全无精子以及生精细胞阻滞，即F3代纯合型雄性小鼠的形态及病理表现症状与人类男性NOA表现症状高度一致，因此，将F3代纯合型雄性小鼠作为Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型，用于研究或模拟NOA疾病。另外，通过诱导可使F3代纯合型雄性小鼠的Sox30恢复表达，恢复表达后，小鼠可以产生具有正常的受孕能力精子，并可与正常可生育的雌性小鼠产生正常后代。综上，Sox30基因敲除和可诱导恢复型小鼠模型能够模拟NOA发病过程，为研究NOA病因、诊断和治疗药物筛选提供动物模型。
本申请还提供了一种基于上述的方法建立的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型在研究NOA患者无精、少精的发病病理和病因，以及诊断NOA疾病和治疗NOA药物的筛选中的应用。采用本申请方法构建的Sox30敲除和可恢复型小鼠模型在出生45天时，即可表现出NOA病症，建模时间短。另外，本申请的建模过程通过自然繁殖完成，即通过F3代杂合型雄性小鼠与F3代纯合型雌性小鼠自由交配产生，且建模过程中无需其他操作，因此，本申请的建模过程简单、价格低廉，便于广泛推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法的流程示意图；
图2为中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4的载体图谱；
图3为对中间载体进行酶切检测的检测结果图；
图4为Sox30 KI final打靶载体的载体图谱；
图5为对KI final打靶载体进行酶切检测的检测结果图；
图6为LR-PCR的筛选结果图，其中，1A-6H、7A-9H为鉴定的ES克隆子的编号；
图7为Southern blot的鉴定结果图，B6、4D、9G为鉴定的ES克隆子的编号；
图8为F3代小鼠的生育能力分析图，其中，横坐标为不同基因型的F3代小鼠，纵坐标Fertility为生育能力，n为小鼠的样本数，male代表雄性小鼠，female代表雌性小鼠；
图9为F3代雄性小鼠的睾丸形态、睾丸重量和睾丸重量/身体重量比值的对比分析图，其中，睾丸形态(testis morphology)图中，标尺为0.5cm；睾丸重量(testis weight)图，“***”表示p值小于0.001，N为样本数；睾丸重量/身体重量比值(testis/body weight)图中，“***”表示p值小于0.001，N为样本数；
图10为F3代雄性小鼠的睾丸和附睾组织切片的HE染色病理分析，其中，testis代表睾丸，epididymis代表附睾，图中箭头所指为精子，标尺为50μm；
图11为loxp/loxp雄性小鼠的生育能力分析图，其中，genotypes代表基因型，Fertility为生育能力；
图12为loxp/loxp雄性小鼠的睾丸形态、睾丸重量和睾丸重量/身体重量比值的对比分析图，其中，testis morphology代表睾丸形态；睾丸重量/身体重量比值(testis/bodyweight)图中，“***”表示p值小于0.001；
图13为loxp/loxp雄性小鼠的睾丸和附睾组织切片的HE染色病理分析，其中，testis代表睾丸，epididymis代表附睾，图中箭头所指是精子，标尺为50μm。
具体实施方式
Sox家族是一类发育核转录因子，为雄性性别决定基因SRY(sex determiningregion of Chr Y)相关基因构成的基因超家族，其成员具有高度保守的DNA结合域(HMG-box)。现有研究表明，Sox基因广泛参与了胚胎发育、性别决定、器官形成和肿瘤发生等过程。Sox30(SRY box containing gene 30)是Sox基因家族H亚族唯一成员，其在精子形成中具有非常重要的作用。
图1为本申请Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法的流程示意图，如图1所示，首先，本申请采用同源重组技术将连接有终止序列元件的打靶载体(target vector)敲入野生型小鼠Sox30基因(wild-type Sox30)的内含子1(intron 1)，其中，intron 1位于Sox30基因的第1个外显子(extron 1)和第2个外显子(extron 2)之间，即特异位点(LoxPsite)。敲入后，小鼠Sox30基因在extron 2之前表达终止，即灰色的第2、3、4和5外显子均不表达，实现敲除小鼠睾丸特异表达的Sox30基因的目的。然后，Sox30小鼠通过与cre工具小鼠(cre driver mice)交配形成的cre阳性且Sox30敲除的小鼠。最后，在雌激素诱导条件下删除终止序列元件，使Sox30恢复表达，从而获得Sox30敲除和可恢复型小鼠模型。图1中，southern probe是进行阳性克隆子Southern blot鉴定的序列,HMG-box是指Sox30基因的DNA结合功能域，ATG是指Sox30基因的翻译起始密码子，TAG是指Sox30基因的翻译终止密码子，HSV-TK为克隆子抗生素筛选标签。应当说明，文中并未详细说明的技术均为本领域通用技术，在此将不对其具体实现过程进行赘述。
以下将具体说明本申请的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法。
本申请提供一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，包括：
步骤S100，构建中间载体，具体包括，
首先，选择Sox30基因的intron 1为终止序列元件loxP-SA-IRES-EGFP-Neo-STOP-loxP(以下简写为LSAIRESSL)插入位点，并以此插入位点的上、下游片段作为同源臂，即同源臂H3和同源臂H4。本实施例中，选择插入位点的上下游各5kb左右的片段作为同源臂，当然，本领域技术人员根据实际需要选择其它数目的碱基数，其均属于本申请的保护范围。
然后，通过分子克隆法，将同源臂H3及同源臂H4克隆到LSAIRESSL的两端，得到中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4，图2为中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4的载体图谱。本实施例中，使用的同源臂H3的碱基数为294bp，使用的同源臂H4的碱基数为365bp，当然，本领域技术人员根据实际需要调整同源臂的碱基数，其均属于本申请的保护范围。
应当说明，分子克隆法是一个目的序列分离的通用技术，即将目的序列通过PCR扩增的形式克隆纯化出来。分子克隆法是本领域通用技术，再此将对其具体的实现过程进行赘述。
为确保构建的中间载体中已成功连接预期插入的终止序列元件，本申请中的方法还包括步骤S200，对上述步骤构建的中间载体进行酶切和/或基因测序检测，判断预期插入的终止序列元件是否连接到该中间载体中。图3为对中间载体进行酶切检测的检测结果图，根据检测结果图中条带大小可知，酶切验证正确，表明中间载体中成功连接预期插入的终止序列元件。同时，通过测序检测结果发现，插入到中间载体的H3-LSAIRESSL-H4元件序列均存在，进一步表明中间载体中成功连接预期插入的终止序列元件。
步骤S300，构建KI final打靶载体，具体包括，使用限制性内切酶AscI和NotI对构建的中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4进行双酶切，释放出片段H3-LSAIRESSL-H4；通过同源重组技术，将片段H3-LSAIRESSL-H4插入到Sox30基因intron 1中的位点，并将包含该位点上下游各5kb左右的片段克隆到高拷贝的基因打靶载体pL253骨架上，得到Sox30 KIfinal打靶载体，图4为Sox30 KI final打靶载体的载体图谱。
为进一步确保构建的KI final打靶载体的正确性，本申请的方法还包括步骤S400，对上述步骤构建的KI final打靶载体进行酶切验证和/或测序验证。图5为对KIfinal打靶载体进行酶切检测的检测结果图，根据检测结果图中条带大小可知，酶切验证正确，表明final打靶载体构建成功。同时，通过测序检测结果发现，final打靶载体中H3-LSAIRESSL-H4元件序列均存在，进一步表明KI final打靶载体构建成功。
步骤S500，ES细胞基因的打靶和筛选，具体包括，
将KI final打靶载体进行线性化处理，并电转入ES细胞(embryonic stem cells，胚胎干细胞)，然后，通过LR-PCR和Southern blot筛选中靶ES阳性克隆子。应该说明，线性化处理技术、电转入技术、LR-PCR以及Southern blot均为本领域常用技术，其具体实现过程将不进行赘述。
图6为LR-PCR的筛选结果图，根据图6的筛选结果可知，5’末端扩增筛选验证发现,图中1C、4D、5E、7H、8B、8F和9G为阳性，进一步根据3’末端扩增筛选验证发现,图中4D和9G为阳性。这一结果表明，LR-PCR筛选证明4D和9G为中靶ES阳性克隆子。进一步通过Southernblot对LR-PCR筛选的阳性克隆进行验证，图7为Southern blot的鉴定结果图，根据图7的鉴定结果可知，4D和9G确实为中靶ES阳性克隆子。
步骤S600，获取嵌合鼠，具体包括，将上述步骤筛选的中靶ES阳性克隆子(即4D和9G)进行囊胚注射，产出F0代小鼠，并通过基因型鉴定，筛选出F0代小鼠中嵌合成功的小鼠，即F0代嵌合小鼠。
步骤S700，获取Sox30敲除和可恢复小鼠模型，具体包括，
将上述步骤获得的F0代小鼠进行交配繁育，获得F1代小鼠，并通过基因型鉴定，筛选出F1代小鼠中杂合子小鼠，即F1代杂合子小鼠；
将经鉴定筛选出的F1代杂合子小鼠与cre工具小鼠交配，获得F2代小鼠，并通过基因型鉴定，在F2代小鼠中筛选出cre阳性的杂合子(KI/wt)小鼠，即F2代杂合子小鼠；
将F2代杂合子小鼠进行兄妹交配,获得F3代小鼠,并对F3代小鼠进行基因型鉴定，F3代小鼠包括野生型(wt/wt，即+/+)、杂合子(KI/wt，即-/+)和纯合子(KI/KI，即-/-)，筛选出F3代小鼠中的纯合子，即为Sox30敲除和可恢复小鼠模型。
应当说明，对F0-F3代小鼠进行基因型鉴定，其采用的基因型鉴定为生物学检测中一种常用技术，其具体的实现过程将不进行赘述。当然，为适应本申请的基因型鉴定，其基因型鉴定过程中使用的PCR引物信息如表1所示、PCR反应体系如表2所示、PCR反应程序如表3所示。
表1 PCR引物信息
Figure BDA0002210648450000051
表2 PCR反应体系
试剂 体积(ul) 规格
10X Buffer 2.5
ddH2O 16.75
Primer 1 1 10mM
Primer 2 1 10mM
Mg2+ 2 25mM
dNTPs 0.5 10mM each
Taq 0.25 5U/ul
Template 1  
表2中，Primer 1为KitF1/KitR2/KitF2，Primer 2为En2-R/H4SeqF/WtR1。
表3 PCR反应程序
Figure BDA0002210648450000061
本实施例中，筛选F3代小鼠中的纯合子的过程包括：
步骤S810，验证F3代小鼠的生育能力，验证过程具体包括，
将F3代小鼠与已知具有生殖能力的野生型雌性和雄性小鼠按雄雌1：2进行交配，合笼至少5个月，图8为F3代小鼠的生育能力分析图，根据图8可知，F3代小鼠中，野生型(+/+)、杂合型(+/-)和纯合型(-/-)的雌性小鼠均可正常生育；野生型(+/+)和杂合型(+/-)雄性小鼠可正常生育，纯合型(-/-)雄性小鼠不可正常生育。
本申请中，验证Sox30敲除和可恢复小鼠的生育能力，还具体包括，步骤S820，验证F3代雄性小鼠的睾丸体积和重量，图9为F3代雄性小鼠的睾丸形态、睾丸重量和睾丸重量/身体重量比值的对比分析图，根据图9可知，相较于F3代中的野生型和杂合型雄性小鼠，F3代中的纯合型雄性小鼠的睾丸体积和重量均较小。
本申请中，验证Sox30敲除和可恢复小鼠的生育能力，还具体包括，步骤S830，验证F3代雄性小鼠的附睾和睾丸内是否存在精子，图10为F3代雄性小鼠的睾丸和附睾组织切片的HE染色病理分析，根据图10可知，野生型(+/+)和杂合型(+/-)雄性小鼠的附睾和睾丸均有精子的存在，而纯合型(-/-)雄性小鼠的附睾和睾丸中并未发现精子。
为验证Sox30敲除和可恢复小鼠在诱导后Sox30可重新表达以及重新表达后小鼠的生精和生育的变化，本申请中，在获取Sox30敲除和可恢复小鼠模型之后，还包括步骤S900，Sox30敲除和可恢复小鼠可恢复的验证，具体包括，将成体的纯合型(-/-)雄性小鼠进行雌激素诱导，删除终止序列元件，得到loxp/loxp雄性小鼠，并验证loxp/loxp雄性小鼠的生精与生育变化。本实例中，向Sox30敲除和可恢复小鼠腹腔内注射的雌激素为他莫昔芬，当然，本领域技术人员根据实际需要，选择其他雌激素，其均属于本申请的保护范围。
loxp/loxp雄性小鼠的Sox30恢复表达6个月后，验证的loxp/loxp雄性小鼠Sox30表达的恢复性。图11为loxp/loxp雄性小鼠的生育能力分析图，根据图11可知，loxp/loxp雄性小鼠与正常可生育的雌性小鼠(雄雌1：2)合笼后，loxp/loxp雄性小鼠可正常产生后代，即loxp/loxp雄性小鼠具有生育能力。
图12为loxp/loxp雄性小鼠的睾丸形态、睾丸重量和睾丸重量/身体重量比值的对比分析图，根据图12可知，与F3代中的纯合型(-/-)雄性小鼠相比，loxp/loxp雄性小鼠的睾丸体积和重量均得到明显恢复。
图13为loxp/loxp雄性小鼠的睾丸和附睾组织切片的HE染色病理分析，根据图13可知，loxp/loxp雄性小鼠的附睾和睾丸中出现精子。
综上，F3代中的纯合型(-/-)雄性小鼠的形态和病理表型与人类NOA患者形态和病理表型高度相似，因此，可将F3代中的纯合型(-/-)雄性小鼠作为Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型，用于研究或模拟NOA疾病。另外，通过诱导可使F3代中的纯合型(-/-)雄性小鼠的Sox30恢复表达，恢复表达后，该小鼠可以产生具有正常的受孕能力精子，并可与正常可生育的雌性小鼠产生正常后代。因此，Sox30基因敲除和可诱导恢复型小鼠模型能够模拟NOA发病过程，为研究NOA患者无精、少精的发病病理和病因以及诊断NOA疾病和治疗NOA药物的筛选提供动物模型。
本申请还提供了一种基于上述的方法建立的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型在研究NOA患者无精、少精的发病病理和病因，诊断NOA疾病和治疗NOA药物的筛选中的应用。采用本申请方法构建的Sox30敲除和可恢复型小鼠模型在出生45天时，即可表现出NOA病症，建模时间短。另外，本申请的建模过程通过自然繁殖完成，即通过F3代中的杂合型雄性小鼠与纯合型雌性小鼠进行自由交配产生，该建模过程中无需其他操作，因此，建模过程简单、价格低廉，便于广泛推广使用。
以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。

Claims (7)

1.一种Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，包括：
构建中间载体，具体包括，选择Sox30基因上第1个外显子和第2个外显子之间的intron1作为终止序列元件LSAIRESSL的插入位点，并以此插入位点的上、下游片段作为同源臂，其中，上游片段为H3，下游片段为H4；通过分子克隆法，将H3及H4克隆到序列元件LSAIRESSL的两端，得到中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4，其中，所述终止序列元件LSAIRESSL具体为终止序列元件loxP-SA-IRES-EGFP-Neo-STOP-loxP；
构建KI final打靶载体，具体包括，使用限制性内切酶AscI和NotI对构建的中间载体pUBC-Sox30-H3-LSAIRESSL-H4进行双酶切，释放出片段H3-LSAIRESSL-H4；通过同源重组法，将片段H3-LSAIRESSL-H4插入到Sox30基因intron 1中的靶点，并将包含该靶点上、下游各5kb左右的片段克隆到高拷贝的基因打靶载体pL253骨架上，得到Sox30 KI final打靶载体；
ES细胞基因的打靶和筛选，具体包括，将KI final打靶载体进行线性化处理，并电转入ES细胞，然后，通过LR-PCR和Southern blot筛选中靶ES阳性克隆子；
获取嵌合鼠，具体包括，将上述步骤筛选的中靶ES阳性克隆子进行囊胚注射，产出F0代小鼠，并通过基因型鉴定，筛选出F0代小鼠中嵌合成功的小鼠，即F0代嵌合小鼠；
获取Sox30敲除和可恢复小鼠模型，具体包括，
将上述步骤获得的F0代嵌合小鼠进行交配繁育，获得F1代小鼠，并通过基因型鉴定，筛选出F1代小鼠中杂合子小鼠，即F1代杂合子小鼠；
将经鉴定筛选出的F1代杂合子小鼠与cre工具小鼠交配，获得F2代小鼠，并通过基因型鉴定，在F2代小鼠中筛选出cre阳性的杂合子小鼠，即F2代杂合子小鼠；
将F2代杂合子小鼠进行兄妹交配,获得F3代小鼠, 并对F3代小鼠进行基因型鉴定，F3代小鼠包括野生型、杂合子和纯合子，筛选出F3代小鼠中的纯合子，即为Sox30敲除和可恢复小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，构建中间载体之后还包括：对上述步骤构建的中间载体进行酶切和/或基因测序检测，判断预期插入的终止序列元件是否连接到该中间载体中。
3.根据权利要求1所述的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，构建KI final打靶载体之后还包括：对上述步骤构建的KI final打靶载体进行酶切和/或基因测序检测。
4.根据权利要求1所述的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，筛选F3代小鼠中的纯合子的过程包括：
验证F3代小鼠的生育能力，具体包括，
将F3代小鼠与已知具有生殖能力的野生型雌性和雄性小鼠按雄雌1：2进行交配，合笼至少5个月，经验证，F3代小鼠中，野生型、杂合型和纯合型雌性小鼠均可正常生育，野生型和杂合型雄性小鼠可正常生育，纯合型雄性小鼠不可正常生育。
5.根据权利要求1所述的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，验证Sox30敲除和可恢复小鼠的生育能力，还具体包括，验证F3代雄性小鼠的睾丸体积和重量，经验证，相较于F3代中的野生型和杂合型雄性小鼠，F3代中的纯合型雄性小鼠的睾丸体积和重量均较小。
6.根据权利要求1所述的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，验证Sox30敲除和可恢复小鼠的生育能力，还具体包括，验证F3代雄性小鼠的附睾和睾丸内是否存在精子，经验证，在F3代雄性小鼠中，野生型和杂合型雄性小鼠的附睾和睾丸均有精子的存在，纯合型雄性小鼠的附睾和睾丸中不存在精子。
7.根据权利要求1所述的Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法，其特征在于，获取Sox30敲除和可恢复小鼠模型之后，还包括：
恢复Sox30敲除和可恢复小鼠中Sox30基因的表达，具体包括，将成体的F3代纯合型雄性小鼠通过雌激素诱导法删除终止序列元件，获得loxp/loxp雄性小鼠，并验证loxp/loxp雄性小鼠的生精与生育变化。
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