CN116083485A - 一种靶向载体、ATTRm疾病模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向载体、ATTRm疾病模型的构建方法及其应用，涉及疾病模型构建技术领域。本发明提供的靶向载体可以用于对非人哺乳动物的Ttr基因座的从Ttr起始密码子至Ttr终止密码子的区域进行删除替换，替换为含TTR基因c.191T＞C点突变位点相应的人TTR序列。由此构建的疾病模型在基因组层面完全复制临床ATTRm患者真实基因状态，组织器官层面表现出与临床患者一致的多组织器官沉积，完全模拟ATTRm基因突变致蛋白异常组织沉积的疾病特征，是ATTRm病理机制探索、ATTRm预防或治疗药物筛选、以及治疗方案探索的理想动物模型。此外，本发明提供的模型构建方法简单易行，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及疾病模型构建技术领域，具体而言，涉及一种靶向载体、ATTRm疾病模型的构建方法及其应用。
背景技术
遗传型转甲状腺素蛋白淀粉样变性(mutant transthyretin amyloidosis，ATTRm)是TTR基因突变导致四聚体状态的转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)解离成单体，随后错误折叠形成淀粉样纤维沉积于组织中，导致相应器官结构改变及功能障碍的疾病(Eur Heart J 42,1554-1568)。除目前多见的心脏、神经系统受累外，临床患者还有眼部、肾脏、脾脏、骨骼肌等其他多组织器官受累。ATTRm患者生活质量差、生存率低，中位生存时间仅为36.7个月(JNeurochem 2021,156(6),802-818)。因此，相关治疗药物的开发对于ATTRm患者的治疗具有极其重要的意义。
ATTRm是常染色体显性遗传病，生存期取决于突变基因，目前已知基因突变超过130种，90％以上为单碱基错义突变引起(Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi 2021,49(4),324-332)。一个能够真实模拟ATTRm基因状态、复制疾病表型的动物模型是探索其疾病机制、研发新型药物的重要前提，但目前尚无成功模拟疾病表型的TTR单碱基突变人源化小鼠模型。
如专利CN202080038549公开了一种三重突变的人源化TTR小鼠模型构建方法：在小鼠内源Ttr-基因座的从Ttr-起始密码子至Ttr-终止密码子的区域已被删除并且被人TTR序列取代，人TTR序列包含相应的人TTR序列和人TTR 3’非翻译区域，且该人TTR序列包含包含β滑移突变的G53S/E54D/L55S相对应的三重突变。虽然观察到ATTRm疾病表型，然而临床未见有G53S、E54D、L55S三重突变患者，其动物模型与临床ATTRm患者基因突变状态不同，不能真实模拟ATTRm患者发病机制。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向载体、ATTRm疾病模型的构建方法及其应用以完全模拟临床ATTRm患者的基因状态，本发明构建的人源化动物模型表现出与临床患者高度一致的人源TTR(human TTR,hTTR)蛋白多组织器官沉积。
名词释义
术语“基因座”是指基因(或显著序列)，DNA序列，多肽-编码序列的特定位置，或生物体基因组的染色体上的位置。例如，“Ttr-基因座”可以是指Ttr-基因，Ttr-DNA序列，转甲状腺素蛋白编码序列的特定位置或生物体的基因组的染色体上的Ttr-位置，所述生物体已被识别为其中带有这样的序列。“Ttr-基因座”可包含Ttr-基因的调节性元件，包括，例如，增强子，启动子，5’和/或3’非翻译区域(UTR)或者它们的组合。
术语“等位基因”是指基因的变体形式。一些基因具有多个不同的形式，其位于染色体上的相同的位置或染色体上的基因座处。双倍体生物体在每个基因座处具有两个等位基因。每对等位基因代表特定基因的基因座的基因分型。如果特定基因座处具有两个相同的等位基因，那么，基因分型被描述为纯合体，如果特定基因座处的两个等位基因不同，那么基因分型被描述为杂合体。
基因的“编码区域”或“编码序列”由基因的编码蛋白质的DNA或RNA部分构成，DNA或RNA部分由外显子构成。区域在5’端上的起始密码子处开始并且在3’端的终止密码子处结束。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种靶向载体，其包括：靶向载体含携带点突变的人TTR序列，且人TTR序列包括TTR编码序列和非编码序列；
点突变是指人TTR基因c.191T＞C点突变。
单个碱基突变来源于医院临床发现的1例ATTRm患者，其突变位点为c.191T＞C(p.Phe64Ser)，该病例特点为10岁左右出现眼睛视力下降，于20岁左右出现肢体麻木和心累，心脏、神经、眼部检查均提示有受累证据。其家系调查(参照图11所示)显示家族中患者均于30-40岁左右死亡，提示该突变位点为临床早发、进展快、预后差的ATTRm突变位点，然而该突变位点从未在体内建模。
发明人首次发现，具有上述点突变的靶向载体可以用于构建疾病模型，获得的疾病模型能够完全复制临床来源患者TTR基因突变序列，构建的人源化动物模型表现出与临床患者高度一致的hTTR蛋白多组织器官沉积。
患者本身具有胃肠道症状，可能由胃肠道本身异常TTR蛋白沉积引起或神经功能障碍引起。结合该c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变疾病模型病理结果显示，除与临床患者一致的眼部、心脏、神经系统累及外，在患者中未行病理确诊的胃肠道、肾脏、脾脏等也查见hTTR蛋白沉积，首次揭示了该c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变与患者胃肠道疾病表型间的关联性。
发明人首次发现该位点基因突变的肾脏及脾脏致病性。
通过上述靶向载体用于对非人哺乳动物的Ttr基因座的从Ttr起始密码子至Ttr终止密码子的区域进行删除替换，替换为含TTR基因c.191T＞C点突变位点相应的人TTR序列。由此构建的疾病模型在基因组层面完全复制临床ATTRm患者真实基因状态，组织器官层面表现出与临床患者一致的多组织器官沉积，完全模拟ATTRm基因突变致蛋白异常组织沉积的疾病特征，是ATTRm病理机制探索、ATTRm预防或治疗药物筛选、以及治疗方案探索的理想动物模型。
在用于治疗方案探索时，人源点突变TTR基因的序列特征使此模型在基因组层面充分反映基因编辑真实治疗效果，多组织器官沉积的病理特征使此模型可在器官层面评估真实治疗效果及不同器官的疗效反应。
在本发明应用较佳的实施方式中，携带点突变的人TTR序列与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的一致性。只要上述靶向载体含有上述一致性的人TTR序列，且构建后的疾病模型具有多组织器官存在蛋白异常沉积的疾病特征均在本发明的保护范围之内。
靶向载体在人TTR序列两端还分别设置有非人哺乳动物的Ttr5’非翻译区域和非人哺乳动物的Ttr3’非翻译区域，非人哺乳动物内源Ttr5’非翻译区域和内源Ttr3’非翻译区域均未被删除。
在本发明应用较佳的实施方式中，非人哺乳动物选自大鼠、小鼠或猴。
在一种可选的实施方式中，非人哺乳动物选自小鼠。
本发明还提供了一种细胞，其包括上述的靶向载体。
例如选自ES细胞，细胞内还含有靶定内源Ttr基因座中的靶向序列的核酸酶试剂或编码核酸酶试剂的多核苷酸。核酸酶试剂包含Cas蛋白质和向导RNA。
本发明还提供了一种ATTRm疾病模型的构建方法，其包括如下步骤：
(a)修饰非人哺乳动物单细胞期胚胎的基因组，使非人哺乳动物单细胞期胚胎的基因组中包含携带点突变的人TTR序列；
(b)选择基因修饰的非人哺乳动物单细胞期胚胎，非人哺乳动物单细胞期胚胎在其基因组中包含携带点突变的人TTR序列；以及
(c)在代孕母体中孕育基因修饰的非人哺乳动物单细胞期胚胎，其中代孕母体产生F0子代基因修饰的非人哺乳动物。
发明人实验证实，上述构建方法获得的ATTRm疾病模型的心脏、眼部、大脑、小脑、脊髓、坐骨神经、胃、小肠、肾脏、脾脏、脂肪等多个组织进行IHC染色显示hTTR蛋白阳性，也即ATTRm疾病模型表现为多组织器官hTTR蛋白沉积。因此，本发明提供的具有多组织器官病理特征的疾病模型可在器官层面评估真实治疗效果及不同器官的疗效反应。而人源点突变TTR基因的序列特征使此模型在基因组层面充分反映基因编辑真实治疗效果。
在本发明应用较佳的实施方式中，修饰方法为CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶(ZFN)技术或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术。
ATTRm疾病模型的心脏、眼部、大脑、小脑、脊髓、坐骨神经、胃、小肠、肾脏、脾脏和脂肪至少一个部位的hTTR蛋白阳性。
例如同时在疾病模型的心脏、眼部、胃、小肠、肾脏、脾脏部位的hTTR蛋白阳性，蛋白异常沉积。
在本发明应用较佳的实施方式中，步骤(a)包括向非人哺乳动物单细胞期胚胎中引入：
(i)靶定内源Ttr基因座中的靶向序列的核酸酶试剂或编码核酸酶试剂的多核苷酸；和
(ii)包含核酸插入体的靶向载体，核酸插入体包含侧面具有与内源Ttr基因座中的5’靶向序列对应的5’同源臂和与内源Ttr基因座中的3’靶向序列对应的3’同源臂的人TTR序列，
其中，靶向载体与内源Ttr基因座重组以产生基因修饰的非人动物单细胞期胚胎。
内源Ttr基因座即为野生型非人哺乳动物的Ttr基因座。
在本发明应用较佳的实施方式中，核酸酶试剂包含Cas蛋白质和向导RNA。
在一种可选的实施方式中，向导RNA的序列如SEQ ID NO：2-3所示。
SEQ ID NO：2匹配TTR上的靶位点的正向链，如下所示：GCAAAGGAGGAAGAGTCGAAGGG，SEQ ID NO：3匹配TTR上的靶位点的反向链如下所示：GGGCTGAGTCTCTCAATTCTGGG。
在本发明应用较佳的实施方式中，Cas蛋白质是Cas9蛋白质。
在其他实施方式中，为了筛选获得纯合的带突变位点的人源化纯合子疾病模型，可以继续以F0代与野生型疾病模型交配产生F1代疾病模型，经基因鉴定筛选出阳性疾病模型，测序正确的克隆经鉴定为阳性疾病模型。继续进行扩繁，直到获得纯合疾病模型。
本发明还提供了一种由上述的ATTRm疾病模型的构建方法构建获得ATTRm疾病模型在筛选ATTRm疾病预防或治疗药物中的应用。
ATTRm疾病模型的心脏、眼部、大脑、小脑、脊髓、坐骨神经、胃、小肠、肾脏、脾脏和脂肪至少一个部位的hTTR蛋白阳性。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现，TTR基因的c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变与ATTRm疾病相关，由此构建获得的疾病模型具有与临床患者高度一致的hTTR蛋白多组织器官沉积。发明人发现，该位点基因突变会导致肾脏及脾脏致病。
一方面，本发明提供的靶向载体，可以用于对非人哺乳动物的Ttr基因座的从Ttr起始密码子至Ttr终止密码子的区域进行删除替换，替换为含TTR基因c.191T＞C点突变位点相应的人TTR序列。由此构建的疾病模型在基因组层面完全复制临床ATTRm患者真实基因状态，组织器官层面表现出与临床患者一致的多组织器官沉积，完全模拟ATTRm基因突变致蛋白异常组织沉积的疾病特征，是ATTRm病理机制探索、ATTRm预防或治疗药物筛选、以及治疗方案探索的理想动物模型。
另一方面，在用于治疗方案探索时，人源点突变TTR基因的序列特征使此模型在基因组层面充分反映基因编辑真实治疗效果，多组织器官沉积的病理特征使此模型可在器官层面评估真实治疗效果及不同器官的疗效反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为人源化TTR构建策略图；
图2为F1代小鼠繁育图；
图3为F1代小鼠PCR鉴定策略图；
图4A为F1代小鼠c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变TTR-KI5’端鉴定电泳图(涉及引物F1和R1)；
图4B为F1代小鼠c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变TTR-KI3’端鉴定电泳图(涉及引物F2和R2)；
图4C为c.191T＞C点突变鉴定电泳图，涉及引物F3和R8；
图5为F1代c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变TTR-KI测序鉴定图；
图6为F2代小鼠PCR鉴定策略图；
图7A为F2代c.191T＞C鼠源基因型鉴定电泳图，涉及引物F3和R6；
图7B为F2代c.191T＞C人源基因型鉴定电泳图，涉及引物F3和R1；
图8为TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠肝脏组织hTTR免疫组化染色图；
图9为TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠血清hTTR蛋白WesternBlot图；
图10为TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠各器官组织免疫组化染色图；
图11为TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠眼部异常表型图片(A异常眼部表型；B正常眼部表型)；
图12为患者家系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例构建了一种ATTRm人源化小鼠模型。
人源TTR基因替换区域及插入的人源序列的确定。
根据人源TTR功能，选取携带c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源基因TTR(位于人类第18号染色体)替换鼠源TTR(位于小鼠第18号染色体)基因，选取的突变型人源TTR基因的全长序列信息如SEQ ID NO：1所示，与野生型TTR基因的编码序列相比，突变型TTR基因的编码序列在第191位由碱基T突变为碱基C，rs号为rs104894665。
如图1所示，发明人基于CRISPR/Cas9技术，在人源化替换区域设计针对鼠源序列的sgRNA(single guide RNA)引物。设计并合成识别5’端靶位点和3’端靶位点，并构建sgRNA表达载体，其中两端sgRNA识别位点分别位于小鼠TTR基因的两端，各sgRNA在TTR上的靶位点序列见表1。构建含p.Phe64Ser点突变人源TTR基因元件的靶向载体，同时制备Cas9mRNA。
表1 sgRNA靶点序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| sgRNA1(匹配基因的正向链)SEQ ID NO：2 | GCAAAGGAGGAAGAGTCGAAGGG |
| sgRNA2(匹配基因的反向链)SEQ ID NO：3 | GGGCTGAGTCTCTCAATTCTGGG |
显微注射人源TTR基因靶向载体、sgRNA表达载体以及Cas9mRNA到小鼠受精卵中，将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中，等待F0小鼠出生，经基因筛选获得ATTRm人源化小鼠模型。
实施例2
设计包含人源TTR基因的同源DNA供体和鉴定方案。
参照图2所示的F1代小鼠繁育图，将实施例1经基因鉴定筛选出的中靶小鼠(F0小鼠)与野生型小鼠交配产生F1代小鼠，经基因鉴定筛选出阳性小鼠，测序正确的克隆经鉴定为阳性小鼠。
TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠F1代基因型鉴定:将经基因鉴定筛选出的中靶F0小鼠与野生型C57BL/6背景鼠配繁，其后代小鼠为F1，对获得的F1小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用表2所示的三对引物进行中靶后的两端及点突变序列PCR鉴定(参见图3)。
5’臂正向引物(F1)/3’KI反向引物(R1)分别位于打靶载体的人源片段5’同源臂外和TTR基因内，如该对引物扩增产生2.4kbPCR产物，说明目标载体在小鼠基因组5’进行了有效插入；5’KI正向引物(F2)/3’臂反向引物(R2)分别位于TTR基因序列内及打靶载体的人源片段3’同源臂外，如该对引物扩增产生2.3kb PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组3’进行了有效插入。采用F3和R8引物对TTR c.191T＞C点突变进行PCR验证，若有3.3kb PCR产物，说明说明目标载体点突变序列在小鼠基因组进行了有效插入，进一步行基因测序验证c.191T＞C点突变。
F1代小鼠TTR c.191T＞C-KI5’端PCR实验结果见图4A，5’端PCR实验结果见图4B，编号2、4、5、6的小鼠的人源TTR基因5’、3’均为阳性，分别发现了2.4kbPCR产物、2.3kbPCR产物。F1代小鼠TTR c.191T＞C点突变序列鉴定电泳图参照图4C所示，编号2、4、5、6的小鼠人源TTR基因c.191T＞C点突变序列鉴定均为阳性，有3.3kbPCR产物。表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠。
上述电泳图中WT为野生型小鼠的对照，Water为无模板对照；标记(marker)条带从上至下依次为:
10kb\8kb\6kb\5kb\4kb\3.5kb\3kb\2.5kb\2kb\1.5kb\1kb\0.75kb\0.5kb\0.25kb。
表2 F1代小鼠PCR鉴定引物
发明人进一步对PCR鉴定阳性的F1代小鼠(小鼠ID：2)PCR产物进行测序验证，测序引物参照表3所示，结果如图5所示，结果表明小鼠成功在191位置发生了突变。
表3 F1代测序鉴定所用引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| 5’序列引物(F3) | 5’-GAGCGAGTGTTCCGATACTCTA-3’ |
| 3’序列引物(R3) | 5’-CCCAAGATGGAAAGGATGCCTTTA-3’ |
| 点突变序列引物(F6) | 5’-CGCTCCAGATTTCTAATACCACAA-3’ |
进一步将C57BL/6背景F1代鼠继续扩繁，F2代鼠尾进行TTR c.191T＞C基因PCR鉴定，基因分型-F3/基因分型-R6分别位于打靶载体同源臂5’端和鼠源TTR基因片段内，如该对引物扩增会产生537bp的PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组未有插入；基因分型-F3/基因分型-R1分别位于打靶载体的同源臂5’端和人源TTR基因内，如该对引物扩增会产生502bp的PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组进行了有效插入(参见图6)。
综上，中靶基因型纯合子：只有一条502bp条带；中靶基因型杂合子：有502bp和537bp两条带；野生型：只有一条537bp条带。
F2代小鼠TTR-KI PCR鉴定实验结果见图7A和图7B，编号11小鼠只有537bp条带，没有502bp条带，表明小鼠为hTTR-/-野生型小鼠，编号12小鼠的502bp和537bp条带鉴定均为阳性，表明小鼠为hTTR-KI/-杂合子小鼠。编号13只有502bp条带，没有537bp条带，表明小鼠为hTTR-KI/KI纯合子小鼠。WT为野生型小鼠的对照，水为无模板对照；M为标记(marker)条带:10kb\8kb\6kb\4kb\3kb\2kb\1.5kb\1kb\0.8kb\0.5kb\0.3kb；鉴定引物如表4所示，基因鉴定PCR反应体系如表5所示，基因鉴定PCR反应条件如表6所示。
表4 F2代小鼠PCR鉴定引物
表5基因鉴定PCR反应体系
| PCR体系 | 总体积25ul |
| 鼠尾基因组DNA | 1ul |
| 引物F(10uM) | 1ul |
| 引物R(10uM) | 1ul |
| 2*Premix Taq Polymerase | 12.5ul |
| <![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 9.5ul |
表6基因鉴定PCR反应条件
实施例3
TTR人源化小鼠TTR蛋白表达检测
(1)小鼠模型肝脏TTR蛋白表达检测：取实施例2获得的三月龄C57BL/6背景纯合及杂合TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠，处死取新鲜肝脏组织，用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，做抗原修复后用能识别人源TTR蛋白的抗体进行免疫染色。
检测结果参照图8所示：模型小鼠肝脏组织免疫组织化学染色结果显示阳性，肝细胞内可见TTR蛋白阳性反应，表明模型小鼠肝脏组织可成功表达并分泌人源TTR蛋白。提示模型小鼠可有效产生hTTR蛋白。(HT:hTTR-KI/-杂合子小鼠，HO:hTTR-KI/KI纯合子小鼠。)
(2)血清学人源TTR蛋白表达检测：F1代杂合子交配可获得纯合子，选取C57BL/6背景杂合及纯合突变TTR人源化小鼠血液，离心处理后获得血清，用识别人源TTR蛋白的抗体进行Western Blot实验确定血清中人源TTR蛋白表达水平。
检测结果：如图9所示，模型小鼠血清中可见人源TTR蛋白。提示模型小鼠肝脏组织产生的hTTR蛋白可有效分泌至循环系统中。
(3)TTR人源化小鼠表型评估
(a)小鼠模型组织TTR蛋白表达检测。
三月龄C57BL/6背景纯合及杂合TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠处死取新鲜器官组织，用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，做抗原修复后用能识别人源TTR蛋白的抗体进行免疫染色。
检测结果：如图10所示，模型小鼠心脏、眼、大脑、小脑、脊髓、坐骨神经、胃、小肠、胰腺、肾脏、脾脏、脂肪组织均显示阳性，表现人源TTR蛋白沉积。提示此模型小鼠表现为多组织器官人源TTR蛋白沉积，本发明为首个表现出与临床患者高度一致的人源TTR蛋白多组织器官沉积的人源化动物模型。
此外，本发明还首次揭示了该c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变与患者胃肠道疾病表型间的关联性。临床患者本身无肾脏、脾脏相关症状，但疾病模型显示肾脏、脾脏人源TTR沉积，也即首次发现该位点基因突变的肾脏及脾脏致病性。
(b)小鼠模型眼部表型评估
三月龄的杂合TTR基因c.191T＞C(p.Phe64Ser)点突变人源化小鼠肉眼可观察到眼部玻璃体混浊样表型(参见图11)。
综上，本发明提供的疾病模型能完全模拟ATTRm基因突变致蛋白异常组织沉积的疾病特征，为ATTRm病理机制探索的理想动物模型。本发明提供的疾病模型用于治疗方案探索时，人源点突变TTR基因的序列特征使此模型在基因组层面充分反映基因编辑真实治疗效果，多组织器官沉积的病理特征使此模型可在器官层面评估真实治疗效果及不同器官的疗效反应。本发明的提出为临床药物的筛选提供了强有力的模型基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向载体，其特征在于，所述靶向载体含携带点突变的人TTR序列，且所述人TTR序列包括TTR编码序列和非编码序列；
所述点突变是指人TTR基因c.191T＞C点突变。
2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，携带点突变的人TTR序列与SEQ IDNO:1所示的序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的一致性。
3.根据权利要求1或2所述的靶向载体，其特征在于，所述靶向载体在所述人TTR序列两端还分别设置有非人哺乳动物的Ttr5’非翻译区域和非人哺乳动物的Ttr3’非翻译区域；
优选地，所述非人哺乳动物选自大鼠、小鼠或猴；
优选地，所述非人哺乳动物选自小鼠。
4.一种细胞，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的靶向载体。
5.一种ATTRm疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(a)修饰非人哺乳动物单细胞期胚胎的基因组，使所述非人哺乳动物单细胞期胚胎的基因组中包含携带点突变的人TTR序列；
(b)选择基因修饰的非人哺乳动物单细胞期胚胎，所述非人哺乳动物单细胞期胚胎在其基因组中包含携带点突变的人TTR序列；
(c)在代孕母体中孕育所述基因修饰的非人哺乳动物单细胞期胚胎，其中所述代孕母体产生F0子代基因修饰的非人哺乳动物。
6.根据权利要求5所述的ATTRm疾病模型的构建方法，其特征在于，所述修饰方法为CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术或转录激活因子样效应物核酸酶技术；
优选地，所述ATTRm疾病模型的心脏、眼部、大脑、小脑、脊髓、坐骨神经、胃、小肠、肾脏、脾脏和脂肪至少一个部位的hTTR蛋白阳性。
7.根据权利要求6所述的ATTRm疾病模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(a)包括向所述非人哺乳动物单细胞期胚胎中引入：
(i)靶定内源Ttr基因座中的靶向序列的核酸酶试剂或编码所述核酸酶试剂的多核苷酸；
和(ii)包含核酸插入体的权利要求1-3任一项所述的靶向载体，所述核酸插入体包含侧面具有与所述内源Ttr基因座中的5’靶向序列对应的5’同源臂和与所述内源Ttr基因座中的3’靶向序列对应的3’同源臂的人TTR序列，
其中，所述靶向载体与所述内源Ttr基因座重组以产生基因修饰的非人动物单细胞期胚胎。
8.根据权利要求6所述的ATTRm疾病模型的构建方法，其特征在于，所述核酸酶试剂包含Cas蛋白质和向导RNA；
优选地，所述向导RNA的序列如SEQ ID NO：2-3所示。
9.根据权利要求8所述的ATTRm疾病模型的构建方法，其特征在于，所述Cas蛋白质是Cas9蛋白质。
10.如权利要求5-9任一项所述的ATTRm疾病模型的构建方法构建获得的ATTRm疾病模型在筛选ATTRm疾病预防或治疗药物中的应用；
优选地，所述ATTRm疾病模型的心脏、眼部、大脑、小脑、脊髓、坐骨神经、胃、小肠、肾脏、脾脏和脂肪至少一个部位的hTTR蛋白阳性。
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-
2022
- 2022-12-01 CN CN202211532416.9A patent/CN116083485B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116083485B (zh) | 2024-09-13 |
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