CN116143447A - Dna合成柱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA合成柱及其制备方法，属于DNA合成技术领域；该DNA合成柱的制备方法包括将CPG载体与高分子聚合物烧结制备得到DNA合成柱。通过该DNA合成柱的制备方法制备的DNA合成柱在用于合成DNA时可以提高溶剂利用效率，提高粗纯度和合成收率，降低合成长链基因错误率，解决兼容性的问题，降低合成过程的突变率，使产品质量更加可靠。
Description
技术领域
本发明涉及DNA合成技术领域，尤其涉及一种DNA合成柱及其制备方法。
背景技术
寡核苷酸药物能够降低人体对药物的耐受性，提高药物的利用率，有效化解药物的毒副作用，实现从源头上提高治疗效果。随着生物科技的高速发展，人们对寡核苷酸药物的研究也不断深入，对寡核苷酸的合成质量也不断提出了更高的要求。
现阶段常采用孔径可控纳米多孔玻璃(Controlled pore glass，简称CPG)被用作寡核苷酸化学合成领域最普遍稳定的载体，并利用DNA合成柱等工具来合成DNA片段。因此，DNA合成柱一般是利用孔径可控纳米多孔玻璃与高分子量的聚合物制备得到，DNA合成柱的性能好坏将直接影响DNA的合成质量。其中，CPG作为固相合成的载体，其颗粒尺寸大小、孔径、孔隙率大小、孔容和密度以及比表面积等物理参数都会影响CPG在合成DNA过程中与溶液的交换行为、配体负载和分布以及反应动力学，从而影响DNA合成效率、纯度和重现性。
目前，采用CPG载体制备的DNA合成柱的性能欠佳，尤其在合成长链DNA时，合成效果和合成效率偏低，例如在合成120nt长度时的突变率很高，导致合成的DNA质量不稳定。
发明内容
针对传统DNA合成柱合成长链DNA时突变率过高等问题中的至少一部分，本发明提供了一种优化的DNA合成柱及其制备方法。
根据本发明的一个方面，提供一种DNA合成柱的制备方法，包括：将CPG载体与高分子聚合物烧结制备得到所述DNA合成柱。
本发明的上述技术方案中提出了一种性能优越的DNA合成柱的制备方法，制备的DNA合成柱在用于合成DNA时可以提高溶剂利用效率，提高粗纯度和合成收率，降低合成长链基因错误率，解决兼容性的问题，降低合成过程的突变率，使产品质量更加可靠。
在进一步优选的方案中，所述CPG载体的粒度为大于等于60目。CPG载体颗粒的尺寸不宜过大，若尺寸过大，可能导致合成DNA时合成试剂在CPG孔道内接触不充分，造成合成长链基因错误率增大的问题。本方案中通过控制合适CPG粒度范围，使得其制备的DNA合成柱可以与试剂充分接触，从而降低合成过程中的单碱基错误率。
优选地，所述CPG载体的粒度为120-160目。此时既可以避免CPG载体尺寸过大导致基因错误率增大，还可以避免CPG载体尺寸太小导致CPG颗粒间的空隙增多而降低合成效率的问题。并且，采用120-200目CPG载体制备的DNA合成柱的气阻值分布更均匀，有利于提高基因合成过程的重现性。
在进一步优选的方案中，所述CPG载体的载量为5-100μmol/g；在本方案提供的CPG载体的载量范围下，制备的DNA合成柱具有优异的合成效果，提高了长链基因合成效率，并且可以降低单碱基错误率。
优选地，所述CPG载体的载量为5-25μmol/g，此时可以进一步提高基因合成效率。
在进一步优选的方案中，所述CPG载体的孔径为
以上；在本方案中采用的CPG载体的孔径范围下，有利于增加基因合成效率，并且可以降低单碱基错误率。
优选地，所述CPG载体的孔径为
以上，此时基因合成效率基本可以达到最大值，同时可以进一步降低合成长链基因的单碱基错误率。
在进一步优选的方案中，所述CPG载体的密度为0.15-0.55mg/ml；在本方案中采用的CPG载体的密度范围下，有利于CPG载体与合成溶剂充分接触，从而提高基因合成效率，同时可以降低合成基因的单碱基错误率。
优选地，所述CPG载体的密度为0.25-0.35mg/ml，此时可以进一步提高基因合成效率，并且降低单碱基错误率可以达到最优的效果。
在进一步优选的方案中，所述高分子聚合物为聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯中的至少一种。采用聚乙烯、聚丙烯等常见的聚合物与CPG载体混合作为原材料，该材料来源广泛，可以有效降低生产成本，而且制备的DNA合成柱具有优异的合成效果。
在进一步优选的方案中，所述高分子聚合物为聚乙烯，所述聚乙烯的分子量为100万以上。将高分子聚乙烯与优化的CPG载体烧结制备DNA合成柱，可以进一步提高DNA合成柱的合成效率。
在进一步优选的方案中，所述制备方法具体包括：将CPG载体与高分子聚合物按照5.7:41.4-40:7.1的体积比混匀后，在150-250℃下烧结30-120min得到所述DNA合成柱。本方案中将CPG载体与高分子聚合物混合烧结制备DNA合成柱，制备工艺简便快捷，制备的DNA合成柱的合成效率较高，且合成长链DNA的突变率较低，可以有效合成质量稳定的DNA片段。
在进一步优选的方案中，所述制备方法具体包括如下步骤：
取重量为2-10g、载量为5-25μmol/g、粒度为60目以上的CPG载体放入混合容器中，并添加分子量为100万以上的聚乙烯粉末，直至所述混合容器中的固体总体积为s，将所述混合容器颠倒至少一次进行混匀，再继续添加所述聚乙烯粉末以将所述混合容器中的固体总体积维持为s，然后进行混匀；
在含有x个孔、每个孔的体积为v的模具内，将混匀后的CPG载体与聚乙烯粉末均分至每个孔中完成装料；
装料后在150-250℃下烧结30-120min得到DNA合成柱；
其中，s＝x·v，x＞0，v＞0，且x为整数。
本方案中，将优化的CPG颗粒与高分子量的聚乙烯或者其他聚合物在一定温度下烧结得到DNA合成柱，优化的CPG载体颗粒粒径均一，孔径均一，在固定的密度范围与高孔隙率条件下与高分子量的聚乙烯均匀分布，由高分子量的聚乙烯固定的孔径均一的CPG载体气阻值均匀，合成试剂在每个合成柱的反应效率均一，用于合成120bp长度的片段时，突变率和错误率大大降低，单碱基错误率降至0.09％，且每个合成柱的差异性很小，尤其适用于长链DNA合成。
根据本发明的另一个方面，提供一种DNA合成柱，由上述的方法制备而成。通过上述制备方法制备DNA合成柱的工艺过程简便快捷易操作，将DNA合成柱用于合成DNA时，溶剂利用效率高，而且合成长链基因的错误率极低，与市场上目前销售的固体载体相比，具有更高的粗纯度和合成收率，解决了兼容性的问题，降低了合成过程的突变率，使产品质量更加可靠。
综上，本发明提供的DNA合成柱及其制备方法至少具有以下有益效果：本发明中选取合适范围的CPG载量大小、颗粒尺寸、孔径大小、孔隙率、颗粒密度、孔容、比表面积等物理参数，使得制备的DNA合成柱具有优异的合成效果，可以提高基因合成效率纯度和重现性。制备的DNA合成柱用于合成120bp的长度时，单碱基错误率大大降低，具体地，单碱基错误率可以降至0.09％。同时，优化的DNA合成柱用于384合成板时，每个合成柱的气阻值分布均匀，每个孔的合成效率与条带的错误率一致，基因合成过程的重现性大大提高，可以为基因合成行业，寡核苷酸药物研究等领域起到强大的推动作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的60-80目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图2是本发明实施例1提供的80-100目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图3是本发明实施例1提供的100-120目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图4是本发明实施例1提供的120-140目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图5是本发明实施例1提供的140-160目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图6是本发明实施例1提供的160-180目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图7是本发明实施例1提供的180-200目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图8是本发明实施例1提供的200-250目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图9是本发明实施例1提供的250目以上CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图10是本发明实施例2提供的120-160目CPG载体制备的DNA合成柱的SEM图；
图11是实施例1中采用60目以上的CPG载体制备的DNA合成柱的测试结果图；
图12是实施例1中采用120-200目的CPG载体制备的DNA合成柱的测试结果图；
图13是实施例1中采用250目以上的CPG载体制备的DNA合成柱的测试结果图；
图14是CPG链接中间体结构图；
图15是寡核苷裂解过程示意图；
图16示出了实施例1至实施例5中采用120-200目的CPG载体制备的DNA合成柱用于合成120bp时的单碱基错误率对比图；
图17示出了实施例1中采用不同粒径的CPG载体制备的DNA合成柱用于合成120bp时的单碱基错误率对比图；
图18示出了120-160目、
孔径CPG载体制备的DNA合成柱的孔径分布图；
图19示出了120-160目、
孔径CPG载体制备的DNA合成柱的孔径分布图；
图20示出了120-160目、
孔径CPG载体制备的DNA合成柱的孔径分布图。
具体实施方式
应当理解，本文给出的具体实施例是出于向本领域技术人员解释的目的，仅是示例性的，而非限制性的。
在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的透彻理解。然而，对于本领域普通技术人员来说，明显的是，不需要采用具体细节来实践本发明。在其他情况下，未详细描述众所周知的步骤或操作，以避免模糊本发明。
根据本发明实施例提供的DNA合成柱的制备方法，包括：将CPG载体与高分子聚合物按照5.7:41.4-40:7.1的体积比混匀后，在150-250℃下烧结30-120min得到DNA合成柱。
例如，CPG载体与高分子聚合物的体积比可以为5.7:41.4，3:20，1:4，1:1，4:1，40:7.1或者5.7:41.4-40:7.1之间的任意数值；烧结温度可以为150℃，160℃，170℃，180℃，190℃，200℃，210℃，220℃，230℃，240℃，250℃或者150-250℃之间的任意数值；烧结时间可以为30min，40min，50min，60min，70min，80min，90min，100min，110min，120min或者30-120min之间的任意数值。
在一些可选的实施例中，CPG载体的粒度为大于等于60目，且CPG载体的粒度优选为120-160目。
例如，CPG载体的粒度可以为60目，80目，100目，120目，140目，160目，180目，200目，250目以上或者大于等于60目的任意数值。
在一些可选的实施例中，CPG载体的载量为5-100μmol/g，且CPG载体的载量优选为5-25μmol/g。
例如，CPG载体的载量可以为5μmol/g，8μmol/g，10μmol/g，12μmol/g，15μmol/g，18μmol/g，20μmol/g，22μmol/g，25μmol/g，30μmol/g，50μmol/g，80μmol/g，90μmol/g，100μmol/g或者5-100μmol/g之间的任意数值。
在一些可选的实施例中，CPG载体的孔径为
以上，且CPG载体的孔径优选为
以上。
例如，CPG载体的孔径可以为
以上或者/>
以上的任意数值。
在一些可选的实施例中，CPG载体的密度为0.15-0.55mg/ml，且CPG载体的密度优选为0.25-0.35mg/ml。
例如，CPG载体的密度可以为0.15mg/ml，0.20mg/ml，0.25mg/ml，0.30mg/ml，0.35mg/ml，0.40mg/ml，0.45mg/ml，0.50mg/ml，0.55mg/ml或者0.15-0.55mg/ml之间的任意数值。
在一些可选的实施例中，高分子聚合物为聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯中的至少一种。
例如，制备DNA合成柱所用的聚合物可以为聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯中的任意一种，或者为聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯中的任意两种组合，或者为聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯三者混合而成。
在一些可选的实施例中，高分子聚合物为聚乙烯，聚乙烯的分子量为100万以上。例如，聚乙烯的分子量可以为100万，200万，300万，400万以上或者100万以上的任意数值。
在一些可选的实施例中，DNA合成柱的制备方法包括：
取重量为2-10g、载量为5-25μmol/g、粒度为60目以上的CPG载体放入混合容器中，并添加分子量为100万以上的聚乙烯粉末，直至混合容器中的固体总体积为s，将混合容器颠倒至少一次进行混匀，再继续添加聚乙烯粉末以将混合容器中的固体总体积维持为s，然后进行混匀，混匀时可以采用震动方式完成DNA合成柱预填充，且震动混合后的CPG载体与聚乙烯的体积比为5.7:41.4-40:7.1；
在含有x个孔、每个孔的体积为v的模具内，将混匀后的CPG载体与聚乙烯粉末均分至每个孔中完成装料；
装料后在150-250℃下烧结30-120min得到DNA合成柱；
其中，s＝x·v，x＞0，v＞0，且x为整数。
例如，DNA合成柱的制备方法具体可以包括如下步骤：
1.原料：准备载量为5-25μmol/g、60目以上的CPG载体，以及分子量为300万的UHMW-PE(超高分子量聚乙烯)粉末；
2.原料体积计算：选择用于制备DNA合成柱的模具，模具具有500个孔，可以同时制备500颗DNA合成柱，每颗DNA合成柱的直径为2mm，厚度为30mm，体积为94.25μl，总体积为47.125ml；
3.合成载体烧结原料配置：称取2-10g CPG载体放入50ml量筒，缓慢添加UHMW-PE粉末到47.125ml刻度，颠倒混匀数次，再用UHMW-PE补齐到47.125ml位置，然后进行混匀；
4.装模具：在含有500个直径为2mm、厚度为30mm的孔的铝制模具内，将混合好的CPG载体与UHMW-PE进行均分至每个孔中完成装料；
5.烧结：在200℃下，烧结50min后，水冷，取出制备的DNA合成柱。
根据本发明的另一实施例提供一种DNA合成柱，由上述实施例中的制备方法制备而成。
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.原料：准备密度为0.25-0.35g/ml、孔径为
载量为25μmol/g、60目以上的CPG载体，将固定载量的CPG载体按照60-80目，80-100目，100-120目，120-140目，140-160目，160-180目，180-200目，100-200目，120-200目，200-250目，250目以上进行筛分，并准备分子量为300万的UHMW-PE粉末。
2.原料体积计算：选择用于制备DNA合成柱的模具，模具具有500个孔，可以同时制备500颗DNA合成柱，每颗DNA合成柱的直径为2mm，厚度为30mm，体积为94.25μl，总体积为47.125ml；
3.合成载体烧结原料配置：称取2g 60-80目的CPG载体放入50ml量筒，缓慢添加UHMW-PE粉末到47.125ml刻度，颠倒混匀数次，再用UHMW-PE补齐到47.125ml位置，然后进行混匀。
4.装模具：在含有500个直径为2mm、厚度为30mm的孔的铝制模具内，将混合好的CPG载体与UHMW-PE进行均分至每个孔中完成装料。
5.烧结：在200℃下，烧结50min后，水冷，取出制备的DNA合成柱。
6.采用不同粒径范围的CPG载体重复步骤3-5，分别制备得到DNA合成柱。
测量不同粒径CPG载体的载量以及DNA合成柱的DNA合成量如下表所示。
表1示出了实施例1中CPG载体和DNA合成柱的测试结果
实施例2
1.原料：准备密度为0.25-0.35g/ml、孔径为
载量为20μmol/g、60目以上的CPG载体，将固定载量的CPG载体按照60-80目，80-100目，100-120目，120-140目，140-160目，160-180目，180-200目，100-200目，120-200目，200-250目，250目以上进行筛分，并准备分子量为300万的UHMW-PE粉末。
2.原料体积计算：选择用于制备DNA合成柱的模具，模具具有500个孔，可以同时制备500颗DNA合成柱，每颗DNA合成柱的直径为2mm，厚度为30mm，体积为94.25μl，总体积为47.125ml；
3.合成载体烧结原料配置：称取2.5g 60-80目的CPG载体放入50ml量筒，缓慢添加UHMW-PE粉末到47.125ml刻度，颠倒混匀数次，再用UHMW-PE补齐到47.125ml位置，然后进行混匀。
4.装模具：在含有500个直径为2mm、厚度为30mm的孔的铝制模具内，将混合好的CPG载体与UHMW-PE进行均分至每个孔中完成装料。
5.烧结：在200℃下，烧结50min后，水冷，取出制备的DNA合成柱。
6.采用不同粒径范围的CPG载体重复步骤3-5，分别制备得到DNA合成柱。
测量不同粒径CPG载体的载量以及DNA合成柱的DNA合成量如下表所示。
表2示出了实施例2中CPG载体和DNA合成柱的测试结果
实施例3
1.原料：准备密度为0.25-0.35g/ml、孔径为
载量为15μmol/g、60目以上的CPG载体，将固定载量的CPG载体按照60-80目，80-100目，100-120目，120-140目，140-160目，160-180目，180-200目，100-200目，120-200目，200-250目，250目以上进行筛分，并准备分子量为300万的UHMW-PE粉末。
2.原料体积计算：选择用于制备DNA合成柱的模具，模具具有500个孔，可以同时制备500颗DNA合成柱，每颗DNA合成柱的直径为2mm，厚度为30mm，体积为94.25μl，总体积为47.125ml；
3.合成载体烧结原料配置：称取3.33g 60-80目的CPG载体放入50ml量筒，缓慢添加UHMW-PE粉末到47.125ml刻度，颠倒混匀数次，再用UHMW-PE补齐到47.125ml位置，然后进行混匀。
4.装模具：在含有500个直径为2mm、厚度为30mm的孔的铝制模具内，将混合好的CPG载体与UHMW-PE进行均分至每个孔中完成装料。
5.烧结：在200℃下，烧结50min后，水冷，取出制备的DNA合成柱。
6.采用不同粒径范围的CPG载体重复步骤3-5，分别制备得到DNA合成柱。
测量不同粒径CPG载体的载量以及DNA合成柱的DNA合成量如下表所示。
表3示出了实施例3中CPG载体和DNA合成柱的测试结果
实施例4
1.原料：准备密度为0.25-0.35g/ml、孔径为
载量为10μmol/g、60目以上的CPG载体，将固定载量的CPG载体按照60-80目，80-100目，100-120目，120-140目，140-160目，160-180目，180-200目，100-200目，120-200目，200-250目，250目以上进行筛分，并准备分子量为300万的UHMW-PE粉末。
2.原料体积计算：选择用于制备DNA合成柱的模具，模具具有500个孔，可以同时制备500颗DNA合成柱，每颗DNA合成柱的直径为2mm，厚度为30mm，体积为94.25μl，总体积为47.125ml；
3.合成载体烧结原料配置：称取5g 60-80目的CPG载体放入50ml量筒，缓慢添加UHMW-PE粉末到47.125ml刻度，颠倒混匀数次，再用UHMW-PE补齐到47.125ml位置，然后进行混匀。
4.装模具：在含有500个直径为2mm、厚度为30mm的孔的铝制模具内，将混合好的CPG载体与UHMW-PE进行均分至每个孔中完成装料。
5.烧结：在200℃下，烧结50min后，水冷，取出制备的DNA合成柱。
6.采用不同粒径范围的CPG载体重复步骤3-5，分别制备得到DNA合成柱。
测量不同粒径CPG载体的载量以及DNA合成柱的DNA合成量如下表所示。
表4示出了实施例4中CPG载体和DNA合成柱的测试结果
实施例5
1.原料：准备密度为0.25-0.35g/ml、孔径为
载量为5μmol/g、60目以上的CPG载体，将固定载量的CPG载体按照60-80目，80-100目，100-120目，120-140目，140-160目，160-180目，180-200目，100-200目，120-200目，200-250目，250目以上进行筛分，并准备分子量为300万的UHMW-PE粉末。
2.原料体积计算：选择用于制备DNA合成柱的模具，模具具有500个孔，可以同时制备500颗DNA合成柱，每颗DNA合成柱的直径为2mm，厚度为30mm，体积为94.25μl，总体积为47.125ml；
3.合成载体烧结原料配置：称取10g 60-80目的CPG载体放入50ml量筒，缓慢添加UHMW-PE粉末到47.125ml刻度，颠倒混匀数次，再用UHMW-PE补齐到47.125ml位置，然后进行混匀。
4.装模具：在含有500个直径为2mm、厚度为30mm的孔的铝制模具内，将混合好的CPG载体与UHMW-PE进行均分至每个孔中完成装料。
5.烧结：在200℃下，烧结50min后，水冷，取出制备的DNA合成柱。
6.采用不同粒径范围的CPG载体重复步骤3-5，分别制备得到DNA合成柱。
测量不同粒径CPG载体的载量以及DNA合成柱的DNA合成量如下表所示。
表5示出了实施例5中CPG载体和DNA合成柱的测试结果
根据以上表1至表5中不同粒径尺寸和载量CPG测试结果可以看出，将初始CPG载体进行筛分后，粒径为120-200目的CPG载体的载量偏差较小，并且随着CPG颗粒的粒径增大，CPG的载量下降趋势明显，高于200目以上的CPG载量也呈下降趋势。并且，根据图1-图10可见制备的DNA合成柱中CPG均匀分布，则通过调控CPG的尺寸等参数，可以优化DNA合成柱的合成效果和合成效率。
384孔合成板气阻值测试
测试步骤：
将实施例1中采用不同粒径范围的CPG载体制备的直径为2mm、厚度为30mm的DNA合成柱装配到384孔合成空板内。
用手堵住管路抽气口，记录产生的最大负压值，负压表的测量结果显示为28.0英寸汞柱(inHg，1inHg＝25.4mmHg)左右。
将抽气口插在384孔合成板底部的柱子上，产生实际负压并记录(因为DNA合成柱存在透气性，所以实际负压不可能达到最大值)。
用最大负压值减去实际负压值，得出的结果再乘以25.4就是最终得到的气阻值，也就是压降值。
图11为实施例1中采用60目以上的CPG载体制备的DNA合成柱的测试结果图。
图12为实施例1中采用120-200目的CPG载体制备的DNA合成柱的测试结果图。
图13为实施例1中采用250目以上的CPG载体制备的DNA合成柱的测试结果图。
由图11-图13所示的气阻值测试结果可见，当CPG载体的颗粒粒径区间较大时，气阻值分布不均匀，而采用120-200目CPG载体制备的DNA合成柱的气阻值分布比较均匀。
合成基因片段并对比单碱基错误率
合成过程步骤如下：
步骤1：将预先连接在载体上的连接有保护基团(如图14)的核苷酸单体去除保护基团(二甲氧基三苯甲基基团)，获得游离的5′-羟基；
步骤2：用亚磷酰胺及活化剂来活化载体上新的碱基单体的3′端，得到核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与步骤1中游离的5′-羟基进行缩合反应，得到核苷亚磷酸酯中间体；
步骤3：将步骤2所得核苷亚磷酸酯中间体的亚磷酰氧化成磷酸三酯；
步骤4：进行盖帽反应，消除未反应完的游离5′-羟基；
步骤5：用洗涤液将步骤1至步骤4中的残存试剂清除；
步骤6：重复步骤1至步骤5；
步骤7：将脱氧核苷酸引物预产物从载体上分离(如图15)，得到脱氧核苷酸引物。
通过上述步骤合成80-140bp的基因片段，然后用于PCR扩增，扩增条件为60℃进行不同的循环，合成过程采用的合成参数列于下表6。碱基正确条数与错误率依据二代测序进行分析。
表6示出了合成过程采用的各合成参数
| 单体浓度 | 0.1-0.2M乙腈(ACN) |
| 单体过量 | 1.5-2.0equiv |
| 偶联 | 3min循环 |
| 活化剂 | 0.3M BTT |
| 氧化剂 | 2.0equiv.50mM I2Pyr/H2O 9:1(v/v)2 |
| 氧化时间 | 4min |
| 盖帽 | 0.5Column volumes(CV),0.5min CT |
将实施例1至实施例5所制备的DNA合成柱与384孔合成板配合合成80-140bp的基因片段，PCR扩增至1000万条左右，用二代测序测试每个条带的碱基错误个数，并计算单碱基错误率，其中单碱基错误率计算方法为错误碱基个数除以总碱基个数，结果如图16和图17所示。
图16示出了实施例1至实施例5中采用120-200目的CPG载体制备的DNA合成柱用于合成120bp时的单碱基错误率对比图。
如图16所示，随着DNA合成柱中CPG的重量比例增加，120-200目CPG的单碱基合成错误率增加，因为CPG颗粒间的空隙增多，更多的合成试剂从CPG的颗粒间流过，造成了合成效率的下降，这与上述气阻值测试结果相一致，随着颗粒数目的增多，颗粒间的间隙增大，气阻值有前移的趋势，如图11-图13对比。
图17示出了实施例1中采用不同粒径的CPG载体制备的DNA合成柱用于合成120bp时的单碱基错误率对比图。
如图17所示，120-160目CPG载体制备的DNA合成柱的单碱基错误率为最低，当颗粒较大和较小时，单碱基错误率都有升高趋势，并且颗粒范围越大单碱基的错误率会更高。综合以上条件，从载量的均匀性以及单碱基错误率数据分析，120-160目为最佳颗粒大小。
由上可以看出
孔径、不同颗粒大小以及不同载量的CPG对长片段基因合成的影响，固定载量的60目以上CPG经筛分后测试CPG载量有较大差距，大颗粒与小颗粒间的载量差距最为明显，这是由于受CPG制备工艺的限制，在进行制孔过程中，大颗粒的CPG孔道不能完全暴露造成；从气阻值测试来看120-200目的CPG气阻值分布较为均匀，并且120-200目的载量差距较小，从实施例1-5数据来看，随着CPG在合成柱中占的比例增加，单碱基错误率呈上升趋势；从实施例1不同粒径单碱基错误率分析，120-160单碱基错误率最低，小于120目时随着颗粒增大单碱基错误率有所增加，这是由于颗粒太大，合成试剂在CPG孔道内接触不充分导致，大于200目，错误率上升明显，这是因为CPG颗粒间的空隙增多，更多的合成试剂从CPG的颗粒间流过，造成了合成效率的下降。综合以上数据，可以看出120-160目CPG为优选的颗粒大小。
对比测试
对比例1中采用与实施例1中相同的制备步骤和制备条件，区别仅在于分别选取
的不同孔径CPG载体进行制备DNA合成柱。
图18示出了120-160目、
孔径CPG载体制备的DNA合成柱的孔径分布图。
图19示出了120-160目、
孔径CPG载体制备的DNA合成柱的孔径分布图。
图20示出了120-160目、
孔径CPG载体制备的DNA合成柱的孔径分布图。
对比例2中采用与实施例1中相同的制备步骤和制备条件，区别仅在于分别选取孔径为
密度为0.15-0.25ml/g，0.25-0.35ml/g，0.35-0.45ml/g，0.45-0.55ml/g的CPG载体进行制备DNA合成柱，结果如下表。
表7示出了不同孔径、不同密度的CPG载体制备的DNA合成柱的物理参数。
由以上对比例1和对比例2可见，对于长片段基因合成，随着孔径的增加，基因合成效率增加，但是当孔径增加到一定限度，合成效率基本不再变化，如合成80bp基因片段，当孔径达到
时，单碱基错误率达到较优效果，当孔径再增大时，单碱基错误率变化很小；合成120bp基因片段时，当孔径达到/>
时，单碱基错误率达到最佳，当孔径再增大时，单碱基错误率变化很小；合成140bp基因片段，当孔径达到/>
时，单碱基错误率比
还有降低的趋势。对于CPG的密度进行了范围性测试，对比可见当CPG密度在0.25-0.35ml/g时CPG的单碱基错误率达到最佳水平，CPG的孔容随密度的增加略有增加，CPG的孔隙率随密度的增加而降低。
本发明实施例中通过控制CPG载量大小，载体CPG颗粒尺寸，孔径大小，孔隙率，颗粒密度，孔容，比表面积等物理参数，使得制备的DNA合成柱具有优异的合成效果，提高了基因合成效率；并且，在以上测试方法下，用于120bp长片段基因合成，当孔径达到
以上，颗粒尺寸在120-160目，颗粒密度在0.25-0.35mg/ml时，单碱基错误率可以达到最优的效果。
以上描述的各技术特征可以任意地组合。尽管未对这些技术特征的所有可能组合进行描述，但这些技术特征的任何组合都应当被认为由本说明书涵盖，只要这样的组合不存在矛盾。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种DNA合成柱的制备方法，其特征在于，将CPG载体与高分子聚合物烧结制备得到所述DNA合成柱。
2.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述CPG载体的粒度为大于等于60目；
优选地，所述CPG载体的粒度为120-160目。
3.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述CPG载体的载量为5-100μmol/g；
优选地，所述CPG载体的载量为5-25μmol/g。
4.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述CPG载体的孔径为
以上；
优选地，所述CPG载体的孔径为
以上。
5.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述CPG载体的密度为0.15-0.55mg/ml；
优选地，所述CPG载体的密度为0.25-0.35mg/ml。
6.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述高分子聚合物为聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述高分子聚合物为聚乙烯，所述聚乙烯的分子量为100万以上。
8.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将CPG载体与高分子聚合物按照5.7:41.4-40:7.1的体积比混匀后，在150-250℃下烧结30-120min得到所述DNA合成柱。
9.根据权利要求1所述的DNA合成柱的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
取重量为2-10g、载量为5-25μmol/g、粒度为60目以上的CPG载体放入混合容器中，并添加分子量为100万以上的聚乙烯粉末，直至所述混合容器中的固体总体积为s，将所述混合容器颠倒至少一次进行混匀，再继续添加所述聚乙烯粉末以将所述混合容器中的固体总体积维持为s，然后进行混匀；
在含有x个孔、每个孔的体积为v的模具内，将混匀后的CPG载体与聚乙烯粉末均分至每个孔中完成装料；
装料后在150-250℃下烧结30-120min得到DNA合成柱；
其中，s＝x·v，x＞0，v＞0，且x为整数。
10.一种DNA合成柱，其特征在于，由权利要求1-9中任一项所述的方法制备而成。
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