CN1431218A

CN1431218A - 一种用于核酸合成载体及其制作方法和应用

Info

Publication number: CN1431218A
Application number: CN 03112773
Authority: CN
Inventors: 刘全俊; 王红; 肖鹏峰; 陆祖宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-01-28
Filing date: 2003-01-28
Publication date: 2003-07-23

Abstract

本发明一种用于核酸合成载体及其制作方法和应用。公开了一种替代控孔玻璃珠(CPG)的纳米磁性微粒作为合成载体的核酸合成方法。这种纳米磁性微粒是由微乳法合成的氧化铁的顺磁性的纳米颗粒，在其外表面取聚合一层有机高分子化合物，通过一次或多次修饰有机高分子化合物产生氨甲基后，可采用采用亚磷酸三酯法合成核酸，也可在其表面合成肽核酸(PNA)或多肽。由于纳米磁性微粒具有巨大的比表面积，因此，在同样的合成条件下，其合成产量比CPG法要高，并且此方法合成的核酸可以形成合成阵列，利于提高合成批量，甚至可以直接使用。

Description

一种用于核酸合成载体及其制作方法和应用

技术领域

本发明涉及一种核酸合成载体，其原理是利用纳米颗粒的巨大比表面积作为核酸合成的固相支持物，该核酸合成载体，用于核酸提高核酸合成的产量及产率。

背景技术

随着基因组研究的深入，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。核酸序列信息的高通量检测和分析技术将成为医学等生命科学领域的核心技术之一。人们需要发展高通量、准确、低成本基因信息的检测方法。近来，核酸合成技术越来越受到人们的重视。但是，目前核酸合成受到技术限制，尚存在一些问题，同时合成的核酸种类有限，影响其合成产品种类数目。

商业化核酸合的载体是控孔玻璃(CPG)和聚苯乙烯。当应用珀金—埃尔默产392/394型DNA合成仪及其试剂时，通过测量DMT阳离子估计，载体产生大于98％的偶联效率。CPG是一种多孔非膨胀的颗粒，颗粒直径大约150μm，孔径500。大孔CPG载体(1000)也可用于合成60个碱基以上的寡核苷酸，聚苯乙烯是一种多孔非膨胀颗粒的疏水载体，颗粒直径50～700μm，孔径1000 。载体与四种核苷A，G，C，T共价结合。在这些核苷上的反应基团被封闭或被保护，防止不必要的副反应。它们的5′-OH都被DMT基团封闭，腺苷(A)、胞苷(C)和鸟苷(G)上环外氨基也与保护基键合。对于标准的和快速寡核苷酸脱保护(FOD)亚磷酰胺的保护基是不同的，标准亚磷酰胺应用苯甲酰基保护腺苷和胞苷(A^bz，C^bz)，而用异丁酰基保护鸟苷(G^ibu)。FOD亚磷酰胺应用二甲基甲眯基保护腺苷和鸟苷(A^dmf，C^dmf)，用异丁酰基保护胞苷(C^ibu)。胸苷不需要保护要保护基，因为胸苷环没有环外氨基。CFG有一个连接臂通过硅氧烷键连接到其表面。所有的游离硅醇基都被封闭，以防发生副反应。聚苯乙烯有一个氨基甲基连接臂连接到其表面。因为聚苯乙烯表面是惰性的，所以很少发生副反应。核苷的3′-OH通过琥珀酸酯键共价地结合到载体的连接臂上。这个琥珀酸酯键对碱不稳定，用氨可以从载体上切去。合成完成后，寡核苷酸被定量地切下，保留一下游离3′-OH。

根据测定DMT释放的量估计，核苷的加入量一般为27～40μmol/g(对于40nmol柱为8-12μmol/g)。预装柱有40nmol(仅聚苯乙烯)，0.2μmol，1μmol或10μmol的初始核苷四种规格。40nmol或0.2μmol规模，为大多数用途提供了足够量的纯寡聚核苷酸。当需要较大量的DNA时，应用1μmol合成规模。10μmol规模对于物理学研究如x射线晶体学，核磁共振(NMR)，或反义寡核苷酸应用是有用的。大孔径(1000)CPG载体仅用在0.2μmol的规模。1000载体的核苷加样量是较低的，大约15μmol/g载体。在CPG上合成长寡核苷酸，已经表明低核苷加样量和大孔径载体是成功的关键。但由于大孔径载体的使用在合成规模上受到限制，也限制了增加了规模合成的成本。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足之处提供一种用于核酸合成载体，同时提供一种快速、低成本和高可靠性地核酸序列的合成方法。

技术方案：

本发明提出了一种用于核酸合成载体及其制作方法和应用。此发明使用的核酸合成的载体是具有顺磁性的纳米颗粒，其表面修饰了或包被了有机高分子材料，并对其表面进行化学修饰，使表面带上活性的化学基团。

这种用于核酸合成载体制备方法包括：(1)制备纳米顺磁性颗粒：利用氧化还原法制备纳米颗粒，并且纳米颗粒是强顺磁性；(2)纳米顺磁性颗粒包被：调整纳米顺磁性颗粒悬浮液的PH值之后，加入有机高分子材料的单体，使其在悬浮液中的顺磁性纳米颗粒表面聚合形成一层或多层有机高分子；(3)化学修饰：在表面聚合形成的有机高分子，通过亲核反应，修饰具有活性的基团。

使用顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的固相承载物替代了控孔玻璃珠(CPG)。这种纳米顺磁性颗粒表面可以被聚乙烯，聚苯乙烯，聚吡咯，聚吡咯烷酮等其中之一包裹或使用多种有机化合物进行包裹。如聚苯乙烯包裹后，其表面性质与多孔聚苯乙烯材料相似，有巨大的比表面积，但同时没有空间的限制，合成的核酸没有长度上的限制。

本发明的一种用于核酸合成的载体可以装在小柱中，在商业化的核酸合成仪上使用，在合成过程中，小柱的侧面加上一个电磁铁，每次小柱中有液体流过时，电磁铁工作，使顺磁性纳米颗粒聚集，不被流体冲出合成小柱。在合成中化学反应过程中，液体停止流动时，电磁铁不工作，由于顺磁性纳米颗粒是顺磁性的，纳米颗粒可以在机械振动或液体冲击下，恢复悬浮状态，利于化学反应的进行。由于合成过程中使用的顺磁性纳米颗粒纳米体积比相同表面积的控孔玻璃珠要小得多，反应腔的体积也小得多，因此，在完成相同的反应时，试剂的使用量及损失量也小得多。可以大大降低核酸的合成成本。在另一方面，由于顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的固相支持材料，利用的是其外表面，所以在合成量及合成核酸的长度等方面有更加灵活的选择。

本发明的一种用于核酸合成载体，即顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的载体可以在无氧无水手套箱中合成，在无氧无水手套箱中进行核酸合成，可以设计更加灵活的装置来完成高通量的核酸合成。如使用96孔板或384孔板作为核酸合成试剂的反应池，通过电磁铁的移动顺磁性纳米颗粒载体在不同溶液中移动，以完成不同步骤的化学合成反应。如果可以同时完成高通量的核酸序列的合成。如果使用小于电磁铁来控制与96孔板或384孔板相适应的电磁铁阵列，有选择性地控制顺磁性纳米颗粒的移动来完成多种核酸序列的合成，可以达到高通量的核酸合成能力。

顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的载体可以在无氧无水手套箱中合成，在无氧无水手套箱中进行核酸合成，使用96孔板或384孔板作为核酸合成试剂的反应池，合成反应可用于光脱保护法的核酸合成方法。每步的合成反应是将要合成的碱基在相应的溶液中反应时导入特定的光，使合成反应得以进行。

顺磁性纳米颗粒载体不仅可用于合成脱氧核糖核酸DNA序列，也可以用以核糖核酸RNA序列，肽核酸PNA序列和多肽序列的合成。

技术效果：

本发明提出的一种用于核酸合成载体及其制作方法和应用检测探针合成方法，使用的是顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的固相承载物。具有以下特点：(a)使用纳米颗粒替代控孔玻璃珠作为核酸合成的固体载体；(b)纳米颗粒是顺磁性的；(c)纳米颗粒在其表面修饰了或包被了有机高分子材料。

顺磁性纳米颗粒载体可以装在小柱中，在商业化的核酸合成仪上使用，在合成过程中有电磁铁，每次小柱中有液体流过时，电磁铁工作，使纳米颗粒聚集，不被流体冲出合成小柱。

顺磁性纳米颗粒载体可以在无氧无水手套箱中合成，通过电磁铁移动载体在不同溶液中进行化学合成反应，可以同时完成高通量的核酸序列的合成。

顺磁性纳米颗粒载体表面可以被聚乙烯，聚苯乙烯，聚吡咯，聚吡咯烷酮等其中之一包裹或使用多种有机化合物进行包裹。

本发明的核酸合成载体与传统的载体控孔玻璃珠相比，有更大的比表面积，但同时没有空间的限制，合成的核酸没有长度上的限制。

顺磁性纳米颗粒载体可用于合成DNA序列，肽核酸(PNA)序列和多肽序列。

顺磁性纳米颗粒载体可用于光脱保护法的核酸合成。

附图说明

以下将结合附图对本发明进行进一步说明：

图1：本发明提出的本发明提出使用顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的固相承载物结构示意图。

图中1所指的是顺磁性纳米颗粒。2所指的是包裹在顺磁性纳米颗粒外的有机高分子聚合物。3所指的是顺磁性纳米颗粒外表面合成的核酸分子

图2：顺磁性纳米颗粒在合成柱中反应示意图。

图中4指的是反应柱的溶液入口，5指的是顺磁性纳米颗粒，6指的是反应柱，7指的是电磁铁(非工作状态)，8指的是反应柱的溶液出口。

图3：顺磁性纳米颗粒在合成柱中液体流动时效果示意图

图中4指的是反应柱的溶液入口，顺磁性纳米颗粒，6指的是反应柱，7指的是电磁铁(工作状态)，8指的是反应柱的溶液出口，9指的是顺磁性纳米颗粒在磁场的作用下聚集。

具体实施方式

参照附图对本发明一种用于核酸合成载体及其制作方法和应用进行说明。

一种用于核酸合成载体，是具有顺磁性的纳米颗粒1，其表面修饰了或包被了有机高分子材料2，并对其表面进行化学修饰，使表面带上活性的化学基团。其应用方法步骤如下：

1.固体支持物的准备：合成纳米顺磁性颗粒。

2.固相支持物的活化：用有双功能活性试剂通过化学反应在载体的表面键合上活性基团，以便与相应的配基共价结合，形成具有能与核酸合成的单体相结合的基团。

3.合成仪固相合成：采用商业化固相化学合成仪合成。用合成的顺磁性纳米颗粒正规化控孔玻璃珠作为核酸固相合成的承载物。

4.无氧无水手套箱中的固相合成：顺磁性纳米颗粒作为核酸合成的载体可以在无氧无水手套箱中合成，在无氧无水手套箱中进行核酸合成，可以设计更加灵活的装置来完成高通量的核酸合成。如使用96孔板或384孔板作为核酸合成试剂的反应池，通过电磁铁的移动顺磁性纳米颗粒载体在不同溶液中移动，以完成不同步骤的化学合成反应。如果可以同时完成高通量的核酸序列的合成。如果使用小于电磁铁来控制与96孔板或384孔板相适应的电磁铁阵列，有选择性地控制顺磁性纳米颗粒的移动来完成多种核酸序列的合成。

5.合成后处理：用氨水将合成的核酸从顺磁性纳米颗粒上分离下来，

实施例一：纳米顺磁性颗粒商业化的DNA合成仪的使用

1.制备纳米顺磁性颗粒：利用还原法制备，将氯化铁在煮沸状态和强力搅拌下加入NaOH，通过调变溶液的PH值、反应温度和应应时间来控制磁性微粒的粒径，制备出10nm左右的Fe₃O₄颗粒，是强顺磁性纳米颗粒。

2.纳米顺磁性颗粒包被：调整溶液的PH值到7左右后，苯乙烯单体SM、表面活性剂SDS、油酸、过氧化苯甲酰(BPO)，使苯乙烯通过聚合反应，在纳米顺磁性颗粒的表面聚合形成一层聚苯乙烯。

3.化学修饰：在表面聚合形成一层聚苯乙烯的纳米顺磁性颗粒溶液中通过清洗后，加入溴化氰溶液反应后，将溶液置换成无水甲酰胺，加入羰基二咪唑反应后，产生咪唑基团，再用双胺基的乙二胺，最后在表面形成了氨基。回收纯化后贮于无水乙腈中备用。

4.DNA合成：将上述纳米顺磁性颗粒装入小柱中，接入商业化的DNA合成仪中进行DNA合成，使用成套的DNA合成试剂，但注意，在合成的每一步反应的液体流动时必须启动电磁铁(如图3所示)，将纳米顺磁性颗粒聚集成团，以免载体丢失过多。

5.纯化步骤：与商业化的DNA合成仪使用CPG(控孔玻璃珠)合成后的处理方式一致。实施例二：纳米顺磁性颗粒商业化的DNA合成仪的使用

1.制备纳米顺磁性颗粒：利用还原法制备，将氯化铁在煮沸状态和强力搅拌下加入NH₃，通过调变溶液的PH值、反应温度和应应时间来控制磁性微粒的粒径，制备出10nm左右的Fe₃O₄颗粒，是强顺磁性纳米颗粒。

4.DNA合成：将上述纳米顺磁性颗粒装入96孔板中(孔内有无水乙腈)，用电磁铁将纳米顺磁性颗粒在不同的溶液中移动，以依设计的序列完成DNA合成的各步反应。

5.纯化步骤：与商业化的DNA合成仪使用CPG(控孔玻璃珠)合成后的处理方式一致。

Claims

1.一种用于核酸合成载体，其特征在于：载体是具有顺磁性的纳米颗粒，其表面修饰了或包被了有机高分子材料，并对其表面进行化学修饰，使表面带上活性的化学基团。

2.一种用于核酸合成载体制备方法，其特征在于：

(1)制备纳米顺磁性颗粒：利用氧化还原法制备纳米颗粒，并且纳米颗粒是强顺磁性；

(2)纳米顺磁性颗粒包被：调整纳米顺磁性颗粒悬浮液的PH值之后，加入有机高分子材料的单体，使其在悬浮液中的顺磁性纳米颗粒表面聚合形成一层或多层有机高分子；

(3)化学修饰：在表面聚合形成的有机高分子，通过亲核反应，修饰具有活性的基团。

3.根据权利要求2所述的一种用于核酸合成载体制作方法，其特征在于：顺磁性纳米颗粒表面可以被聚乙烯，聚苯乙烯，聚吡咯，聚吡咯烷酮等其中之一包裹或同时使用多种有机化合物进行包裹。

4.根据权利要求1所述的一种用于核酸合成载体在核酸合成中的应用，其特征在于：此种载体可以装在合成小柱中，在商业化的核酸合成仪上使用，在合成过程中有电磁铁，每次小柱中有液体流过时，电磁铁工作，使纳米颗粒聚集成团，不被流体冲出合成小柱。

5.根据权利要求1所述的一种用于核酸合成载体在核酸合成中的应用，其特征在于：载体可以在无氧无水手套箱中合成，通过电磁铁移动载体在不同溶液中进行化学合成反应，可以同时完成高通量的核酸序列的合成。

6.根据权利要求1所述的一种用于核酸合成载体应用，其特征在于：载体可用于光脱保护法的核酸合成。

7.根据权利要求1所述的一种用于核酸合成载体应用，其特征在于：载体可用于合成脱氧核糖核酸DNA序列，核糖核酸RNA序列，肽PNA序列和多肽序列。

8.根据权利要求1所述的一种用于核酸合成载体的应用，其特征在于：载体用于合成脱氧核糖核酸DNA序列，核糖核酸RNA序列，肽PNA序列和多肽序列后，合成产物可以不从载体上分离下来，直接使用磁性颗粒作为合成产物的标记物。