CN116121450A - 一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒 - Google Patents

一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116121450A
CN116121450A CN202211373580.XA CN202211373580A CN116121450A CN 116121450 A CN116121450 A CN 116121450A CN 202211373580 A CN202211373580 A CN 202211373580A CN 116121450 A CN116121450 A CN 116121450A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
groups
gene
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211373580.XA
Other languages
English (en)
Inventor
白金义
董璐
张良林
邹涛
陈威
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd filed Critical Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202211373580.XA priority Critical patent/CN116121450A/zh
Publication of CN116121450A publication Critical patent/CN116121450A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒，包括第一组合和/或第二组合，其中：所述第一组合包括N679K引物对和N679K探针，所述第二组合包括Q954H引物对和Q954H探针的序列如SEQ ID NO.4～5所示，所述Q954H探针的序列如SEQ ID NO.6所示。本发明中，选取Omicron突变株S基因中的特异且保守的N679K、Q954H突变进行检测，有效的针对新冠病毒进行了病毒分型，检测的特异性佳、灵敏度高，有效减少漏检可能。

Description

一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒
技术领域
本发明属于体外检测技术，具体涉及一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2病毒在传播过程中不断产生突变，相继出现Alpha、Beta、 Gamma、Delta等世卫组织关注突变株，而新冠Omicron突变株具有复杂的突变和更快的传播速度，对新冠病毒进行快速分型鉴定对于病毒监测具有重要意义。
新冠病毒检测的主要手段包括核酸检测和抗原检测，其中以荧光定量PCR 技术(qPCR)为基础的病毒核酸检测具有高特异性、高灵敏度的特点，并且支持4-6通道同时检测，是当前新冠检测的主力。目前有许多针对新冠病毒的试剂盒，但是传统的新冠核酸检测试剂不具备新冠分型检测能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒，旨在提供一种可以检测新冠病毒Omicron突变株的检测试剂。
为达到上述目的，本发明提供一种检测新冠S基因的引物和探针组合，包括第一组合和/或第二组合，其中：
所述第一组合包括N679K上游引物、N679K下游引物和N679K探针，所述 N679K上游引物含有如SEQ ID NO.1的序列或含有与如SEQ ID NO.1互补的序列，所述N679K下游引物含有如SEQ ID NO.2的序列或含有与如SEQ ID NO.2 互补的序列，所述N679K探针含有如SEQ ID NO.3所示序列或含有与SEQ ID NO.3互补的序列；
所述第二组合包括Q954H上游引物、Q954H下游引物和Q954H探针，所述 Q954H上游引物含有如SEQ ID NO.4的序列或含有与如SEQ ID NO.4互补的序列，所述Q954H下游引物含有如SEQ ID NO.5的序列或含有与如SEQ ID NO.5 互补的序列，所述Q954H探针含有如SEQ ID NO.6的序列或含有与如SEQ ID NO.6互补的序列。
可选地，还包括第三组合和/或第四组合，其中：
所述第三组合包括N基因上游引物、N基因下游引物和N基因探针，所述N 基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如SEQ ID NO.7互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列；
所述第四组合包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标上游引物含有如SEQ ID NO.10所述的序列或与含有如SEQ ID NO.10互补的序列，所述内标下游引物含有如SEQ ID NO.11所述的序列或与含有如SEQ ID NO.11互补的序列，所述内标探针含有如SEQ ID NO.12所述的序列或与含有如SEQ ID NO.12互补的序列。
此外，本发明还提供一种检测新冠病毒核酸的引物和探针组合，所述检测新冠病毒核酸的引物和探针组合包括N基因上游引物、N基因下游引物和N 基因探针，所述N基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如 SEQ ID NO.7互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列。
此外，本发明还提供一种用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括上述检测新冠S基因的引物和探针组合。
可选地，在所述PCR反应液中：
所述N679K上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N679K下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N679K探针的浓度为0.05～0.5μM；和/或，
所述Q954H上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述Q954H下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述Q954H探针的浓度为0.05～0.5μM。
可选地，所述PCR反应液中还含有dNTPs、pH为8.0～9.0的Tris-HCl、KCl 和1～5mM的MgCl2、甜菜碱中的至少一种；和/或，
所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括所述PCR酶液，所述PCR酶液包括0.5～5U的Taq酶、0.5～5U的Taq酶封闭剂、0.5～5U的逆转录酶、 1～10U的尿嘧啶-N-糖基化酶和1～10U的RNA酶抑制剂；和/或，
所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括阳性对照品；和 /或，
所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括阴性对照品。
可选地，在所述PCR反应液中，所述dNTPs含量为0.1～1mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述Tris-HCl含量为10-50mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述KCl的含量为20～80mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述MgCl2的含量为1～5mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述甜菜碱的含量为1mM～50mM；和/或，
所述dNTPs包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP；和/或，
所述阳性对照品为使用数字PCR定量的2E5拷贝/毫升的Omicron假病毒；和/或，
所述阴性对照品为纯水。
此外，本发明还提供一种用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括第一组合、第二组合中的至少一种；以及，第三组合、第四组合中的至少一种。
可选地，在所述PCR反应液中：
所述N基因引物对的上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N基因引物对的下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N基因探针的浓度为0.05～0.5μM；和/或，
所述内标引物对的上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述内标引物对的下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述内标探针的浓度为0.05～0.5μM。
此外，本发明提供一种检测新冠病毒Omicron突变株的方法，所述检测新冠病毒Omicron突变株的方法包括：
采用上述检测新冠S基因的引物和探针组合或上述用于新冠病毒Omicron 突变株核酸检测试剂盒进行实时定量PCR扩增，根据扩增的结果对判断是否存在Omicron突变株。
本发明中，通过选取Omicron突变株S基因中特异且保守的N679K、Q954H 进行检测，有效的针对新冠病毒进行了病毒分型，检测的特异性佳、灵敏度高，有效减少漏检可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为对比例1引物筛选测试结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
鉴于现有检测新冠病毒的试剂盒不具备对于Omicron突变株的分型检测能力，本申请利用扩增阻滞突变系统(ARMS)，结合qPCR技术可以实现对新冠病毒核酸的特征突变进行快速检测，实现新冠病毒的快速分型。
由于新冠病毒Omicron突变株的突变数量明显多于其它亚型，而特征突变位点的选择对于分型检测的准确性和检出率有重要影响。本发明研发团队在尝试现有的分型位点的检测后，发现现有位点依旧会出现特异性不佳且保守性差的技术缺陷，而后本发明研究团队发现对S基因的N679K和Q954H两个点突变，可提高病毒监测的效率和准确度。
突变位点的选择性检出通过ARMS引物实现，ARMS引物可以是前引物，也可以是后引物，ARMS引物的3’端为点突变发生的位置。当3’端碱基匹配时， qPCR正常进行；当3’端碱基错配时，PCR荧光曲线Ct值会出现落后。在ARMS 引物3’端的倒数第2～4位引入一个额外突变可以使3’端碱基错配的荧光曲线Ct 值的进一步落后(6个Ct值以上)，同时对3’端碱基匹配的荧光曲线Ct值无明显影响。该额外突变通过筛选确定，既保持对目标突变的正常检测，又提高突变判读的准确性。
具体地，本申请针对上述两个位点开发了一种检测新冠S基因的引物和探针组合，包括第一组合和/或第二组合，其中：
所述第一组合包括N679K上游引物、N679K下游引物和N679K探针，所述N679K上游引物含有如SEQ ID NO.1的序列或含有与如SEQ ID NO.1互补的序列，所述N679K下游引物含有如SEQ ID NO.2的序列或含有与如SEQ ID NO.2互补的序列，所述N679K探针含有如SEQID NO.3所示序列或含有与SEQ ID NO.3互补的序列；
所述第二组合包括Q954H上游引物、Q954H下游引物和Q954H探针，所述Q954H上游引物含有如SEQ ID NO.4的序列或含有与如SEQ ID NO.4互补的序列，所述Q954H下游引物含有如SEQ ID NO.5的序列或含有与如SEQ ID NO.5互补的序列，所述Q954H探针含有如SEQID NO.6的序列或含有与如SEQ ID NO.6互补的序列。
本发明中，通过选取Omicron突变株S基因中特异且保守的N679K、 Q954H进行检测，有效的针对新冠病毒进行了病毒分型，检测的特异性佳、灵敏度高，有效减少漏检可能。
进一步地，所述检测新冠S基因的引物和探针组合同时具备第一组合和第二组合，在检测时，通过N679K突变和Q954H突变同时判断，就可以进一步的提高分型准确性。
在一些实施例中，所述检测新冠S基因的引物和探针组合还包括第三组合，其中：
所述第三组合包括N基因上游引物、N基因下游引物和N基因探针，所述N基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如SEQ ID NO.7 互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列。
在临床检测中，其样品浓度的起伏较大，而样品浓度直接影响到了S基因N679K和Q954H突变区域的扩增产物量，如果样品浓度偏低，N679K和 Q954H突变区域的扩增Ct值也会随之落后，因此无法区分低丰度的Omicron 突变株和高丰度的非Omicron新冠病毒。基于此，在组合中引入第三组合作为新冠病毒通用检测，对N基因保守区域进行检测，作为新冠样品浓度的内参。当然，可以理解的是，N基因的检测还可用于判断是否存在新冠病毒(含Omicron突变株以及其他分型)。
在一些实施例中，还包括第四组合，所述第四组合包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标上游引物含有如SEQ ID NO.10所述的序列或与含有如SEQ IDNO.10互补的序列，所述内标下游引物含有如SEQ ID NO.11所述的序列或与含有如SEQ IDNO.11互补的序列，所述内标探针含有如SEQ ID NO.12所述的序列或与含有如SEQ IDNO.12互补的序列。
采用第四组合用于对人源内标基因GAPDH进行检测，避免检测中出现采样失败导致的假阴性结果。
在一些实施例中，所述N679K探针的5’端标记有第一荧光报告基团，所述N679K探针的3’端标记有第一荧光淬灭基团。
通过在N679K探针修饰荧光基团和荧光淬灭基团后，可以根据荧光信号判断N679K扩增情况。
在一些实施例中，所述Q954H探针的5’端标记有第二荧光报告基团，所述Q954H探针的3’端标记有第二荧光淬灭基团。
通过在Q954H探针修饰荧光基团和荧光淬灭基团后，可以根据荧光信号判断Q954H扩增情况。
在一些实施例中，所述N基因探针的5’端标记有第三荧光报告基团，所述N基因探针的3’端标记有第三荧光淬灭基团。通过在N基因探针修饰荧光基团和荧光淬灭基团后，可以根据荧光信号判断N基因扩增情况。
在一些实施例中，所述内标探针的5’端标记有第四荧光报告基团，所述 N基因探针的3’端标记有第四荧光淬灭基团。通过内标探针修饰荧光基团和荧光淬灭基团后，可以根据荧光信号判断GAPDH基因扩增情况。
需要说明的是，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团和所述第四荧光报告基团其选择不受限制，在一些实施例中，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团和所述第四荧光报告基团各独自的选择FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、 TAMRA、HEX、CY3中的任意一种。
应当理解的是，在本发明中，若在反应体系中，包括第一组合、第二组合、第三组合和第四组合中的两种及以上，则同在一个反应体系中各组合的探针连接的荧光报告基团不一样，以此作为信号区分。
需要说明的是，在所述第一荧光淬灭基团可将所述第一荧光报告基团的荧光信号淬灭、所述第二荧光淬灭基团可将所述第二荧光报告基团的荧光信号淬灭、所述第三荧光淬灭基团可将第三荧光报告基团的荧光信号淬灭，所述第四荧光淬灭基团可将所述第四荧光报告基团的荧光信号淬灭的前提下，所述第一荧光淬灭基团、所述第二荧光淬灭基团、所述第三荧光淬灭基团和所述第四荧光淬灭基团的选择不限。在一些实施例中，所述第一荧光淬灭基团、所述第二荧光淬灭基团、所述第三荧光淬灭基团和所述第四荧光淬灭基团可独自选择BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPSE、DABCYL中的任意一种。
此外，本发明还提供一种检测新冠病毒的引物和探针组合，所述检测新冠病毒核酸的引物和探针组合包括N基因上游引物、N基因下游引物和N基因探针，所述N基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如SEQ ID NO.7互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列。上述引物组合能有效检测新冠病毒的存在(含Omicron突变株以及其他分型)。
此外，本发明还提供一种用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括第一组合和/或第二组合，其中：
所述第一组合包括N679K上游引物、N679K下游引物和N679K探针，所述N679K上游引物含有如SEQ ID NO.1的序列或含有与如SEQ ID NO.1互补的序列，所述N679K下游引物含有如SEQ ID NO.2的序列或含有与如SEQ ID NO.2互补的序列，所述N679K探针含有如SEQID NO.3所示序列或含有与SEQ ID NO.3互补的序列；
所述第二组合包括Q954H上游引物、Q954H下游引物和Q954H探针，所述Q954H上游引物含有如SEQ ID NO.4的序列或含有与如SEQ ID NO.4互补的序列，所述Q954H下游引物含有如SEQ ID NO.5的序列或含有与如SEQ ID NO.5互补的序列，所述Q954H探针含有如SEQID NO.6的序列或含有与如SEQ ID NO.6互补的序列。
通过提供检测新冠S基因的引物和探针组合，可对新冠病毒Omicron突变株进行检测。
需要说明的是，在本发明中，各试剂盒的引物浓度根据具体PCR反应情况进行调节。在一些实施例中，在所述PCR反应液中：所述N679K引物对的上游引物的浓度为0.1～1μM；所述N679K引物对的下游引物的浓度为0.1～1 μM；所述N679K探针的浓度为0.05～0.5μM；所述Q954H引物对的上游引物的浓度为0.1～1μM；所述Q954H引物对的下游引物的浓度为0.1～1μM；所述 Q954H探针的浓度为0.05-0.5μM时，有利于提高扩增反应的效率，有助于后续测试信号的增强。
在一些实施例中，所述PCR反应液还包括第三组合，所述第三组合包括 N基因上游引物、N基因下游引物和N基因探针，所述N基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如SEQ ID NO.7互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列。
需要说明的是，在本发明中，所述N基因上游引物、所述N基因下游引、所述N基因探针的浓度根据具体PCR反应情况进行调节。在一些实施例中，所述PCR反应液中，所述N基因的上游引物的浓度为0.1～1μM；所述N基因的下游引物的浓度为0.1～1μM；所述N基因探针的浓度为0.05-0.5μM。
在一些实施例中，所述PCR反应液还包括第四组合，所述第四组合包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标上游引物含有如SEQ ID NO.10所述的序列或与含有如SEQ ID NO.10互补的序列，所述内标下游引物含有如SEQ ID NO.11所述的序列或与含有如SEQ ID NO.11互补的序列，所述内标探针含有如SEQ ID NO.12所述的序列或与含有如SEQ ID NO.12互补的序列。
需要说明的是，在本发明中，内标上游引物、内标下游引物和内标探针的含量根据具体PCR反应情况进行调节。在一些实施例中，所述PCR反应液中，所述内标引物对的上游引物的浓度为0.1-1μM；所述内标引物对的下游引物的浓度为0.1-1μM；所述内标探针的浓度为0.05-0.5μM。
需要说明的是引物和探针组合可以根据检测需要进行组合，例如第一组合和第三组合，第二组合和第三组合，第一组合、第三组合和第四组合，第二组合、第三组合和第四组合，第三组合和第四组合，第一组合、第二组合和第三组合，第一组合、第二组合、第三组合和第四组合。
其中，第一组合和第二组合均可检测新冠病毒Omicron突变株特异且保守的点突变，当试剂盒同时含有时，可以进一步提高分型特异性。而第三组合可以监控样品浓度，第四组合可为内标，用于避免在操作中带来误差，因此，可以提高测试的准确率。
在一些实施例中，所述PCR反应液中还含有dNTPs、pH为8.0～9.0的Tris-HCl、KCl和1～5mM的MgCl2、甜菜碱中的至少一种：以此为PCR反应提供反应环境。
要需要说明的是，在本发明中，上述物质的含量可根据实际情况调整，在一些实施例中，所述PCR反应液中，所述Tris-HCl的含量为10-50mM、所述KCl的含量为20～80mM，所述MgCl2的含量为1～5mM，所述甜菜碱的含量为1-50mM；选择上述的组分，可以进一步的提高扩增反应的效率。
在一些实施例中，所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括所述PCR酶液，所述PCR酶液包括0.5～5U的Taq酶、0.5～5U的Taq酶封闭剂、0.5～5U的逆转录酶、1～10U的尿嘧啶-N-糖基化酶和1～10U的RNA 酶抑制剂；PCR酶液可以使在PCR反应液提供的环境中的引物以样品为模板进行扩增，而选择上述的组分，可以进一步的提高扩增反应的效率。
在一些实施例中，所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品。
通过对照品体系，可以有效地控制假阳与假阴，避免操作误差造成的影响。
在此前提下，所述阳性对照品与所述阴性对照品的种类不限，所述阳性对照品使用数字PCR定量的2E5拷贝/毫升的Omicron假病毒；所述阴性对照品为纯水。
此外，本发明一种检测新冠病毒Omicron突变株的方法，其特征在于，所述检测新冠病毒Omicron突变株的方法包括：
采用上述引物探针组合或上述试剂盒对待检测样品进行实时定量PCR扩增，根据扩增的结果判断是否存在Omicron突变株。
具体地，所述实时定量PCR扩增包括以下步骤：
1)提取待测样本的核酸，获得所述待检测样品；
2)将所述待检测样品与所述试剂盒中的试剂配制成PCR体系，进行实时荧光定量PCR扩增，所述PCR的程序为：50℃5min，循环数1；95℃2min，循环数1；95℃5s，60℃30s，循环数45。
其中，在所述PCR体系中，所述PCR反应液、所述PCR酶液和所述待检测样品的体积比为8:2:10。在上述PCR条件下，其PCR效率最佳。
所述根据扩增的结果对判断是否存在Omicron突变株可根据试剂盒的引物组合匹配结果解读。
例1，所述试剂盒包括第一组合和第三组合时，其判别方法为：
若N679K突变阳性，N基因通道阳性，则为Omicron阳性；若N679K 突变阴性，N基因通道阳性，则为新冠病毒阳性，但非Omicron；若N679K 突变阴性，N基因通道阴性，则为新冠病毒阴性。
进一步，所述N基因荧光通道Ct≤38，则所述N基因通道为阳性，所述N基因荧光通道Ct>38或NoCt，则所述N基因通道为阴性。所述N679K 突变阳性的判定方法：所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值小于等于6，则N679K为突变阳性，所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值大于6，或者N679K通道Ct>38或NoCt，则N679K为突变阴性。
例2，所述试剂盒包括第一组合、第三组合和第四组合时，其判别方法为：
1)根据GAPDH荧光通道的检测结果，GAPDH荧光通道呈阴性为无效检测结果，GAPDH荧光通道阳性为有效检测结果；
2)若N679K突变阳性，N基因通道阳性，则为Omicron阳性；若N679K 突变阴性，N基因通道阳性，则为新冠病毒阳性，但非Omicron；若N679K 突变阴性，N基因通道阴性，则没有感染新冠病毒。
进一步，所述GAPDH荧光通道Ct>38或NoCt，则所述GAPDH荧光通道为阴性，所述GAPDH荧光通道Ct≤38，则所述GAPDH荧光通道为阳性；所述N基因荧光通道Ct≤38，则所述N基因通道为阳性，所述N基因荧光通道Ct>38或NoCt，则所述N基因通道为阴性。所述N679K突变阳性的判定方法：所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值小于等于 6，则N679K为突变阳性，所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值大于6，或者N679K通道本身Ct>38或NoCt，则N679K为突变阴性。
需要说明的是，将上述第一组合替换成第二组合，其判定方法与上述一致，具体不一一阐述。
例3，所述试剂盒包括第一组合、第二组合和第三组合时，其判别方法为：
若所述N679K突变阳性、Q954H突变阳性并且N基因通道呈阳时，则为 Omicron阳性；
若所述N679K突变阴性、Q954H突变阴性并且N基因通道呈阳时，则为 Omicron阴性，但新冠阳性；
若所述N679K突变阴性、Q954H突变阴性并且N基因通道呈阴性时，则为新冠阴性；
若N679K通道和Q954H通道中，其中一个为阴，另一个为阳，N基因通道呈阳时，则须进行复测。
进一步，所述N基因荧光通道Ct≤38，则所述N基因通道为阳性，所述N基因荧光通道Ct>38或NoCt，则所述N基因通道为阴性。所述N679K 突变阳性的判定方法：所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值小于等于6，则N679K为突变阳性，所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值大于6，或者N679K通道本身Ct>38或NoCt，则N679K为突变阴性。所述Q954H突变阳性的判定方法：所述Q954H通道Ct值与所述 N基因通道Ct值的差值小于等于6，则Q954H为突变阳性，所述Q954H通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值大于6，或者Q954H通道本身Ct>38 或NoCt，则Q954H为突变阴性。
例4，所述试剂盒包括第一组合、第二组合、第三组合和第四组合时，其判别方法为：
1)根据GAPDH荧光通道的检测结果，GAPDH荧光通道呈阴性为无效检测结果，GAPDH荧光通道阳性为有效检测结果；
2)若所述N679K突变阳性、Q954H突变阳性并且N基因通道呈阳时，则为Omicron阳性；
若所述N679K突变阴性、Q954H突变阴性并且N基因通道呈阳时，则为 Omicron阴性，但新冠阳性；
若所述N679K突变阴性、Q954H突变阴性并且N基因通道呈阴性时，则为新冠阴性；
若N679K通道和Q954H通道中，其中一个为阴，另一个为阳，N基因通道呈阳时，则须进行复测。
进一步，所述N基因荧光通道Ct≤38，则所述N基因通道为阳性，所述N基因荧光通道Ct>38或NoCt，则所述N基因通道为阴性。所述N679K 突变阳性的判定方法：所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值小于等于6，则N679K为突变阳性，所述N679K通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值大于6，或者N679K通道本身Ct>38或NoCt，则N679K为突变阴性。所述Q954H突变阳性的判定方法：所述Q954H通道Ct值与所述 N基因通道Ct值的差值小于等于6，则Q954H为突变阳性，所述Q954H通道Ct值与所述N基因通道Ct值的差值大于6，或者Q954H通道本身Ct>38 或NoCt，则Q954H为突变阴性。
例5，所述试剂盒包括第三组合和第四组合时，其判别方法为：
1)根据GAPDH荧光通道的检测结果，GAPDH荧光通道呈阴性为无效检测结果，GAPDH荧光通道阳性为有效检测结果；
2)根据N基因荧光通道的检测结果，N基因通道呈阴性则为新冠病毒阴性，N基因通道呈阳性则为新冠病毒阳性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物探针组合物
本实施例针对S基因的N679K突变位点、Q954H突变位点进行了引物和探针设计，并同时N基因引物和探针，内参引物和探针，并以此作为Omicron 突变株的判读方法，分别为第一组合、第二组合、第三组合和第四组合，其中，第一组合包括N679K引物对和N679K探针，N679K引物对的序列如 SEQ ID NO.1～2所示，N679K探针的序列如SEQ ID NO.3所示；第二组合包括Q954H引物对和Q954H探针，Q954H引物对的序列如SEQ ID NO.4～5 所示，Q954H探针的序列如SEQ ID NO.6所示；第三组合包括N基因引物对和N基因探针，N基因引物对的序列如SEQ ID NO.7～8所示，N基因探针的序列SEQ ID NO.9所示；第四组合包括内标引物对和内标探针，内标引物对的序列如SEQ ID NO.10～11所示，内标探针的序列如SEQ IDNO.12所示。本实施例中，引物探针的序列信息和探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团信息如表1所示。
将四组引物和探针组合根据检测需要选择组合方式，可选的组合方式包括：第一组合和第三组合，第二组合和第三组合，第一组合、第三组合和第四组合，第二组合、第三组合和第四组合，第一组合、第二组合和第三组合，第一组合、第二组合、第三组合和第四组合。
表1实施例1引物探针序列信息表
实施例2.新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒及检测方法
1)本实施例的检测试剂盒组分包含：PCR反应液、PCR酶液、阳性对照品和阴性对照品。
其中，PCR反应液含有20mM Tris-HCl(pH 8.5)、45mM KCl和3mM MgCl2、0.3mMdATP、0.3mM dGTP、0.3mM dCTP、0.6mM dUTPs、20mM 甜菜碱。此外，PCR反应液中还包含引物探针组合物：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8所示的引物均为0.4μM；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12所示的引物均为0.2μM。
PCR酶液含有2.5U Taq DNA聚合酶(5kU/mL，重庆艾生斯生物工程有限公司)、2.5Uanti-Taq high(5kU/mL，重庆艾生斯生物工程有限公司)、 3U SSIII逆转录酶(200U/μL，重庆艾生斯生物工程有限公司)、2UUNG酶 (2U/μL，重庆艾生斯生物工程有限公司)和6U RNA酶抑制剂(40U/μL，重庆艾生斯生物工程有限公司)。
阳性对照品为2E5拷贝/毫升的Omicron假病毒，使用数字PCR进行定量，数字PCR定量由北京新羿生物科技有限公司完成。
阴性对照品为纯水。
2)本实施例还提供新冠病毒核酸样本和PCR反应体系准备方法
核酸样本准备：使用核酸提取试剂(货号RT-B-200，批号5205013)进行病毒核酸提取，或者使用样本释放剂(货号SRR-1，批号5209001)进行核酸释放。
推荐的试剂加样比例为实施例1所述PCR反应液:PCR酶液:核酸样本＝4:1:5，PCR单孔反应体系总体积为20-100μL。
3)进行实时荧光定量PCR扩增
PCR程序为：50℃5min，循环数1；95℃2min，循环数1；95℃5s， 60℃30s，循环数45。
4)PCR结果判读：
根据GAPDH荧光通道的检测结果，GAPDH荧光通道呈阴性为无效检测结果，GAPDH荧光通道阳性为有效检测结果；
若N679K突变阳性、Q954H突变阳性并且N基因通道呈阳时，则为Omicron阳性；
若N679K突变阴性、Q954H突变阴性并且N基因通道呈阳时，则为 Omicron阴性，但新冠阳性；
若N679K突变阴性、Q954H突变阴性并且N基因通道呈阴性时，则为新冠阴性；
若N679K突变和Q954H突变中，其中一个为阴，另一个为阳时，则须进行复测。
进一步，GAPDH荧光通道Ct>38或NoCt，则GAPDH荧光通道为阴， GAPDH荧光通道Ct≤38，则所述GAPDH荧光通道为阳性；所述N基因荧光通道Ct≤38，则N基因通道为阳性，N基因荧光通道Ct>38或NoCt，则N基因通道为阴性。N679K突变阳性的判定方法：N679K通道Ct值与N 基因荧光通道的差值小于等于6，则N679K为突变阳性，N679K通道Ct值与 N基因荧光通道的差值大于6，则N679K为突变阴性。Q954H突变阳性的判定方法：Q954H通道Ct值与所述N基因荧光通道的差值小于等于6，则Q954H 为突变阳性，Q954H通道Ct值与N基因荧光通道的差值大于6，则Q954H 为突变阴性。
实施例3.本发明试剂盒对突变位点的选择性检出
本实施例以合成的Omicron假病毒和新冠国际标准品(NIBSC code 20/146)进行不同突变模式的选择性检出实验。其中，Omicron假病毒S基因的突变模式为679K和954H，新冠国际标准品S基因的突变模式为679N和 954Q。将Omicron假病毒和新冠国际标准品分别用涮有口咽拭子的病毒保存液(货号Inactivated-1，批号5202018)梯度稀释至E6、E5和E4拷贝/mL，以此模拟临床口咽拭子样本。使用核酸提取试剂(货号RT-B-200，批号5205013)进行病毒核酸提取，使用三个批次的检测试剂进行测试，结果如表2～3所示。
表2.三批次检测试剂确定N679K检测选择性
表3.三批次检测试剂确定Q954H检测选择性
结论：对于E6、E5和E4拷贝/mL Omicron假病毒和新冠国际标准品的口咽拭子模拟样本，三批次检测试剂均能满足对Omicron突变株的679K和 954H检测ΔCt<6，对新冠国际标准品的679N和954Q检测ΔCt≥6。
实施例4.本发明试剂盒的检测灵敏度测试
将Omicron假病毒用涮有口咽拭子的病毒保存液(货号Inactivated-1，批号5202018)梯度稀释至400、300和200拷贝/mL，以此模拟临床口咽拭子样本。使用核酸提取试剂(货号RT-B-200，批号5205013)进行病毒核酸提取，每个浓度梯度重复测试20次，使用三个批次的检测试剂进行测试，以检出率≥95％作为本试剂盒的检测灵敏度，结果如表4～6所示。
表4.三批次检测试剂确定灵敏度结果表-ROX_679K
表5.三批次检测试剂确定灵敏度结果表-FAM_954H
表6三批次检测试剂确定灵敏度结果表-CY5_N基因
结论：对于Omicron假病毒的口咽拭子模拟样本，三批次检测试剂均能实现95％阳性检出率的核酸样本浓度分别是：679K为300拷贝/mL，954H为 400拷贝/mL，N基因为200拷贝/mL。
实施例5.本发明试剂盒的特异性验证
合成其它呼吸道冠状病毒的假病毒，包括：NL63、HKU1、229E、OC43、 SARS-CoV、MERS-CoV；
临床口咽拭子样本，包括：流感A病毒、流感B病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体；
呼吸道细菌病原体：肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎军团菌、百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌。
使用数字PCR方法确定核酸样本的实际浓度，其中，假病毒样本和临床口咽拭子样本用病毒保存液(货号Inactivated-1，批号5202018)稀释到1E6 拷贝/mL，然后使用核酸提取试剂(货号RT-B-200，批号5205013)进行核酸提取；呼吸道细菌病原体用生理盐水稀释到1E6拷贝/mL，然后使用核酸提取试剂(货号BF-B，批号5206001)进行核酸提取。使用三个批次的检测试剂进行交叉反应测试。
结果显示第一组合(ROX通道)、第二组合(FAM通道)和第三组合(CY5 通道)均为阴性。
结论：本发明试剂盒对于常见呼吸道病原体无交叉反应。
实施例6.本发明试剂盒的抗干扰性
为考察可能存在的内源/外源性物质对检测性能的影响，用病毒保存液(货号Inactivated-1，批号5202018)稀释至受试浓度，混入400拷贝/mL的Omicron 假病毒，然后使用核酸提取试剂(货号RT-B-200，批号5205013)进行核酸提取，使用三个批次的检测试剂进行抗干扰性测试，每个样本重复检测2次。
结果如表7～8所示
表7.三批次检测试剂确定抗干扰性结果表-ROX_679K
表8三批次检测试剂确定抗干扰性结果表-FAM_954H
结论：由上述结果可以看出，三批次检测试剂在内源/外源性添加物存在的情况下均能正常检出679K和954H突变，对检测结果无明显干扰。
对比例1.本发明试剂盒ARMS引物的优化
本发明利用ARMS-qPCR方法实现对Omicron突变株S基因上N679K和 Q954H突变的选择性检测。为了使ARMS引物实现更好的选择性，本发明在 ARMS引物3’端的倒数第2～4位引入一个额外突变可以使3’端碱基错配的荧光曲线Ct值的进一步落后(6个Ct值以上)，同时对3’端碱基匹配的荧光曲线Ct值无明显影响，使结果判读更加准确和简便。检测679K的ARMS引物为SEQ ID NO.1，对比引物为679K-2A，3’端的倒数第2～4位完全匹配；同样地，检测954H的ARMS引物为SEQ ID NO.4，对比引物为954H-2A，3’端的倒数第2～4位完全匹配。序列信息如下：
679K-2A：5’-TGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAAG-3’
SEQ ID NO.1：5’-TGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTACG-3’
954H-2A：5’-GGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAT-3’
SEQ ID NO.4：5’-GGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCGT-3’
配制4种反应液：1)加入第一组合的引物探针，但用679K-2A替换SEQ ID NO.1，2)加入第一组合的引物探针，3)加入第二组合的引物探针，但用 954H-2A替换SEQ ID NO.4，d.加入第二组合的引物探针。
将Omicron假病毒和新冠国际标准品分别用病毒保存液(货号 Inactivated-1，批号5202018)稀释至E6拷贝/mL，使用核酸提取试剂(货号RT-B-200，批号5205013)进行病毒核酸提取。核酸提取产物分别使用上述4 种反应液进行qPCR测试，结果如图1-A/B和表9所示。
表9.ARMS引物引入额外突变增强选择性的结果表
反应液类型 679K-2A SEQ ID NO.1 954H-2A SEQ ID NO.4
Omicron假病毒 25.49 25.65 25.61 25.82
新冠国际标准品 30.71 35.61 32.66 38.16
ΔCt 5.22 9.96 7.05 12.34
结论：在ARMS引物3’端倒数第2位引入一个额外突变可以使其对非 Omicron序列的检测Ct值大幅落后，同时对Omicron序列的检测Ct值基本不变，有利于结果判读。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测新冠S基因的引物和探针组合，其特征在于，包括第一组合和/或第二组合，其中：
所述第一组合包括N679K上游引物、N679K下游引物和N679K探针，所述N679K上游引物含有如SEQ ID NO.1的序列或含有与如SEQ ID NO.1互补的序列，所述N679K下游引物含有如SEQ ID NO.2的序列或含有与如SEQ ID NO.2互补的序列，所述N679K探针含有如SEQ IDNO.3所示序列或含有与SEQ ID NO.3互补的序列；
所述第二组合包括Q954H上游引物、Q954H下游引物和Q954H探针，所述Q954H上游引物含有如SEQ ID NO.4的序列或含有与如SEQ ID NO.4互补的序列，所述Q954H下游引物含有如SEQ ID NO.5的序列或含有与如SEQ ID NO.5互补的序列，所述Q954H探针含有如SEQ IDNO.6的序列或含有与如SEQ ID NO.6互补的序列。
2.如权利要求1所述的检测新冠S基因的引物和探针组合，其特征在于，还包括第三组合和/或第四组合，其中：
所述第三组合包括N基因上游引物、N基因下游引物和N基因探针，所述N基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如SEQ ID NO.7互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列；
所述第四组合包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针，所述内标上游引物含有如SEQ ID NO.10所述的序列或与含有如SEQ ID NO.10互补的序列，所述内标下游引物含有如SEQ ID NO.11所述的序列或与含有如SEQ ID NO.11互补的序列，所述内标探针含有如SEQ ID NO.12所述的序列或与含有如SEQ ID NO.12互补的序列。
3.一种检测新冠病毒核酸的引物和探针组合，其特征在于，所述检测新冠病毒核酸的引物和探针组合包括N基因上游引物、N基因下游引物和N基因探针，所述N基因上游引物含有如SEQ ID NO.7所述的序列或与含有如SEQ ID NO.7互补的序列，所述N基因下游引物含有如SEQ ID NO.8所述的序列或与含有如SEQ ID NO.8互补的序列，所述N基因探针含有如SEQ ID NO.9所述的序列或与含有如SEQ ID NO.9互补的序列。
4.一种用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括如权利要求1所述的检测新冠S基因的引物和探针组合。
5.如权利要求4所述的用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，在所述PCR反应液中：
所述N679K上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N679K下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N679K探针的浓度为0.05～0.5μM；和/或，
所述Q954H上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述Q954H下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述Q954H探针的浓度为0.05～0.5μM。
6.如权利要求4所述的用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还含有dNTPs、pH为8.0～9.0的Tris-HCl、KCl和1～5mM的MgCl2、甜菜碱中的至少一种；和/或，
所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括所述PCR酶液，所述PCR酶液包括0.5～5U的Taq酶、0.5～5U的Taq酶封闭剂、0.5～5U的逆转录酶、1～10U的尿嘧啶-N-糖基化酶和1～10U的RNA酶抑制剂；和/或，
所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括阳性对照品；和/或，所述用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒还包括阴性对照品。
7.如权利要求6所述的用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，在所述PCR反应液中，所述dNTPs含量为0.1～1mM；和/或，在所述PCR反应液中，所述Tris-HCl含量为10-50mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述KCl的含量为20～80mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述MgCl2的含量为1～5mM；和/或，
在所述PCR反应液中，所述甜菜碱的含量为1mM～50mM；和/或，
所述dNTPs包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP；和/或，
所述阳性对照品为使用数字PCR定量的2E5拷贝/毫升的Omicron假病毒；和/或，
所述阴性对照品为纯水。
8.一种用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括如权利要求2所述的检测新冠S基因的引物和探针组合。
9.如权利要求8所述的用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒，其特征在于，在所述PCR反应液中：
所述N基因引物对的上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N基因引物对的下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述N基因探针的浓度为0.05～0.5μM；和/或，
所述内标引物对的上游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述内标引物对的下游引物的浓度为0.1～1μM；和/或，
所述内标探针的浓度为0.05～0.5μM。
10.一种检测新冠病毒Omicron突变株的方法，其特征在于，所述检测新冠病毒Omicron突变株的方法包括：
采用如权利要求1或2所述的检测新冠S基因的引物和探针组合、如权利要求4所述的用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒或如权利要求8所述的用于新冠病毒Omicron突变株核酸检测试剂盒对待检测样品进行实时定量PCR扩增，根据扩增的结果对判断是否存在Omicron突变株。
CN202211373580.XA 2022-11-03 2022-11-03 一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒 Pending CN116121450A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211373580.XA CN116121450A (zh) 2022-11-03 2022-11-03 一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211373580.XA CN116121450A (zh) 2022-11-03 2022-11-03 一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116121450A true CN116121450A (zh) 2023-05-16

Family

ID=86299785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211373580.XA Pending CN116121450A (zh) 2022-11-03 2022-11-03 一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116121450A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981152A (zh) * 2021-12-28 2022-01-28 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN114410848A (zh) * 2022-03-30 2022-04-29 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN115261511A (zh) * 2022-05-27 2022-11-01 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981152A (zh) * 2021-12-28 2022-01-28 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN114410848A (zh) * 2022-03-30 2022-04-29 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN115261511A (zh) * 2022-05-27 2022-11-01 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111020064B (zh) 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒
US20230340624A1 (en) Detection reagents for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 and detection methods
US20230070496A1 (en) Nucleic Acid Detection Kit For Novel Coronavirus 2019-nCoV
WO2022089550A1 (en) Novel compositions and methods for coronavirus detection
CN111518960A (zh) 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN113293240B (zh) 一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用
CN113584224B (zh) 基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法
CN113005226A (zh) 检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒
CN109234456B (zh) 一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用
CN111910017A (zh) 一种检测呼吸道病原体多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
CN113151590A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoVORF1ab、N、E基因检测试剂盒及制备、检测方法
CN116121414A (zh) 一种同时检测六种呼吸道病原体的多重qPCR试剂盒
CN111926114A (zh) 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
CN111893215A (zh) 一种检测冠状病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
CN111518959A (zh) 新型冠状病毒的数字pcr检测方法及试剂盒
CN113930529B (zh) 用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用
CN113046452B (zh) 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用
CN116024386B (zh) 用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒
CN111378787A (zh) 一种新型冠状病毒的检测方法
CN111893217A (zh) 一种新型冠状病毒组合物及其试剂盒及其检测方法
CN116479177A (zh) 一种用于新型冠状病毒s基因6种突变位点检测的引物探针组合
CN116121450A (zh) 一种检测新冠病毒Omicron突变株核酸的引物和探针组合及试剂盒
CN112029901A (zh) 一种提高核酸扩增反应特异性的试剂、核酸扩增反应液和试剂盒
CN112266978A (zh) 引物探针组合、检测试剂盒及其应用
CN117344060B (zh) 一种同时检测新型冠状病毒毒株及其变异株的引物探针组合、试剂盒和检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination