CN116121321A - 一种添加Co2+提高多酶催化生产D-阿洛酮糖产率的方法 - Google Patents

一种添加Co2+提高多酶催化生产D-阿洛酮糖产率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种添加Co2+提高多酶催化生产D‑阿洛酮糖产率的方法，属于生物技术的领域。本发明提供一种多酶催化生产D‑阿洛酮糖的方法，所述方法为，向含有蔗糖、ATP的反应体系中添加Bifidobacterium adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶、Clostridium acetobutylicum来源的果糖激酶、Clostridium thermocellum来源的D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶、Pantoea sp来源的D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸‑3‑差向异构酶，同时，向反应体系中添加金属离子溶液后，进行反应生产D‑阿洛酮糖。本发明以廉价的蔗糖为底物合成一种重要的低热量功能性稀有糖D‑阿洛酮糖，并通过实验证明添加钴离子可使D‑阿洛酮糖的产率达到原来的五倍。

Description

一种添加Co2+提高多酶催化生产D-阿洛酮糖产率的方法
技术领域
本发明涉及一种添加Co2+提高多酶催化生产D-阿洛酮糖产率的方法，属于生物技术的领域。
背景技术
稀有糖是自然界中很少存在的单糖和糖醇。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是一种稀有糖，仅存在于自然界中少数物种中。大量研究表明，D-阿洛酮糖可以调节多种生理功能，从而抑制血糖升高，改善血脂代谢，减少体内脂肪堆积；还可以作为食品成分和膳食添加剂。
目前工业上生产D-阿洛酮糖主要是通过D阿洛酮糖3差向异构酶的差向异构反应，但是该方法转化率低，成本较高。因此，得到一种高转化率、低成本的D-阿洛酮糖的制备方法，对于工业生产具有重要的意义。
发明内容
本发明提供一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的方法，并通过添加Co2+使产物收率大幅度增加。本发明从低廉的蔗糖出发，经磷酸化和去磷酸化合成D-阿洛酮糖。由于最后一步是去磷酸化反应，因此阿洛酮糖的理论产率可达100％。为提高该方法合成D-阿洛酮糖的产率，作者通过实验探究金属离子对D-阿洛酮糖生产的影响。
本发明提供了一种多酶催化生产D-阿洛酮糖的方法，所述方法为，向含有蔗糖、ATP的反应体系中添加Bifidobacterium adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶、Clostridiumacetobutylicum来源的果糖激酶、Clostridium thermocellum来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、Pantoea sp来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶，同时，向反应体系中添加金属离子溶液后，进行反应生产D-阿洛酮糖。
在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶、果糖激酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶均是采用重组大肠杆菌表达的重组酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述果糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；编码所述果糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码所述D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子为Co2+。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子Co2+的添加量为：0.1～10.0mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子Co2+的添加量为：0.5～10.0mmol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，反应条件为：40～50℃，pH 7.5～8.5，反应时间为6～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述底物蔗糖的添加量为：5～20mM。
在本发明的一种实施方式中，所述底物ATP的添加量为：5～20mM。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中还含有缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCl(50mM，pH 8.0)。
本发明还提供了一种提高D-阿洛酮糖的产率的方法，向含有蔗糖、ATP、Bifidobacterium adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶、Clostridium acetobutylicum来源的果糖激酶、Clostridium thermocellum来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、Pantoea sp来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶的反应体系中，添加金属离子Co2+溶液，进行反应制备D-阿洛酮糖。
在本发明的一种实施方式中，所述Co2+溶液的浓度为：0.1～10.0mmol/L。
有益效果
(1)本发明提供一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的方法，并通过添加Co2+使产物收率大幅度增加，本发明从低廉的蔗糖出发，经磷酸化和去磷酸化合成D-阿洛酮糖，由于最后一步是去磷酸化反应，因此阿洛酮糖的理论产率可达100％，为提高该方法合成D-阿洛酮糖的产率，作者通过实验探究金属离子对D-阿洛酮糖生产的影响。
(2)本发明提供了一种合成D-阿洛酮糖的方法，以廉价的蔗糖为底物合成一种重要的低热量功能性稀有糖D-阿洛酮糖，并通过实验证明添加钴离子可使D-阿洛酮糖的产率达到原来的五倍。
附图说明
图1：蔗糖磷酸化酶(SP)，果糖激酶(FRK)，D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶(A6PE)和D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)细胞破碎上清液和沉淀的SDS-PAGE分析。其中，M：Blue PlusⅡProtein Marker；1：SP上清；2：SP沉淀；3：FRK上清；4：FRK沉淀；5：A6PP上清；6：A6PP沉淀；7：A6PE上清；8：A6PE沉淀。
图2：不同金属离子对反应的影响。
图3：不同Co2+浓度对反应的影响。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、pET-28a(+)和pET-42b(+)质粒购自Takara公司。
实施例中涉及的蔗糖磷酸化酶(SP)来源于Bifidobacterium adolescentis，果糖激酶(FRK)来源于Clostridium acetobutylicum，D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶(A6PE)来源于Pantoea sp，D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)来源于Clostridium thermocellum。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
实施例1：重组质粒及重组菌株的构建
具体步骤如下：
(1)从NCBI中获取蔗糖磷酸化酶SP基因(Reference Sequence登录号为：WP_011679246.1)、果糖激酶FRK基因(Reference Sequence登录号为：KHD36265.1)、D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶A6PE基因(Reference Sequence登录号为：WP_039379501.1)、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶A6PP基因(Reference Sequence登录号为：WP_003512401.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性，对其进行优化，将获得的基因送于公司合成。分别得到：蔗糖磷酸化酶(SP)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、果糖激酶(FRK)基因(核苷酸序列如SEQID NO.6所示)、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(A6PE)基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)；
(2)分别将上述基因：蔗糖磷酸化酶(SP)基因、果糖激酶(FRK)基因、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)基因、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(A6PE)同pET28a质粒连接(公司合成)后，分别制备得到：pET28a-SP、pET28a-FRK、pET28a-A6PP、pET28a-A6PE。
(3)将公司合成的重组质粒pET28a-SP、pET28a-FRK、pET28a-A6PP转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养12～14h，在LB固体培养基上挑取转化子即获得含有重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FRK、E.coli BL21(DE3)/pET28a-SP、E.coli BL21(DE3)/pET28a-A6PP。
(4)将公司合成的重组质粒pET28a-A6PE进行目的基因的提取，与pET-42b(+)质粒经双酶切(EcoR I和Xho I)后的产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养12～14h，在LB固体培养基上挑取转化子，测序正确即获得含有重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET42b-A6PE。
实施例2：酶的表达与纯化
具体步骤如下：
1、蔗糖磷酸化酶(SP)、果糖激酶(FRK)、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)的表达纯化
(1)酶的表达
分别将实施例1中获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FRK、E.coliBL21(DE3)/pET28a-SP、E.coli BL21(DE3)/pET28a-A6PP接入LB液体培养基，于37℃培养10～12h，分别获得种子液；
分别将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于37℃、180rpm培养至OD600为0.8～0.9后，在培养液中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于25℃、180rpm继续诱导培养12h，得到发酵液。
将发酵液于4℃、8000rpm离心10min后，收集菌体；将菌体进行破碎，获得细胞破碎液；将细胞破碎液进行离心，获得细胞破碎液上清液和沉淀，将细胞破碎液上清液和沉淀通过SDS-PAGE进行分析，结果如图1所示。
结果显示，以上三种酶的蛋白可溶性表达均良好，可直接进行蛋白纯化。
(2)酶的纯化
分别将步骤(1)获得的蔗糖磷酸化酶(SP)、果糖激酶(FRK)、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)粗酶液进行镍柱亲和层析纯化，具体步骤如下：
1)配制溶液：
A液：0.5mol/L NaCl、20mmol/L咪唑、25mmol/LTris-HCl、1％甘油(m/m)，pH＝7.4。
B液：0.5mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑、25mmol/LTris-HCl、1％甘油(m/m)，pH＝7.4。
裂解液：0.5mmol/L NaCl、25mmol/LTris-HCl、50mmol/L EDTA，pH＝7.0。
NiSO4：100mmol/L NiSO4。
2)操作：
柱再生：选用1mLNi-NTA预装重力柱用来进行蛋白纯化。首先向柱子中加入10倍柱体积的A液清洗柱子，待柱中A液快流尽时迅速加入10倍柱体积的超纯水冲洗，加入10倍柱体积的裂解液清洗，最后加入10倍柱体积的屈臣氏超纯水冲洗，以保证柱子充分洗净。向柱子中加入10倍柱体积的已配好的NiSO4溶液，静置保柱5min。观察柱子填料呈现明显蓝绿色后，放掉NiSO4溶液并向柱子中加入20倍柱体积的A液，完成准备。
上样：用去除杂质后得到的上清液上柱，接着向柱子中加入10倍柱体积的A液。
洗脱：采用不同梯度洗脱方法洗脱目的蛋白，通过调节A液与B液的比例来设置不同浓度的咪唑(分别为50mmol/L，200mmol/L，200mmol/L，400mmol/L，500mmol/L)洗脱吸附在柱上的目的蛋白。收集各梯度的洗脱液。
保存：向柱子中加入10倍柱体积的B液清洁柱子，接着加入10倍柱体积的超纯水冲洗，最后用20％的乙醇保存柱子。用10mL离心管收集得到的各梯度洗脱液，并使用SDS-PAGE分析其中目的蛋白浓度，以确定适合目的蛋白的洗脱液浓度。将确定的单一粗条带用10kDa超滤管于4℃、4000r/min反复离心浓缩置换，最后将获得的纯酶分装到1.5mL离心管中，用于后续的酶学性质研究。
分别制备得到蔗糖磷酸化酶(SP)纯酶液、果糖激酶(FRK)纯酶液、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)纯酶液，此时，采用Nanodrop检测酶浓度，结果显示，浓度分别为：10mg/mL，8mg/mL，10mg/mL。
2、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶的表达纯化
(1)酶的表达
按照步骤1的方法，将细胞破碎液上清液和沉淀通过SDS-PAGE进行分析，结果如图1所示，结果显示：该酶的蛋白可溶性表达良好，可直接进行蛋白纯化。
制备得到D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶粗酶液。
(2)酶的纯化
将获得D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶进行GST标签蛋白纯化，具体步骤如下：
1)配制溶液：
平衡液：150mmol/L NaCl、50mmol/LTris-HCl，pH＝8.0。
洗脱液：150mmol/L NaCl、50mmol/LTris-HCl、10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH＝8.0。
2)操作：
平衡：选用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱用来进行蛋白纯化，首先用10mL超纯水清洗柱子，接着用10mL平衡液冲洗。
上样：用去除杂质后得到的上清液上柱，接着向柱子中加入20倍柱体积的平衡液。
洗脱：向柱子中加入30-40倍柱体积的洗脱液洗脱吸附在柱上的目的蛋白，收集洗脱液。
保存：向柱子中加入20倍柱体积的平衡液清洁柱子，接着加入10倍柱体积的超纯水冲洗，最后用20％的乙醇保存柱子。用10mL离心管收集得到的各梯度洗脱液，并使用SDS-PAGE分析其中目的蛋白浓度，以确定适合目的蛋白的洗脱液浓度。将确定的单一粗条带用50kDa超滤管于4℃、4000r/min反复离心浓缩置换，最后将获得的纯酶分装到1.5mL离心管中，用于后续的酶学性质研究。
制备得到-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶纯酶液，此时，采用Nanodrop检测酶浓度，结果显示，浓度分别为：5mg/mL。
实施例3：不同金属离子对级联反应的影响
具体步骤如下：
向含有终浓度为10mM蔗糖，10mM ATP的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)缓冲液反应体系中，分别添加实施例2制备得到的0.4μM蔗糖磷酸化酶(SP)、0.4μM果糖激酶(FRK)、0.4μM D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)、0.8μM D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(A6PE)后，分别加入终浓度为1mM的不同金属离子溶液：Mg2+、Mn2+、Co2+、Ca2+、NH4 +、Zn2+。
对照：不添加金属离子的反应体系。
反应在40℃下进行，不同时间取样，进行高效液相色谱分析，结果见图2和表1所示。由于是产物的最大得率，因此时间都不相同，因为每个反应达到平衡的时间不同，结果如表1所示。
表1不同金属离子反应
金属离子 产物最大得率(％) 反应时间(h)
对照 15.9 36
<![CDATA[Mg<sup>2+</sup>]]> 26.3 36
<![CDATA[Mn<sup>2+</sup>]]> 12.3 36
<![CDATA[Co<sup>2+</sup>]]> 76.2 12
<![CDATA[Ca<sup>2+</sup>]]> 14.2 36
<![CDATA[NH<sub>4</sub><sup>+</sup>]]> 11.7 36
<![CDATA[Zn<sup>2+</sup>]]> 18.6 36
由图1及表1可知，加入Mg2+、Co2+和Zn2+反应的产物得率都高于不加金属离子的产物收率，其中加入Co2+可使产品得率提高至原来的五倍。
实施例4：Co2+浓度对级联反应的影响
向含有终浓度为10mM蔗糖，10mM ATP的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)缓冲液反应体系中，分别添加实施例2制备得到的0.4μM蔗糖磷酸化酶(SP)、0.4μM果糖激酶(FRK)、0.4μMD-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)、0.8μM D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(A6PE)后，分别加入终浓度为0.5mM、1mM、2mM、5mM和10mM的CoCl2·6H2O。
对照：不添加Co2+的反应。
反应在40℃下进行，不同时间取样，进行高效液相色谱分析，由于是产物的最大得率，因此时间都不相同，因为每个反应达到平衡的时间不同，结果见图3和表2所示。
表2不同Co2+浓度反应
浓度(mM) 产物最大得率(％) 反应时间(h)
对照 15.9 36
0.5 68.5 36
1 76.2 12
2 79.3 6
5 83.3 6
10 84.4 6
由图2及表2可知，当Co2+浓度高于2mM(包括2mM)时，反应6h即可达到最大产物得率，且产物得率都在80％左右，结合产物的分离纯化，选择2mM的Co2+浓度。
对比例1：不同来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶对D-阿洛酮糖产量的影响
具体实施方式同实施例1～3，区别在于，将Pantoea sp来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(以下简称PspA6PE)调整为：来源于Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(NCBI登录号为：WP_013298194.1，简称为TtA6PE)和来源于Escherichia coli(NCBI登录号为：EDU66157.1)的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(简称为EcA6PE)。
(1)按照实施例1～2的方法，分别制备得到D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶TtA6PE、EcA6PE、PspA6PE纯酶液。
同时，制备得到蔗糖磷酸化酶(SP)纯酶液、果糖激酶(FRK)纯酶液、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)纯酶液。
(2)按照实施例3的方法，向含有终浓度为10mM蔗糖，10mM ATP的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)缓冲液反应体系中加入0.4μM蔗糖磷酸化酶(SP)、0.4μM果糖激酶(FRK)、0.4μM D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)、0.8μM D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶(即分别加入TtA6PE、EcA6PE、PspA6PE酶)后，不添加金属离子，反应温度为40℃，分别制备得到不同的反应产物。
结果显示，反应48h后，在含有TtA6PE或EcA6PE纯酶液的反应中，产物的最大得率均＜5％，而含有PspA6PE纯酶液的反应中，产物的最大得率＞10％。
因此选择Pantoea sp来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶。
对比例2：不同载体对于D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶纯化的影响
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，采用pET28a为表达载体，表达D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶，制备得到E.coli BL21(DE3)/pET28a-A6PE，由于E.coli BL21(DE3)/pET28a-A6PE蛋白的可溶性表达较差，且按照实施例2的纯化方法，无法制备得到D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶纯酶液，因此选择将pET28a表达载体替换为pET42b表达载体。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种多酶催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法为，向含有蔗糖、ATP的反应体系中添加Bifidobacterium adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶、Clostridiumacetobutylicum来源的果糖激酶、Clostridium thermocellum来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、Pantoea sp来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶，同时，向反应体系中添加金属离子溶液后，进行反应生产D-阿洛酮糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶、果糖激酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶为采用重组大肠杆菌表达的重组酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述果糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金属离子为Co2+。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述金属离子Co2+的添加量为：0.1～10.0mmol/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，反应条件为：40～50℃，pH7.5～8.5，反应时间为6～48h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述底物蔗糖的添加量为：5～20mM，所述底物ATP的添加量为：5～20mM。
9.一种提高D-阿洛酮糖的产率的方法，其特征在于，向含有蔗糖、ATP、Bifidobacterium adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶、Clostridium acetobutylicum来源的果糖激酶、Clostridium thermocellum来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、Pantoea sp来源的D-阿洛酮糖-6-磷酸-3-差向异构酶的反应体系中，添加金属离子Co2+溶液，进行反应制备D-阿洛酮糖。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Co2+溶液的浓度为：0.1～10.0mmol/L。
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