CN116121246A

CN116121246A - 一种新型小激活rna

Info

Publication number: CN116121246A
Application number: CN202211091405.1A
Authority: CN
Inventors: 李龙承; 姜武林; 罗伯特·F·佩雷斯; 吴建成
Original assignee: Sino American Ruikang Nucleic Acid Technology Nantong Research Institute Co ltd
Current assignee: Sino American Ruikang Nucleic Acid Technology Nantong Research Institute Co ltd
Priority date: 2018-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2023-05-16
Also published as: EP3778892A4; EP3778892A1; US20210332366A1; AU2019252204A1; CN110959042A; JP2021520221A; JP7432521B2; AU2019252204A2; WO2019196887A1; IL277921A; CN110959042B; KR20200140377A; CA3094575A1

Abstract

提供了一种小激活RNA及其在制备用于激活或上调靶基因表达的药物中的应用，所述小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30个核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15‑30个核苷酸的连续片段存在75％以上的同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1‑4个核苷酸的突出端。

Description

一种新型小激活RNA

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用靶向基因启动子序列的双链小RNA正向调控基因表达。

背景技术

双链小核酸分子包括化学合成的寡核糖核苷酸如小激活RNA(saRNA)和天然存在的寡核糖核苷酸如微小核糖核苷酸(miRNA)已被证明能够以序列特异性的方式靶向蛋白编码基因的调控序列如启动子序列而在转录和表观遗传水平正向调控基因的表达水平，这种现象被称为RNA激活(RNAa)(Li,Okino et al.(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103:17337-17342；Janowski,Younger et al.(2007)Nat Chem Biol 3:166-173；Place,Li etal.(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105:1608-1613；Huang,Place et al.(2012)Nucleic Acids Res 40:1695-1707；Li(2017)Adv Exp Med Biol 983:1-20)。研究表明RNA激活是从秀丽隐杆线虫到人的进化保守的内源性分子机制(Huang,Qin et al.(2010)PLoSOne 5:e8848；Seth,Shirayama et al.(2013)Dev Cell 27:656-663；Turner,Jiao et al.(2014)Cell Cycle 13:772-781)。

如何安全且有选择性的增强人体细胞内源性基因或者蛋白质表达仍然是基因治疗领域的一个巨大挑战。传统的基于病毒基因治疗系统具有其固有的缺陷，包括有可能改变宿主基因组及引起免疫反应等副作用。而RNA激活具有能够激活内源基因表达而不改变基因组的优点，代表了一种激活内源性基因表达的新策略，在疾病治疗方面具有巨大的应用价值。

p21^WAF1/CIP1(也称CDKN1A，下称p21)基因为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，是一个重要的肿瘤抑制基因(Harper,Adami et al.(1993)Cell 75:805-816；Fang,Igarashi et al.(1999)Oncogene 18:2789-2797)。研究表明，异位载体过表达p21或者通过激活内源性p21的转录可以有效抑制肿瘤细胞和在体肿瘤的生长(Harper,Adami et al.(1993)Cell 75:805-816；Eastham,Hall et al.(1995)Cancer Res 55:5151-5155；Wu,Bellas et al.(1998)J Exp Med 187:1671-1679；Harrington,Spitzweg et al.(2001)JUrol 166:1220-1233)。因此，靶向激活p21基因的方法有可能在诸多疾病例如癌症的治疗上有广泛应用价值。

发明内容

本发明提供了一种能够在细胞内靶向增加基因表达的寡核苷酸分子和方法。该方法通过向细胞内引入靶向靶基因启动子序列的寡核苷酸分子，从而有效地增加目的基因的表达，并产生有效的生物学作用。本发明所述的寡核苷酸是在结构方面得到优化的双链核糖核苷酸分子，这种分子也被称为小激活RNA(saRNA)。

本发明提供了一种小激活RNA，所述的小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15-30个核苷酸的连续片段存在75％以上例如80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、99％以上、100％的序列同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端即无突出端结构，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1-4个核苷酸的突出端，例如1、2、3、4个核苷酸的突出端。在一个具体实施例中，上述小激活RNA中的第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成2-3个核苷酸的突出端。

上述的小激活RNA，其中突出端的核苷酸可以选自T(胸腺嘧啶)、U(尿嘧啶)或天然核苷酸突出，例如突出端为dTdTdT、dTdT、UUU、UU或连续的2个或3个天然核苷酸(例如A、T、G、C)。本发明中所述的天然核苷酸突出，是指第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的末端突出的核苷酸与对应的靶点序列的核苷酸相同或互补。

上述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的5’端处于双链体平端，所述第一或第二寡核苷酸链中自5’端起的第1至第3个核苷酸与另一条链对应位置的核苷酸存在1-3个碱基的错配。优选情况下错配为胞嘧啶错配。本文所述的胞嘧啶错配至少有两种方式，一种方式是一条链上的核苷酸本身为胞嘧啶核苷酸(C)，而在合成第二条链时将与胞嘧啶通过Watson-Crick配对的鸟嘌呤核苷酸(G)替换为非鸟嘌呤核苷酸如腺嘌呤核苷酸(A)或胸腺嘧啶核苷酸(T)或尿嘧啶核苷酸(U)；另一种方式是一条链上的核苷酸本身为非鸟嘌呤核苷酸如为腺嘌呤核苷酸(A)或尿嘧啶核苷酸(U)或胸腺嘧啶核苷酸(T)，而将另一条链上原本与A或U或T通过Watson-Crick配对的核苷酸替换为胞嘧啶核苷酸(C)。

本发明提供的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体不包含突出端的长度为17-24个核苷酸，例如17、18、19、20、21、22、23、24；优选情况下，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体不包含突出端的长度为18-20个核苷酸。

本发明还提供了上述小激活RNA在制备用于激活或上调靶基因在细胞中表达的制剂例如药物中的应用。所述的小激活RNA可以被直接导入所述细胞中。所述的细胞是哺乳动物细胞，优选为人类细胞。所述人类细胞可以存在于人体中，也可以是离体的如分离的细胞系或细胞株或原代细胞。

上述所述的人体是患有由靶基因表达缺陷和/或不足引发的疾病病患，并且所述小激活核酸分子被施用以有效量以实现对疾病的治疗。

在一种情况下，所述的小激活RNA的靶基因为人p21基因，在其他情况下也可以是因为基因表达缺陷或不足引起疾病的其他的致病基因，例如KLF4基因、NKX3-1基因、VEGFA基因。

当靶基因为p21基因或其他基因时，所述的小激活RNA能够激活或上调靶基因表达为上调至少10％，例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上。

本发明还提供了包含上述小激活RNA和药学上可接受的载体的组合物。其中药学上可接受的载体为脂质体、高分子聚合物或多肽。

本发明还提供了上述小激活RNA或组合物在制备用于激活或上调靶基因表达的药物中的应用，优选为在制备抗肿瘤或良性增殖性病变的药物中的应用，更优选地，所述肿瘤为膀胱癌、前列腺癌、肝癌或结直肠癌。

附图说明

图1示出p21基因启动子序列，从转录起始位点(TSS)上游-1000bp至TSS下游3bp。TSS由弯曲的箭头表示。

图2示出筛选p21基因启动子上小激活RNA热点区域。针对图1所示p21启动子序列设计并化学合成439个小激活RNA，单个转染至PC3人前列腺癌细胞。72小时后用QuantiGene2.0方法分析p21基因mRNA水平。(A)439个saRNA(X轴)分别所致的p21 mRNA水平相对于对照处理的倍数变化(Y轴)。X轴上的小激活RNA按照它们相对于p21基因的转录起始位点(TSS)的位置(从最上游的RAG-898到最下游的RAG1-177)进行排序。图示中标出了8个热点(hotspot)区域(浅灰色长方形框)。(B)对(A)的数据按照每个小激活RNA诱导p21 mRNA表达改变的倍数大小从低到高进行排序。(A)和(B)中的虚线表示2倍诱导的位置。

图3示出热点区1至8的小激活RNA对p21基因的激活作用。

图4示出采用RT-qPCR方法分析p21基因mRNA水平，以验证QuantiGene 2.0实验结果。(A)将439个小激活RNA按照它们诱导p21 mRNA表达的活性分成四个组(bin)，从每组中随机挑选5个小激活RNA，分别以10nM的浓度转染至PC3细胞。72小时后，提取mRNA、反转录后采用RT-qPCR方法分析p21基因mRNA水平。(B)QuantiGene 2.0(X轴)和RT-qPCR(Y轴)方法检测小激活RNA诱导的p21基因相对mRNA水平的相关性。

图5示出小激活RNA诱导p21 mRNA表达和抑制KU-7-Luc2-GFP细胞增殖的作用。所示3个小激活RNA分别以10nM转染KU-7-Luc2-GFP细胞72小时。(A)RT-qPCR分析p21基因mRNA表达水平。(B)CCK-8方法评估细胞活力。saRNA处理组细胞的活力表示为相对于对照处理组(Mock)细胞活力的百分比。(C)转染结束时具代表性的细胞图像(100×)。

图6示出小激活RNA诱导p21 mRNA表达和抑制HCT116细胞增殖的作用。所示3个小激活RNA分别以10nM转染HCT116细胞72小时。(A)RT-qPCR分析p21基因mRNA表达水平。(B)CCK-8方法评估细胞活力，saRNA处理组细胞的活力表示为相对于对照处理组(Mock)细胞活力的百分比。(C)转染结束时具代表性的细胞图像(100×)。

图7示出小激活RNA诱导p21 mRNA表达和抑制HepG2细胞增殖的作用。所示3个小激活RNA分别以10nM转染HepG2细胞72小时。(A)RT-qPCR分析p21基因mRNA表达水平。(B)CCK-8方法评估细胞活力，saRNA处理组细胞的活力表示为相对于对照处理组(Mock)细胞活力的百分比。(C)转染结束时具代表性的细胞图像(100×)。

图8示出p21启动子区以及其中一段作为小激活RNA靶点的序列示意图。以p21启动子相对转录起始位点(TSS)-332至-292的40bp区域为靶序列，设计一系列靶向该区域的小激活RNA，图中示出了与靶序列对应的同源小激活RNA序列。该启动子区域包含由单个核苷酸移位而形成的17个重叠的靶位点，其间仅被一段多聚腺苷重复序列(下划线)所间隔。

图9示出靶向p21启动子的小激活RNA的基因诱导活性。所述各小激活RNA分别以10nM转染KU-7-Luc2-GFP细胞72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定p21的相对表达水平(平均值±标准偏差)。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，***p<0.001)。

图10示出Rag1-0至Rag1-20的双链体小激活RNA序列及序列比对的双链结构示意图。错配碱基由冒号标示。粗体表示在Rag1-0基础上的核苷酸的变化。

图11示出Rag1变体(Rag1-0至Rag1-20)在人癌细胞系中诱导p21表达的活性。(A)KU-7-Luc2-GFP、(B)PC3和(C)Bel-7402细胞用所述各小激活RNA分别以10nM转染72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性saRNA(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定p21的相对表达水平(平均值±标准偏差)。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，***p<0.001)。

图12示出小激活RNA(Rag1-0至Rag1-20)对人癌细胞系的增殖抑制作用。(A)KU-7-Luc2-GFP、(B)PC3(C)Bel-7402细胞用所述各小激活RNA分别以10nM转染72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。采用CCK-8方法定量检测细胞活力。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，*P<0.5；**P<0.01；***p<0.001)。

图13示出Rag1-21至Rag1-44的双链体序列比对示意图。错配碱基由冒号标示，粗体表示核苷酸或者结构的改变。

图14示出小激活RNA(Rag1-21至Rag1-28)在人癌细胞系中诱导p21表达的活性。(A)KU-7-Luc2-GFP、(B)UM-UC-3、(C)T24、(D)J82和(E)Bel-7402细胞用所述各双链体分别以10nM转染72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定p21的相对表达水平(平均值±标准偏差)。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，*P<0.5；**P<0.01；***p<0.001)。

图15示出小激活RNA(Rag1-21至Rag1-28)对人癌细胞系的增殖抑制作用。(A)KU-7-Luc2-GFP、(B)UM-UC-3、(C)T24、(D)J82、和(E)Bel-7402细胞用所述各小激活RNA分别以10nM转染72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。采用CCK-8方法定量检测细胞活力。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，*P<0.5；**P<0.01；***p<0.001)。

图16示出小激活RNA(Rag1-29至Rag1-44)在人癌细胞系中诱导p21表达的活性。(A)KU-7-Luc2-GFP、(B)UM-UC-3、(C)T24、(D)J82和(E)PC3细胞用所述各双链体分别以10nM转染72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定p21的相对表达水平(平均值±标准偏差)。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，*P<0.5；**P<0.01；***p<0.001)。

图17示出小激活RNA(Rag1-29至Rag1-44)对人癌细胞系的增殖抑制作用。(A)KU-7-Luc2-GFP、(B)UM-UC-3、(C)T24、(D)J82和(E)PC3细胞用所述各双链体分别以10nM转染72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照。非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。采用CCK-8方法定量检测细胞活力。统计学显著性差异由单因素方差分析和Tukey's多重比较检验确定(相对于空白对照，*P<0.5；**P<0.01；***p<0.001)。

图18示出p21基因saRNA双链体序列比对示意图。错配碱基由冒号标示，粗体表示核苷酸或者结构的改变。

图19示出靶向p21启动子的小激活RNA的基因诱导活性。所述各小激活RNA分别以10nM转染KU-7-Luc2-GFP细胞72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照(Mock)，非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定p21基因的mRNA的相对表达水平(两次实验的平均值±标准偏差)。

图20示出KLF4、NKX3-1及VEGFA基因saRNA双链体序列比对示意图。错配碱基由冒号标示，粗体表示核苷酸或者结构的改变。

图21示出靶向KLF4启动子的小激活RNA的基因诱导活性。所述各小激活RNA分别以10nM转染PC3(A)、KU-7-Luc2-GFP(B)和Bel-7402(C)细胞72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照(Mock)，非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定KLF4 mRNA的相对表达水平(至少两次实验的平均值±标准偏差)。

图22示出靶向NKX3-1启动子的小激活RNA的基因诱导活性。所述各小激活RNA分别以10nM转染PC3(A)和Bel-7402(B)细胞72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照(Mock)，非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定NKX3-1 mRNA的相对表达水平(至少两次实验的平均值±标准偏差)。

图23示出靶向VEGFA启动子的小激活RNA的基因诱导活性。所述各小激活RNA分别以所示浓度转染HeLa(A)、COS-1(B)和ARPE-19(C)细胞72小时。不含寡核苷酸的转染样品作为空白对照(Mock)，非特异性双链体(dsCon)转染样品作为阴性对照。通过RT-qPCR，以GAPDH的表达量作为内参，确定VEGFA mRNA的相对表达水平(至少两次实验的平均值±标准偏差)。

图24示出p21 saRNA Rag1-40抑制肿瘤生长。所示小激活RNA以1mg/kg的剂量瘤内注射，记录给药期间的移植瘤体积变化。箭头示给药时间点。

具体实施方式

下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

本申请中，单数形式“一个”、“该”包括复数对象，除非上下文另外清楚规定。

定义

如本文所用的术语“互补”是指两条寡核苷酸链彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的寡核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补寡核苷酸链可以Watson-Crick方式碱基配对(例如，A至T，A至U，C至G)，或以允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen型或者反向Hoogsteen型碱基配对)进行碱基配对。“100％配对”是指100％的互补性，即两条链的核苷酸单元全部互相氢键结合。

完全互补性或100％的互补性是指双链寡核苷酸分子的双链区中来自第一条寡核苷酸链的每个核苷酸单元可以与第二条寡核苷酸链形成氢键而没有“错配”的情况。不完全互补是指两条链的核苷酸单元不能全部互相氢键结合的情况。例如，对于两条双链区为20个核苷酸长度的寡核苷酸链，如果每条链上只有两个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出10％的互补性。在同一实例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出90％的互补性。基本互补性是指约79％，约80％，约85％，约90％，约95％以上的互补性。

如本文所用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物，并且包括但不限于DNA，RNA或DNA/RNA杂交体的单链或双链分子，包括规则地和不规则地交替的脱氧核糖核苷酸部分和核糖核苷酸部分的寡核苷酸链，以及这些种类的寡核苷酸的修饰和天然存在的或非天然存在的骨架。本发明中所述的用于激活靶基因转录的寡核苷酸为小激活RNA。

如本文所用的术语“寡核糖核苷酸”是指包含两个或更多个经修饰或未经修饰的核糖核苷酸和/或其类似物的寡核苷酸。

如本文所用的术语“寡核苷酸链”和“寡核苷酸序列”可互换，是指30个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA)。在本发明中，寡核苷酸链的长度可以是17至30个核苷酸的任一长度。

如本文所用的术语“基因”是指编码一条多肽链或转录一条功能性RNA所需要的全部核苷酸序列。“基因”可以是对于宿主细胞而言内源的或完全或部分重组的基因(例如，由于引入编码启动子的外源寡核苷酸和编码序列或将邻近内源编码序列的异源启动子导入宿主细胞)。例如，术语“基因”包括可以由外显子和内含子组成的核酸序列。编码蛋白质的序列是，例如，包含在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框中的外显子内的序列，如本文所用，“基因”可以指包括例如基因调控序列例如启动子，增强子和本领域已知的控制另一基因的转录，表达或活性的所有其他序列，无论另一基因是否包含编码序列或非编码序列。在一种情况下，例如，“基因”可以用于描述包含调控序列例如启动子或增强子的功能性核酸。重组基因的表达可以通过一种或多种异源调节序列来控制。

如本文所用的术语“靶基因”可以是天然存在于生物体中的核酸序列、转基因、病毒或细菌序列、染色体或染色体外和/或瞬时或稳定转染或掺入细胞和/或其染色质。靶基因可以为蛋白质编码基因，也可为非蛋白编码基因(例如微小RNA基因、长链非编码RNA基因)。靶基因通常含有启动子序列，设计与启动子序列具有同一性(也称同源性)的小激活RNA可以实现对靶基因的正性调控，表现为靶基因表达的上调。“靶基因启动子序列”是指靶基因的非编码序列，在本发明中涉及“与靶基因启动子序列互补”中靶基因启动子序列是指该序列的编码链，亦称非模板链，即为与该基因编码序列为同一序列的核酸序列。“靶点序列”是指靶基因启动子序列中与小激活RNA的正义寡核苷酸链或反义寡核苷酸同源或互补的序列片段。

如本文所用，术语“第一寡核苷酸链”可以是正义链也可以是反义链，小激活RNA的正义链是指小激活RNA双链体中含与靶基因的启动子DNA序列的编码链具有同一性的核酸链，反义链是指小激活RNA双链体中与正义链互补的核酸链。

如本文所用，术语“第二寡核苷酸链”也可以是正义链或者反义链。当第一寡核酸链为正义链时，第二寡核酸链为反义链，当第一寡核酸链为反义链时，第二寡核酸链为正义链。

如本文所用的术语“编码链”是指靶基因中不能进行转录的那一条DNA链，该链的核苷酸序列与转录生成的RNA的序列一致(在RNA中是以U取代了DNA中的T)。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的编码链是指与靶基因DNA编码链在同一条DNA链上的启动子序列。

如本文所用的术语“模板链”是指靶基因的双链DNA中与编码链互补的另一条链，可作为模板转录为RNA的那条链，该链与转录的RNA碱基互补(A-U，G-C)。在转录过程中，RNA聚合酶与模板链结合，并沿着模板链的3'→5'方向移动，按照5'→3'方向催化RNA的合成。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的模板链是指与靶基因DNA模板链在同一条DNA链上的启动子序列。

如本文所用的术语“启动子”是指不编码蛋白质的核酸序列，通过与蛋白质编码或RNA编码核酸序列在位置上关联而对它们的转录发挥调控作用。通常，真核启动子包含100-5,000个碱基对，尽管此长度范围并不意味着限制本文所用的术语“启动子”。虽然启动子序列一般位于蛋白质编码或者RNA编码序列的5'端，但启动子序列也存在于外显子及内含子序列中。

如本文所用的术语“转录起始位点”是指在基因的模板链上标志转录起始的核苷酸。转录起始位点可出现于启动子区的模板链上。一个基因可以有多于一个的转录起始位点。

如本文所用的术语“同一性”或“同源性”是指小激活RNA的其中一条寡核苷酸链(正义链或者反义链)与靶基因的启动子序列的某一区域的编码链或者模板链存在至少80％的相似性。

如本文所用的术语“突出”、“overhang”、“悬垂”可互换，是指寡核苷酸链末端(5'或3')非碱基配对核苷酸，其是由延伸超出双链寡核苷酸内的其中一条链的另一条链产生的。延伸超出双链体3'和/或5'端的单链区域被称为突出。如果在靶序列上向3’或者5’方向延伸而得到的突出称为“天然”突出。

如本文所用的术语“天然突出”、“天然核苷酸突出”可互换，是指在小激活RNA的正义链或者反义链中的5’末端或者3’末端同源自靶点序列的突出。

如本文所用，术语“基因激活”或“激活基因”可互换，是指通过测量基因转录水平、mRNA水平、蛋白水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平、或其在细胞或生物系统中的活性或状态来测定某一核酸转录、翻译或表达或活性的增加。这些活动或状态可以直接或间接的测定。此外，“基因激活”、“激活基因”是指与核酸序列相关的活性增加，而不管发生这种激活的机制如何，例如其作为调节序列发挥调控作用、被转录成RNA，被翻译为蛋白质并增加蛋白质的表达。

如本文所用，术语“小激活RNA”、“saRNA”可互换，是指能够促进基因表达的核糖核酸分子，并且可以由包含与靶基因的非编码核酸序列(例如启动子、增强子等)具有序列同一性的核糖核苷酸序列的核酸链和包含与该链互补的核苷酸序列的核酸链组成，形成双链体。小激活RNA也可以由合成的或者载体表达的可形成双链区发卡结构的单链RNA分子组成，其中第一区域包含与基因的启动子靶序列具有序列同一性的核糖核苷酸序列，第二区域包含的核糖核苷酸序列与第一区域互补。小激活RNA分子的双链体区域长度通常为约10至约50个碱基对、约12个至约48个碱基对、约14个至约46个碱基对、约16个至约44个碱基对、约18个至约42个碱基对、约20个和约40个碱基对、约22个和约38个碱基对、约24个和约36个碱基对、约26个和约34个碱基对、约28个和约32个碱基对、通常约10个、约15个、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50个碱基对。此外，术语“saRNA”和“小激活RNA”还含有除核糖核苷酸部分之外的核酸，包括但不限于修饰的核苷酸或类似物。

如本文所用，术语“热点”是指具有功能的基因启动子区域。在热点区域，呈现出可以靶向热点区域序列的功能性小激活RNA的聚集，这些热点区域内会产生至少10个对应的小激活RNA，其中，至少60％的小激活RNA能够诱导基因mRNA表达达到1.5倍或以上。

如本文所用，术语“合成”是指寡核苷酸的合成方式，包括任何能够合成RNA的方式，例如如化学合成、体外转录、载体表达等。

如本文所用，术语“p21”是指p21^WAF1/CIP1基因，也称CDKN1A基因，是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，也是一个重要的肿瘤抑制基因。过表达p21或者通过激活内源性p21的转录可以有效抑制肿瘤细胞和在体肿瘤的生长。

材料和方法

细胞培养和转染

细胞系RT4、KU-7、T24、和HT-1197培养在改良的McCoy's 5A培养基(Gibco)中；J82、TCCSUP，UM-UC-3细胞系在MEM培养基(Gibco)中，5637、PC3和Bel-7402培养在RPMI1640培养基(Gibco)中；。所有培养基含有10％小牛血清(Sigma-Aldrich)和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％CO₂，37℃条件下培养。依照制造商的说明，使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以10nM(除非另有说明)浓度转染小激活RNA，所有的小激活RNA序列列于表1中。

表1.链序列和双链体组成

RNA分离和反转录聚合酶链式反应

细胞以2–3×10⁵个细胞/孔接种在6孔板中，反向转染寡核苷酸双链体。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)，按照其说明书提取细胞总RNA。使用含有gDNA Eraser(Takara，Shlga，Japan)的PrimeScript RT试剂盒将RNA(1μg)反转录为cDNA。qPCR采用ABI7500 Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems)和SYBR Premix Ex Taq II(Takara，Shlga，Japan)试剂，反应条件为：95℃3秒，60℃30秒，扩增40个循环。以GAPDH为内参。所有引物序列列于表2中。

表2.qRT-PCR分析的引物序列

细胞增殖测定

将细胞以2–4×10³个细胞/孔铺板于96孔板中，培养过夜，转染寡核苷酸双链体。转染三天后，使用CCK-8(Dojindo)，依照其说明书进行细胞增殖检测。实验步骤简述如下：将10μL CCK8溶液加入到每孔中，37℃孵育1小时，后使用酶标仪测定450nm处吸光值。

QuantiGene 2.0分析

将细胞铺板于96孔板中并转染寡核苷酸双链体，转染72小时后，使用QuantiGene2.0试剂盒(AffyMetrix)定量检测目的基因mRNA水平。QuantiGene 2.0试剂盒是基于杂交技术的方法，使用基因特异性探针直接定量mRNA水平。实验步骤简述如下：添加裂解液以裂解转染后的细胞，细胞裂解物加样至包有CDKN1A(p21)和HPRT1(管家基因)探针的捕获孔板中，55℃杂交过夜。为了增强杂交信号，在100μL相应的缓冲液(Quantigene 2.0试剂盒提供)中顺次与2.0 PreAMP，2.0 AMP和2.0Lable Probe杂交。所有杂交均在50–55℃震荡1小时。最后一步洗涤后，加入2.0Substrate并在室温下孵育5分钟。然后使用Infinite 200PRO读板仪(Tecan，瑞士)检测光信号。

统计分析

结果表示为平均值±标准偏差。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software)进行单因素方差分析，后进行Tukey's t检验以进行统计分析。统计学显著性的标准设定为*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。

为便于描述，将采用以下公式说明小激活RNA(以下简称为saRNA)的结构，分为：

对寡核苷酸单链的描述：

[5OH_n]+N_n+[3OH_n] (公式1)

5OH_n或3OH_n分别为5’或者3’末端突出(overhang)，可以为天然核苷酸(naturaloverhang,NO)、脱氧胸腺苷酸(T)、或尿嘧啶核苷酸(U)突出等，n为突出核苷酸个数；N_n为另一条寡核苷酸链能形成双链结构的区域，其中N可为S(正义链)或AS(反义链)，n为与另外一条互补链形成双链结构的核苷酸的长度(不包括突出)。例如，5NO₁+AS₁₉+3T₂，表示为一个能与另外一条互补链形成长度为19个核苷酸双链区的反义链，其5’端有一个天然核苷酸的突出，3’端有2个脱氧胸腺核苷酸的突出，总长度为22个核苷酸(即：1+19+2)。方括号表示可选项。

对双链寡核苷酸的描述：

[B₅]+[B₃]+[MM_(N’nZ:X,Y)]+[OH_N5’] (公式2)

B5和B3分别为相对于双链体亦即相对于正义链的5’端为平端(5’-blunt)或者3’端为平端(3’-blunt)；MM为双链之间的错配；(N’n Z:X,Y)中的N’为从双链体的5’或3’端计数，n为错配核苷酸在双链体中的计数位置，X为突变前与靶点序列一致或者互补的核苷酸，Y为突变后的核苷酸，Z为突变核苷所在的链，正义为S，反义为AS。例如“3’1S:A,C”表示从双链体3’端计算第1位上对应的正义链的“A”(腺嘌呤核苷酸)突变为“C”(胞嘧啶核苷酸)；OH_N5’表示非常规的5’突出，N为S(正义链)或AS(反义链)。如OH_AS5’表示为AS链存在5’突出。含对称性3’突出的双链体被视为常规结构，不另说明。方括号表示可选项。

实施例1：筛选靶向p21基因启动子区的功能性小激活RNA

为了筛选能激活p21基因表达的功能性小激活RNA，从UCSC Genome数据库中检索获得p21基因的1kb启动子序列的编码链(图1)。从转录起始位点(TSS)上游-1kb处开始选定大小为19bp的靶点，通过每次移动1bp的方式，向TSS位点移动，获得总共982个靶点序列。对靶点序列进行过滤处理，以排除GC含量高于65％或低于35％，和含有5个或者多于5个的连续同一核苷酸的靶点序列。过滤后，剩余439个靶点序列作为候选进入筛选过程。基于每一个大小为19个核苷酸的候选靶序列，化学合成与其具有序列同一性的大小为19个核苷酸的RNA序列，并在其3’端加上dTdT，得正义链，结构式为：S₁₉+[3T₂]。同时合成与同一靶点序列反向互补的大小为19个核苷酸的RNA序列，并在其3’端加上dTdT，得反义链，结构式为：AS₁₉+[3T₂]。将正义链和反义链以相同摩尔数混合并做退火处理，得双链saRNA。

将前述双链saRNA以10nM的终浓度转染至Ku-7-luc2-GFP细胞，72小时后，使用QuantiGene 2.0试剂盒检测p21基因mRNA水平。计算每个saRNA相对于空白对照处理的p21mRNA水平的倍数变化并绘制在图2中。该研究中所有saRNA所引起的p21基因mRNA的倍数变化涵盖从0.66(抑制)至8.12(诱导)的范围(图2B)。有361个(82.2％)saRNA诱导p21表达1.01至8.12倍；74个(16.9％)saRNA表现出抑制作用(0.99至0.66倍)；4个saRNA(0.9％)对p21基因mRNA水平无影响(1.0倍)。

在被筛选的439个saRNA中，132个(30.1％)能够诱导p21 mRNA至少2倍；229个(52.4％)saRNA诱导p21 mRNA至少1.5倍。这些具有功能的saRNA分散在整个p21启动子区域。然而，在8个游离的区域呈现功能性小激活RNA的聚集，这些区域被称为“热点”。热点区域的定义为一个区域内含有至少10个对应的小激活RNA，其中，至少60％的小激活RNA能够诱导p21 mRNA表达达到1.5倍或以上(图2A和图3)。热点1至8的靶序列及对应的小激活RNA序列分别在表3和表4中列出。

表3 p21启动子热点区域靶序列

表4位于p21启动子热点区域的功能性小激活RNA

这些热点包括热点区域1，相应的靶序列为p21启动子序列的-893bp至-801bp，序列如SEQ ID NO:93所示，在这个区域发现有44个具有功能的saRNA(表4、图3A)，分别为RAG-834、RAG-845、RAG-892、RAG-846、RAG-821、RAG-884、RAG-864、RAG-843、RAG-854、RAG-844、RAG-887、RAG-838、RAG-858、RAG-835、RAG-876、RAG-870、RAG-853、RAG-881、RAG-828、RAG-872、RAG-841、RAG-831、RAG-829、RAG-820、RAG-822、RAG-868、RAG-849、RAG-862、RAG-865、RAG-893、RAG-848、RAG-824、RAG-866、RAG-840、RAG-875,、RAG-880、RAG-871、RAG-888、RAG-885、RAG-894、RAG-833、RAG-825、RAG-889、RAG-823；

热点区域2(表4、图3B)相应的靶序列为p21启动子序列的-717至-632bp，序列如SEQ ID NO:94所示，在这个区域发现31个具有功能的saRNA，分别为RAG-693、RAG-692、RAG-688、RAG-696、RAG-694、RAG-687、RAG-691、RAG-690、RAG-689、RAG-682、RAG-686、RAG-662、RAG-695、RAG-654、RAG-658、RAG-685、RAG-704、RAG-714、RAG-705、RAG-661、RAG-656、RAG-698、RAG-697、RAG-657、RAG-715、RAG-652、RAG-651、RAG-650、RAG-716、RAG-717、RAG-711；

热点3(表4、图3C)，相应的靶序列为p21启动子序列的-585bp至-551bp，序列如SEQID NO:95所示，在这个区域发现其包含9个具有功能的saRNA，分别为RAG-580、RAG-577、RAG-569、RAG-576、RAG-570、RAG-574、RAG-585、RAG-579、RAG-584；

热点4(表4、图3D)，相应的靶序列为p21启动子序列的-554bp至-505bp，序列如SEQID NO:96所示，在这个区域发现包含17个具有功能的saRNA，分别为RAG-524、RAG-553、RAG-537、RAG-526、RAG-554、RAG-523、RAG-534、RAG-543、RAG-525、RAG-535、RAG-546、RAG-545、RAG-542、RAG-531、RAG-522、RAG-529、RAG-552；

热点5(表4、图3E)，相应的靶序列为p21启动子序列的-514bp至-485bp，序列如SEQID NO:97所示，在这个区域发现包含9个具有功能的saRNA，分别是RAG-503、RAG-504、RAG-505、RAG-506、RAG-507、RAG-508、RAG-509、RAG-510、RAG-511、RAG-512、RAG-513、RAG-514；

热点6(表4、图3F)，相应的靶序列为p21启动子序列的-442bp至-405bp，序列如SEQID NO:98所示，在这个区域发现包含12个具有功能的saRNA，分别是RAG-427、RAG-430、RAG-431、RAG-423、RAG-425、RAG-433、RAG-435、RAG-434、RAG-439、RAG-426、RAG-428、RAG-442；

热点7(表4、图3G)，相应的靶序列为p21启动子序列的-352bp至-313bp，序列如SEQID NO:99所示，在这个区域发现包含13个具有功能的saRNA，分别是RAG-335、RAG-351、RAG-352、RAG-331、RAG-344、RAG-342、RAG-341、RAG-333、RAG-345、RAG-346、RAG-336、RAG-332、RAG-343；

热点8(表4、图3H)，相应的靶序列为p21启动子序列的-325bp至-260bp，序列如SEQID NO:100所示，在这个区域发现包含18个具有功能的saRNA，分别是RAG-294、RAG-285、RAG-286、RAG-292、RAG-291、RAG-284、RAG-279、RAG-280、RAG-325、RAG-293、RAG-322、RAG-321、RAG-281、RAG-289、RAG-278、RAG-283、RAG-282、RAG-295。

为验证QuantiGene 2.0检测结果，将439个小激活RNA按照其激活p21 mRNA表达的活性大小分成四个组(bin)，从每组中随机挑选5个saRNA，分别以10nM的浓度转染至Ku-7-luc2-GFP细胞。72小时后，提取mRNA、反转录后采用RT-qPCR方法分析p21基因mRNA水平。两种方法所揭示的p21基因mRNA表达水平显示出显著的相关性(R²＝0.82)(图4)。QuantiGene2.0方法所得的所有功能性saRNA均可通过RT-qPCR方法验证为真实的功能性saRNA，其中一些功能性saRNA在RT-qPCR分析中显示出更强的p21 mRNA诱导(表5)。

表5.对QuantiGene 2.0方法的验证

综上，上述数据表明，p21启动子区的许多特定位点可以用作saRNA靶点序列以诱导p21表达，其中一些区域更具有敏感性，其对应的saRNA有更大的可能性激活p21表达。

实施例2：saRNA诱导p21基因mRNA表达并抑制癌细胞增殖

为了进一步评估p21 saRNA诱导p21基因mRNA表达和抑制癌细胞增殖的作用，通过QuantiGene 2.0筛选的saRNA(RAG1-431、RAG1-553、RAG1-688)转染到癌细胞系Ku-7-luc2-GFP(膀胱癌)、HCT116(结肠癌)和HepG2(肝细胞癌)。结果显示，在上述所有细胞系中，saRNA均可诱导至少两倍的p21基因mRNA表达水平，并抑制细胞增殖，揭示了saRNA介导的p21诱导所产生的功效。具体而言，将RAG-431、RAG-553、RAG-688分别转染Ku-7-luc2-GFP细胞，分别诱导p21 mRNA表达14.0、36.9和31.9倍，并产生相对于空白处理的存活率为71.7％、60.7％、67.4％(图5)。将RAG-431、RAG-553、RAG-688分别转染HCT116细胞，分别诱导p21mRNA表达2.3、3.5、和2.4倍，并产生相对于空白处理的存活率为45.3％、22.5％、38.5％(图6)。将RAG-431、RAG-553、RAG-688分别转染HepG2细胞，分别诱导p21 mRNA表达2.2、3.3、和2.0倍，并产生相对空白处理的存活率为76.7％、64.9％、79.9％(图7)。

实施例3：进一步筛选和优化热点区域saRNA

为了筛选和验证激活p21表达的寡核苷酸，以热点7(相应的靶序列为p21启动子序列的-352bp至-313bp)为进一步筛选对象，从p21启动子相对转录起始位点(TSS)-332至-292的40bp区域为靶序列，合成了一系列靶向该区域的寡核苷酸双链体(每条链长21个核苷酸)。该启动子区域包含由单个核苷酸移位而形成的17个重叠的靶位点，其间一段多聚腺苷重复序列被排除在外(图8)。每个双链体含有与p21启动子中的同源序列相同的19个核苷酸的序列，在两条链上具有双dT突出端，该双链RNA根据它们相对于p21转录起始位点的靶点位置来命名，即P21-297，P21-298，P21-299，P21-325等。所有双链序列列于表1中。将每个双链体分别转染Ku-7-luc2-GFP(膀胱尿路上皮癌)细胞，并在72小时后检测p21基因mRNA表达水平。如图9所示，多个双链体(即P21-321、P21-322和P21-331)是p21的强激活剂，将其表达水平提高约4-6倍，而其他双链体没有显著上调p21表达。该数据显示，saRNA对基因的激活高度依赖于靶位点和/或其序列，靶点位置的细微改变(例如单核苷酸位移)有可能使功能性的saRNA完全失去活性。

实施例4：3'端为天然或2个尿嘧啶核苷酸突出(overhang)结构的双链saRNA

另外，针对特定的靶序列，对saRNA结构进行优化设计，也会产生更好的激活效果。具体数据如下：

选择P21-322(以下称为Rag1-0)，用于进一步开发具有改善的药物属性的新型序列。首先测试了saRNA双链体突出组成的改变，其中将每条链上的双dT核苷酸突出替换为天然核苷酸突出(即同源于靶基因启动子序列)或2个尿嘧啶核苷酸，得到2个新的saRNA变体(分别称为Rag1-1和Rag1-2)(图10)。将每个双链saRNA分别转染3种不同的细胞系，包括Ku-7-luc2-GFP、PC3(前列腺腺癌)和Bel-7402(肝细胞癌)细胞。72小时后评估p21基因mRNA表达水平。如图11A-C所示，在Ku-7-luc2-GFP细胞中，Rag1-1和Rag1-2与Rag1-0相比，p21诱导略微增加；在PC3和Bel-7402细胞中，Rag1-2比Rag1-0诱导p21表达的作用更强。CCK-8方法测得的细胞活力数据显示，Rag1-1和Rag1-2与Rag1-0相比，均改善了对Bel 7402细胞的增殖抑制作用(图12)。该数据提示，具有不同的核苷酸突出结构，即天然核苷酸突出(即同源于靶基因启动子序列)或2个尿嘧啶核苷酸，功能上不会比Rag1-0逊色，而且，对于某些肿瘤类型，或许比Rag1-0在诱导p21表达和抑制细胞增殖方面具有改善的效果。这也说明在某些癌症类型中，天然核苷酸突出或2个尿嘧啶核苷酸突出结构可以改善saRNA的基因诱导和生长抑制活性。含有天然突出端的双链体与靶序列100％互补，其序列全长来自其靶位点(不同于双dT和尿嘧啶突出)。这种设计比含有非天然或者错配突出的saRNA相比，可以提供更好的靶向特异性和互补性。

实施例5：双链saRNA长度对p21诱导活性的影响

为了确定双链体长度是否影响p21诱导活性，申请人通过在Rag1-0双链体(相对于正义链)的3'端每次增加同源序列的一个核苷酸的方式，设计合成了5个新的双链体，分别命名为Rag1-3、Rag1-4、Rag1-5、Rag1-6和Rag1-7，它们的长度分别为22、23、24、25和26个核苷酸。这些双链体保留双dT突出(图10)。如图所示，在图11A-C中，长度为22个核苷酸的Rag1-3与Rag1-0相比在Ku-7-luc2-GFP细胞中可以更好地诱导基因表达和抑制细胞增殖(图12)。双链体活性在大于22个核苷酸的长度上稳定丢失，意味着在21–22个核苷酸处的双链体长度对于基因诱导是较为优选的。

进一步，申请人基于P21-323(也称为Rag1-8)合成了含有天然核苷酸突出结构的变体(Rag1-9)和延伸至22、23、24、25或26个核苷酸(分别称为Rag1-10、Rag1-11、Rag1-12、Rag1-13、和Rag1-14，其突出结构仍然是双dT)的变体(图10)。结果显示，具有天然突出结构的21个核苷酸的Rag1-9未明显改善基因诱导活性，具有22个核苷酸长度的Rag1-10在所有细胞系中胜过所有其他双链体，是较强的p21激活剂(图11A-C)。同时，23个核苷酸长度的Rag1-11在Ku-7-luc2-GFP和PC3细胞中的诱导作用与Rag1-10相当，但在Bel-7402细胞中没有明显诱导p21基因表达(图11A-C)。因此，通过延长saRNA序列的长度，可将无活性的saRNA转化成强效的基因激活子。

实施例6：含有错配的双链saRNA

申请人设计和合成了Rag1-0的变体，其包含将与反义寡核苷酸链5’端第1位核苷对应的正义寡核苷酸链上的腺苷突变成尿嘧啶或者胞嘧啶，但保持反义寡核苷酸链不变，分别得到在双链saRNA 3’末端存在1个碱基错配的saRNA变体Rag1-15和Rag1-16。另外，将与反义链5’端第1和第2位核苷对应的正义链上的核苷突变成腺苷和尿嘧啶，得到saRNA变体Rag1-17，其双链的3’末端含有2个碱基的错配(图10)。转染这些saRNA至Ku-7-luc2-GFP、PC3或Bel-7402细胞中，所有三种saRNA变体均能诱导p21表达至少与Rag1-0相当或更好；然而，含有胞嘧啶错配的Rag1-16双链体在所有3种细胞系中都是强激活剂(图11A-C)。

实施例7：不对称结构的双链saRNA

发明人还合成了不对称结构的双链体，包括Rag1-18(正义链3’端无突出，形成3’平末端的双链体)、Rag1-20(去除正义链上的5'末端第1位核苷导致反义链上的3'端产生3个核苷酸突出)和Rag1-19(含Rag1-18与Rag1-20两种结构修饰的组合，即正义链上5’端第1位核苷与3’末端的双dT突出被去除，形成5'端有3个核苷突出及3'末端为平端的不对称双链结构(图10)。如图11A-C中所示，Rag1-18未能在3种细胞系中都激活p21，而Rag1-20在所有3种细胞系中诱导p21的能力与Rag1-0相当。与Rag1-18相比，Rag1-19内两种结构修饰的组合恢复了其基因诱导活性。这两种结构的优化均有可能在保留saRNA的基因诱导活性的同时，减少正义链的脱靶效应，且由于使用较少的核酸用于寡核苷酸合成而带来额外的成本节省的好处。

实施例8：结构特征组合的优化

1.如图13所示，Rag1-21、Rag1-22、Rag1-23和Rag1-24是Rag1-10的衍生物。

(1)Rag1-21含有2个尿嘧啶突出，结构组合式为：正义链(S₂₀+3U₂)，反义链(AS₂₀+3U₂)。

(2)Rag1-22含有2个天然核苷酸突出，结构组合式为：正义链(S₂₀+3NO₂)，反义链(AS₂₀+3NO₂)。

(3)Rag1-23是Rag1-21的变体，其双链体的3'末端第一位碱基存在错配，该错配是突变正义链上的腺苷为胞嘧啶而形成。结构组合式为：正义链(S₂₀+3U₂)，反义链(AS₂₀+3U₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(4)Rag1-24是Rag1-23的变体，其中正义链5'末端第一个核苷酸缺失，从而延伸了反义链的突出长度。结构组合式为：正义链(S₁₉+3U₂)，反义链(AS₂₀+3U₂NO₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

2.Rag1-25和Rag1-26是Rag1-16的变体，其中的正义与反义链的突出均分别被2个尿嘧啶核苷酸或天然突出取代，其中正义链包含3'胞嘧啶错配。

(1)Rag1-25的结构组合式为：正义链(S₁₉+3U₂)，反义链(AS₁₉+3U₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(2)Rag1-26的结构组合式为：正义链(S₁₉+3NO₂)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

3.Rag1-27和Rag1-28是Rag1-20的变体，二者的正义链包含3'胞嘧啶错配和5'末端缺失，从而延伸了反义链的突出长度，正义链与反义链分别为20和21个核苷酸大小。

(1)Rag1-27的突出为2个尿嘧啶核苷酸。结构组合式为：正义链(S₁₈+3U₂)，反义链(AS₁₉+3U₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(2)Rag1-28的突出为2个两个天然核苷酸突出。结构组合式为：正义链(S₁₈+3NO₂)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

将这些变体saRNA(Rag1-21至Rag1-28)转染到Ku-7-luc2-GFP、UM-UC-3(膀胱移行细胞癌)、T24(膀胱癌)、J82(膀胱移行细胞癌)或Bel-7402细胞系中，72小时后评估基因表达。如图14A-E所示，所有双链体均能够不同程度地诱导p21表达，其中Rag1-21，Rag1-23和Rag1-26总体上优于其他变体。同时用CCK-8检测法分析转染细胞的细胞增殖能力，发现每一个变体saRNA对所有细胞均有不同的生长抑制作用；其中Rag1-26在Ku-7-luc2-GFP、UM-UC-3和T24细胞中表现最好(图15A-E)。这些数据揭示正义链3'末端胞嘧啶错配和天然突出结构的优势。

3.在Rag1-26的基础上，发明人设计了新的结构为Rag1-29至Rag1-44的变体(表1，图13)，这些变体含有以下序列及结构变化的不同组合：

单链长度变化：

i.长度为17至22核苷酸正义链；

ii.长度为20至22核苷酸的反义链；

双链体结构变化：

iii.双链体5’平端；

iv.双链体3’平端；

v.双链体错配；

突出特征的变化：

vi.反义链3’端1～3个核苷酸的突出；

vii.反义链5’端1～2个核苷酸的突出；

viii.正义链3’端2个核苷酸(天然核苷酸或者尿嘧啶核苷酸)的突出。

(1)Rag1-29通过去除反义链上的突出实现了双链体5’平端不对称性结构来确定反义链上突出(overhang)是否是p21基因诱导所必须的，结构组合式为：正义链(S₂₀+3NO₂)，反义链(AS₂₀)，双链体(B₅+MM_(3’1S:A,C))。

(2)Rag1-30是具有2个尿嘧啶核苷酸3'突出的截短的正义链，其中5'末端核苷酸被去除，导致在反义链上由天然核苷酸组成的3个核苷酸突出。结构组合式为：正义链(S₁₈+3U₂)，反义链(AS₁₈+3NO₃)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(3)Rag1-31与Rag1-30相似，但是通过除去正义链上的突出来形成平端不对称结构。结构组合式为：正义链(S₁₈)，反义链(AS₁₈+3NO₃)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(4)Rag1-32与Rag1-29相似的，但反义链3’端使用天然突出替换为2个尿嘧啶核苷酸突出。结构组合式为：正义链(S₂₀+3NO₂)，反义链(AS₂₀+3NO₂)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(5)Rag1-33与Rag1-32相似；然而，正义链中将错配的胞嘧啶核苷酸替换成鸟苷酸以测试“摆动”(wobble)碱基配对对活性的影响。结构组合式为：正义链(S₂₀+3NO₂)，反义链(AS₂₀+3NO₂)，双链体(MM_(3’1S:A,G))。

(6)Rag1-34与Rag1-32相似，但包括正义链中末端5'核苷酸的缺失。结构组合式为：正义链(S₁₉+3NO₂)，反义链(AS₁₉+3NO₃)，双链体(MM_(3’1S:A,C))。

(7)Rag1-35是Rag1-32的平端衍生物，其中正义链上的突出被去除。结构组合式为：正义链(S₂₀)，反义链(AS₂₀+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))。

(8)Rag1-36与Rag1-35类似，是删除正义链5'末端1个核苷酸，形成了平端不对称性结构。结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₃)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))。

(9)Rag1-37与Rag1-36相似，只有错配的胞嘧啶核苷酸从正义链上缺失，导致反义链5'末端的单核苷酸突出端。结构组合式为：正义链(S₁₈)，反义链(5NO₁+AS₁₈+3NO₃)，双链体(OH_AS5’)。

(10)Rag1-38是Rag1-27的非常规衍生物，其在反义链的5'末端包含双核苷酸错配延伸以匹配正义链上的3'突出，以及反义链上存在单核苷酸的3'突出。结构组合式为：正义链(S₁₈+3U₂)，反义链(5U₂+AS₁₈+3NO₁)，双链体(OH_AS5’+MM_(3’1S:A,C))。

(11)Rag1-39是Rag1-33的衍生物，其中正义链中的错配胞嘧啶被鸟苷替代，双链体长度缩短1个碱基对。结构组合式为：正义链(S₁₈+3NO₂)，反义链(AS₁₈+3NO₃)，双链体(MM_(3’1S:A,G))。

(12)Rag1-40是Rag1-26的衍生物，通过除去正义链上的突出而引入平端不对称。结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))。

(13)Rag1-41类似于Rag1-40，其中正义链中错配的胞嘧啶被鸟苷替代。结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,G))。

(14)Rag1-42也与Rag1-40相似，只有错配的核苷酸从正义链缺失，导致反义链5'末端的单核苷酸突出端。结构组合式为：正义链(S₁₈)，反义链(5NO₁+AS₁₈+3NO₂)，双链体(OH_AS5’)。

(15)Rag1-43也类似于Rag1-40，双链体长度缩短1个碱基对。结构组合式为：正义链(S₁₈)，反义链(AS₁₈+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))。

(16)Rag1-44类似于Rag1-37，双链体长度缩短1个碱基对。结构组合式为：正义链(S₁₇)，反义链(5NO₁+AS₁₈+3NO₃)，双链体(OH_AS5’)。

将上述双链体saRNA(Rag1-29至Rag1-44)分别转染Ku-7-luc2-GFP、UM-UC-3、T24、J82或PC3细胞系，72小时后评估基因表达。如图16A-E所示，Rag1-29和Rag1-38几乎完全丧失了在所有细胞系中诱导p21表达的能力。由于两个双链体在反义链上不具有至少2个核苷酸的突出端，所以这个特征对于p21基因诱导活性来说是必不可少的。相反，正义链上的3’突出端是完全可有可无的，因为Rag1-31、Rag1-35、Rag1-36、Rag1-40、Rag1-41和Rag1-43都保持强活性。另外，双链体的3’末端的核苷酸错配的存在对于最大化活性是重要的，因为与其他强活性saRNA相比，在正义链上的3'末端去除错配的核苷酸导致了Rag1-37、Rag1-42和Rag1-44激活p21的能力下降。正义链上用鸟苷取代胞苷与反义链上的尿苷形成G-U错配(如Rag1-39和Rag1-41)对saRNA的活性也有负面影响，但是在Rag1-33中没有这种影响，可能是其双链体的双链区域的长度(20个核苷酸，而Rag1-39和Rag1-40分别为18和19个核苷酸)赋予的正面影响抵消了G-U错配的负面影响。尽管如此，这进一步支持将胞嘧啶错配包括在其他核苷酸中以优化基因诱导活性的偏好。

采用CCK-8方法检测各细胞系的细胞活力(图17A-E)，结合基因诱导活性(图16A-E)综合分析发现，双链体Rag1-30、Rag1-32、Rag1-35和Rag1-40都具有最大的基因诱导活性和对癌细胞增殖的强烈抑制作用。值得一提的是，Rag1-35和Rag1-40虽然分别是Rag1-23和Rag1-26的变体，但由于均为含有平端的不对称结构，胞嘧啶错配和天然核苷酸突出，后者使双链体的反义链全长与预期靶位点实现100％互补，因而表现出显著改进的基因诱导与抑制肿瘤细胞生长的活性。

Rag1-36双链体为p21表达的强效激活剂，但在所有测试的细胞系中均失去了部分或全部细胞增殖抑制活性。这是所有受试的小激活RNA变体中唯一一个基因诱导活性与细胞增殖抑制活性不一致的双链体。这种独特的特性可能与Rag1-36的序列和/或结构特征有关，这种特征有可能用于只需要诱导目的基因表达而不过度抑制细胞生长的情形。

实施例9：结构特征组合的优化的验证

申请人设计和合成了靶向p21基因启动子的常规结构saRNA RAG-431-0、RAG-553-0、RAG-688-0和RAG-693-0及其各自的3种变体，其结构组合式如下(图18)：

RAG-431-1：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:U,C))

RAG-431-3：正义链(S₁₉+3T₂)，反义链(AS₁₉)，双链体(B5+MM_{(5’1AS:U,C)})

RAG-553-1：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:G,C))

RAG-553-3：正义链(S₁₉+3T₂)，反义链(AS₁₉)，双链体(B5+MM_{(5’1AS:U,C)})

RAG-688-1：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))

RAG-688-3：正义链(S₁₉+3T₂)，反义链(AS₁₉)，双链体(B5+MM_{(5’1AS:U,C)})

RAG-693-1：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:U,C))

RAG-693-3：正义链(S₁₉+3T₂)，反义链(AS₁₉)，双链体(B5+MM_{(5’1AS:U,C)})

转染RAG-431-0及其变体至Ku-7-luc2-GFP细胞中，RAG-431-0诱导p21表达9.37倍，其变体RAG-431-1和RAG-431-3分别诱导p21表达达18.35和12.26倍(图19)。

转染RAG-553-0及其变体至Ku-7-luc2-GFP细胞中，RAG-553-0诱导p21表达10.62倍，其变体RAG-553-1和RAG-553-3分别诱导p21表达达15.10和15.61倍(图19)。

转染RAG-688-0及其变体至Ku-7-luc2-GFP细胞中，RAG-688-0诱导p21表达14.03倍，其变体RAG-688-1和RAG-688-3分别诱导p21表达达18.28和6.36倍(图19)。

转染RAG-693-0及其变体至Ku-7-luc2-GFP细胞中，RAG-693-0诱导p21表达7.04倍，其变体RAG-693-1和RAG-693-3分别诱导p21表达达10.54和6.85倍(图19)。

申请人还设计和合成了靶向KLF4基因启动子的saRNA KLF4-0及其变体KLF4-1，其结构类似于Rag1-40，结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))(图20)。转染这些saRNA至PC3、Ku-7-luc2-GFP和Bel-7402细胞中，KLF4-0诱导KLF4表达分别为2.64、1.57和1.31倍，而KLF4-1变体诱导KLF4表达的活性均优于KLF4-0，在PC3、Ku-7-luc2-GFP和Bel-7402细胞中分别为3.42、1.77和1.43倍(图21A-C)。

申请人还设计和合成了靶向NKX3-1基因启动子的saRNA NKX3-1-0及其变体NKX3-1-1，NKX3-1-2,NKX3-1-3，这些变体的结构类似于Rag1-40。NKX3-1-1的结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))；NKX3-1-2的结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,G))；NKX3-1-3的结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,U))(图20)。转染这些saRNA至PC3和Bel-7402细胞中，NKX3-1-0诱导NKX3-1表达分别为2.7和1,67倍，变体NKX3-1-1，NKX3-1-2,NKX3-1-3诱导NKX3-1表达的活性均优于NKX3-1-0(图22A-B)。

申请人还设计和合成了靶向VEGFA基因启动子的saRNA VEGF-0及其变体VEGF-1,其结构类似于Rag1-40，结构组合式为：正义链(S₁₉)，反义链(AS₁₉+3NO₂)，双链体(B3+MM_(3’1S:A,C))(图20)。转染这些saRNA至HeLa，COS-1或ARPE-19细胞中，VEGF-0分别诱导VEGFA表达达1.22、1.11和1.51倍。而VEGF-0的变体VEGF-1诱导VEGFA表达的活性优于VEGF-0(图23A-C)。

综合上述分析结果可见类似于Rag1-40的saRNA结构设计在基因激活活性上均优于常规的saRNA设计，与特定序列无关；具体地，反义链的3’突出可以为天然核苷酸突出(如RAG-431-1、RAG-553-1、RAG-688-1、RAG-693-1、NKX3-1-1、NKX3-1-2和NKX3-1-3)，也可以为UU突出(如KLF4-1和VEGF-1)。突变的核苷酸可以为C(如RAG-431-1、RAG-431-3、RAG-688-1、RAG-688-3、RAG-693-1、NKX3-1-1、KLF4-1、VEGF-1)、A(RAG-553-1和RAG-553-3)、G(NKX3-1-2)和U(如NKX3-1-3)。

实施例10 p21 saRNA Rag1-40在小鼠体内抑制人皮下移植瘤的生长

saRNA制剂配制：saRNA递送系统采用in vivo-jetPEI(201-10G,Polyplus-transfection，法国),并根据生产商提供的配制方法进行制剂配制，过程简述如下：首先稀释saRNA于10％葡萄糖溶液中，得到溶液A；稀释所需量in vivo-jetPEI于10％葡萄糖溶液中，得到溶液B；然后等体积混合溶液A和溶液B(氮磷比为8，葡萄糖终浓度为5％)，混合均匀后室温静置15分钟备用。

取对数生长期的人肝细胞癌细胞株HepG2细胞,计数后,将细胞悬液调至每毫升3.5×10⁷个，以每只0.2mL接种于BALB/c裸鼠右腋皮下。肿瘤长至约200mm³，将荷瘤裸鼠随机分为2组：Vehicle(5％葡萄糖)组、RAG1-40给药组,每组7只，在第1、4、7、10天按saRNA1mg·kg-1瘤内注射。从第1次给药开始(第1天)，每3天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，按公式:V＝(L×W²)/2计算肿瘤体积,其中L表示瘤块最长直径；W表示与瘤块表面平行且垂直于长径的直径。记录给药期间肿瘤生长曲线及解剖后肿瘤大小与形态。

根据图24所示，在不同给药时间点，给药组的肿瘤生长缓慢，从给药的第7天开始，肿瘤出现缩小的趋势，体积明显小于作为对照的Vehicle组的肿瘤体积。在给药后的第10天，给药组的肿瘤体积与治疗开始时的体积比较增加12.8％，而Vehicle组的肿瘤体积增加了119.8％，两组的肿瘤体积变化有及其显著的差异(P<0.001)，说明能够激活p21基因表达的saRNA对体内肿瘤生长有明显的抑制作用。

通过引用并入

本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。

等效

本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。

Claims

1.一种小激活RNA，其中所述的小激活RNA由包含17至30个核苷酸的第一寡核苷酸链和包含17至30核苷酸的第二寡核苷酸链组成，所述第一寡核苷酸链中至少有15个核苷酸长度的序列与所述第二寡核苷酸链形成碱基互补，所述第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链与靶基因启动子上任一长度为15-30个核苷酸的连续片段存在75％以上的同源性或互补性，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成1-4个核苷酸的突出端。

2.如权利要求1所述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的双链体一端为平端，另一端可在第一寡核苷酸链或第二寡核苷酸链末端形成2-3个核苷酸的突出端。

3.如权利要求1或2所述的小激活RNA，其中所述突出端的核苷酸选自胸腺嘧啶、尿嘧啶或天然核苷酸。

4.如权利要求3所述的小激活RNA，其中突出端为dTdTdT、dTdT、UUU、UU或连续的2个或3个天然核苷酸。

5.如权利要求1至4中任一项所述的小激活RNA，其中所述第一或第二寡核苷酸链的5’端处于双链体平端，所述第一或第二寡核苷酸链中自5’端起的第1至第3个核苷酸与另一条链对应位置的核苷酸存在1-3个碱基的错配。

6.如权利要求5所述的小激活RNA，其中所述错配的碱基为胞嘧啶。

7.如权利要求1至6中任一项所述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的不包含突出端的双链体长度为17至24个核苷酸。

8.如权利要求7所述的小激活RNA，其中第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链形成的不包含突出端的双链体长度为18-20个核苷酸。

9.如权利要求1至8任一项所述的小激活RNA在制备用于激活或上调靶基因在细胞中表达的制剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述的小激活RNA被直接导入所述细胞中。

11.如权利要求10所述的应用，其中所述的细胞是哺乳动物细胞，优选为人类细胞。

12.如权利要求11所述的应用，其中所述的细胞存在于人体中。

13.如权利要求12所述的应用，其中所述的人体是患有由靶基因表达缺陷和/或不足引发的疾病病患，并且所述小激活核酸分子被施用以有效量以实现对疾病的治疗。

14.如权利要求1至8任一项所述的小激活RNA，其中所述的靶基因选自人p21基因、KLF4基因、NKX3-1基因、VEGFA基因。

15.如权利要求14所述的小激活RNA，其中所述小激活RNA激活或上调p21基因表达至少为10％。

16.一种组合物,其包含权利要求14或15所述的小激活RNA和药学上可接受的载体。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体为脂质体、高分子聚合物或多肽。

18.如权利要求14或15所述的小激活RNA或16或17所述的组合物在在制备用于激活或上调靶基因表达的药物中的应用，优选为在制备抗肿瘤或良性增殖性病变药物中的应用；更优选地，所述肿瘤选自膀胱癌、前列腺癌、肝癌、结直肠癌。