PL237080B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego przeznaczona do selektywnego wzmacniania syntezy białek - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego przeznaczona do selektywnego wzmacniania syntezy białek, znajdująca zastosowanie w następujących dziedzinach: biotechnologia, biochemia, biofizyka, chemia, fizyka, diagnostyka i medycyna, szczególnie medycyna molekularna i terapia genowa wykorzystująca preparaty medyczne zawierające kwasy nukleinowe, wprowadzane do komórek żywego ciała w celu selektywnego wzmocnienia syntezy białek.

Opis stanu techniki.

Kontrola translacji, jawiąc się jako ważny cel nowych terapeutyków, odbywa się na poziomie post-transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów, gdzie stanowi istotny mechanizm decydujący o wydajności syntezy białek (Mathews et al. 2007).

Translacja jest procesem syntezy białek przebiegającym na matrycy informacyjnego RNA (mRNA), zawierającym zwykle trzy główne obszary: nieulegający translacji region 5' (ang.: UnTranslated Region - 5'UTR), sekwencję kodującą (CDS) oraz nieulegający translacji region 3' (ang.: 3' UnTranslated Region - 3'UTR) (patrz Rys. - 1.). Nieulegający translacji region 5' (5'UTR), znany również jako sekwencja liderowa mRNA, może zawierać: miejsce wiązania rybosomy w tym sekwencję Shine Dalgarno, sekwencję liderową białka rybosomalnego, wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (ang.: internal ribosome entry site - IRES), i wiele regulacyjnych regionów (elementów cis) wiążących między innymi wszystkie wymagane czynniki inicjacji translacji (w tym np.: eukariotyczne: elF4A, elF4B elF4E, elF4F, elF4G) (Mathews et al. 2007).

Ostateczna ilość białka komórkowego zależy od jego stabilności (zależnej od ubikwityny) jak również wydajności translacji, kontrolowanej przez kilka parametrów takich jak: a) szybkość syntezy, b) dostępność rybosomów, c) zależna od fosforylacji aktywność białek zaangażowanych w proces translacji, jak również d) poziom mRNA, określany szybkością transkrypcji i degradacji transkryptu w cytoplazmie (Van Der Kelen et al. 2009, Kasinath et al. 2009).

Poznanie kontroli translacji wymaga określenia czynników wpływających na szybkość syntezy białek w fazie inicjacji, elongacji i terminacji. Ponieważ inicjacja limituje szybkość syntezy białek (Lodish et al, 1971, Myasnikov AG et al., 2009), stąd głównym czynnikiem regulującym jej wydajność jest liczba zdarzeń inicjacji translacji w jednostce czasu. Procesy te kontrolują z kolei regulacyjne sekwencje cis pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowych struktur UTR w tym: sekwencja konsensusowa Kozk, alternatywne ramki odczytu (uORFs), rybo przełączniki, wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (IRES), element wrażliwy na żelazo (IRE) i selenocysteinowa sekwencja insercyjna (SECIS element) (Abbott and Proud 2004), które rozpoznawane są przez czynniki trans takie jak białka wiążące się do mRNA, metabolity, czynniki translacyjne np. elF4E, enzymy edytujące mRNA, mikro RNA (miRNA) jak również czynniki trans wiążące się do sekwencji IRES takie jak białkowe ITAF (Graff and Zimmer, 2003, Chatterjee and Pal, 2009).

Coraz większa ilość danych wskazuje również na metabolity (np. Glukozę) jako wydajne stymulatory sekwencji cis 5'UTR, zdolne do wzmocnienia translacji, jak to opisano na przykładzie alternatywnych form różnicowego składania transkryptu pierwotnego (wariantów splicingowych) proinsuliny (Shalev et al. 2002, Minn et al. 2005, Greenman et al. 2007).

Wynika stąd, że brak liniowej korelacji między mRNA i białkiem może wynikać ze wzmacniających lub osłabiających wpływów sekwencji cis lub czynników trans na alternatywne mechanizmy translacji, która może być inicjowana w sposób zależny od czapeczki 5'-7mG lub w sposób niezależny od czapeczki (zależny od IRES). Większość ludzkich cząsteczek RNA ulega translacji inicjowanej w sposób zależny od czapeczki (Preiss and Hentze 2003, Sonenberg and Dever 2003).

Alternatywny mechanizm inicjacji translacji niezależnie od 5'-m7G (zależny od IRES) włączany jest w pewnych fazach cyklu komórkowego takich jak mitoza (Pyronnet et al., 2001) i stan zintegrowanej odpowiedzi komórkowej na stres (ISR) wywołany czokiem cieplnym, infekcją wirusową, niedoborem surowicy lub aminokwasów jak również niedotlenieniem, obserwowanym także w guzach litych (Jang et. al. 1988, Macejak and Sarnow 1991, Clemens 2001). Syntezie białek zależnej od sekwencji IRES może towarzyszyć reinicjacja translacji z alternatywnych ramek odczytu (uORFs), prowadząca do syntezy aktywnych izoform białkowych jak również nieaktywnych, dominujących mutantów negatywnych (Cornelis et al. 2000, Tinton et al. 2005).

Wykazano ostanio, że osłabiona translacja z wewnętrznego miejsca wiązania rybosomu (IRES) syntazy pseudourydynowej (DKC1) zakłóca proces modyfikacji rRNA jak również transkryptu telomerazy, prowadząc do zwiększenia ryzyka wystąpienia raka (Yoon et al., 2006).

PL 237 080 B1

Z drugiej strony, mutacja (C2756T) sekwencji IRES w regionie 5'UTR transkryptu c-Myc (Paulin et al. 1996) prowadzi do zwiększonego wiązania czynników translacyjnych (Paulin et al, 1998) a w konsekwencji do wzmocnienia syntezy alternatywnej izoformy p64 (c-Myc-2) na drodze inicjacji translacji niezależnej od czapeczki, wskazując jednocześnie na nowy mechanizm kancerogenezy (Chappell et al., 2000) (patrz Rys. - 2.). Stephen i współpracownicy wykazali, że mutacja C2756T występuje w 42% przypadkach próbek szpiku kości, pobranych od pacjentów ze szpiczakiem mnogim (ang.: MM-multiple myeloma), której jednak nie stwierdzono w żadnej z 21 kontroli, co wskazuje na silną korelację między tą mutacją a chorobą (Stephen et al., 2000).

W niektórych rodzinnych przypadkach czerniaków złośliwych zaobserwowano mutację typu substytucja w rejonie 5'UTR genu CDKN2A, która powoduje powstanie nowego kodonu start AUG (uORF), hamującego translację prawidłowego białka a w konsekwencji zaburzenie punktu kontroli G1 cyklu komórkowego (Liu et al., 1999).

Te i wiele innych odkryć, wskazując na związek między chorobami a mutacjami/polimorfizmami pojedynczych nukleotydów (SNP), mogą ułatwić opracowanie nowej, kompleksowej terapii opartej o: 1) dobrze znaną, allelo-specyficzną technologię wyciszania zmutowanej kopii genu (Ohnishi et al. 2008), której towarzyszyć będzie 2) technologia wzmacniania syntezy białek z prawidłowego (nie zawierającego mutacji/SNP) allela, stosując opisaną w niniejszym wynalazku cząsteczkę kwasu nukleinowego (patrz Rys. - 2.). Połączenie wyciszającej i wzmacniającej cząsteczki jednocześnie wydaje się być najbardziej efektywną drogą zwalczania schorzeń genetycznych, zwłaszcza tych heterozygotycznych, umożliwiając selektywne zróżnicowanie poziomu ekspresji między dzikimi (niezmutowanymi) i zmutowanymi allelami w aplikacjach medycznych i biotechnologicznych.

W rzeczywistości, kontrola translacji białek może odbywać się również jako wynik aktywności enzymów edytujących RNA, które działają wykorzystując dwa różne mechanizmy: edycję substytucyjną oraz inercyjno-delecyjną. Deaminaza cytydynowa zamienia nukleotyd C w sekwencji RNA na Uracyl, powodując utworzenie alternatywnych kodonów np.: przez konwersję kodonu CAA do kodonu stop: UAA, co decyduje o powstaniu białek o różnej długości. Działanie deaminazy cytydynowej jest niezbędne między innymi w hamowaniu infekcji wirusowych, różnicowaniu przeciwciał oraz powstawaniu różnych izoform białkowych takich jak apolipoproteina B-48 i B-100, syntetyzowanych z jednego transkryptu. Niekontrolowana jednak aktywność enzymów edytujących RNA prowadzić może do powstania białkowych dominantów negatywnych, źle sfałdowanych lub nawet niekompletnych peptydów lub zmian w sekwencji supresorów, które prowadzić mogą do kancerogenezy (Mukhopadhyay et al. 2002, Albesiano et al. 2003, Dorsett et al. 2008).

Około 90% komórkowych mRNA opatrzonych jest krótkimi (10-200 nukleotydowymi) sekwencjami 5'UTR, które w obecności czynnika translacyjnego elF4F ulegają wydajnej, zależnej od czapeczki 5' translacji (Pelletier and Sonenberg, 1985). W przypadku jednak pozostałej, niewielkiej frakcji cząsteczek mRNA posiadających długie i mocno ustrukturyzowane sekwencje 5'UTR, często z licznymi alternatywnymi ramkami odczytu (uORFs), poziom syntezy białek jest niewielki, chyba że cząsteczki te opatrzone są dodatkowo sekwencjami IRES, umożliwiającymi alternatywną, niezależną od czapeczki 5' syntezę białek (Willis 1999, Mamane et al. 2004).

Co więcej, podniesiona ekspresja czynnika translacyjnego elF4E, w sposób nieproporcjonalny, selektywnie i mocno podnosi wydajność syntezy białek z cząsteczek RNA zawierających wspomniane powyżej, mocno ustrukturyzowane sekwencje 5'UTR, obecne np. w transkryptach c-Myc i cykliny D1 (Koromilas et al. 1992).

Ponadto, wykazano korelację między wysokim poziomem stosunku elF4E/elF4F a progresją złośliwego fenotypu wielu nowotworów, co zaobserwowano między innymi w agresywnych rakach tarczycy, ale nie stwierdzono w przypadku łagodnego raka brodawkowatego tarczycy (Wang et al. 2001). Tak więc, obniżenie poziomu elF4E lub wzmocnienie syntezy elF4F mogłoby przywrócić właściwy stosunek tych czynników translacyjnych a przez to wpłynąć na wiele szlaków sygnałowych i cały proteom komórki.

Wykazano również, że poziom translacji syntetazy tymidylowej (TS), docelowego enzymu działania środka przeciwnowotworowego 5-fluorouracylu, której transkrypt w sekwencji 5'UTR zawiera trzy tandemowe powtórzenia typu STR, był czterokrotnie wyższy w rakach jelita grubego w porównaniu do translacji z transkryptów TS zawierających jedynie dwa powtórzenia STR (Kawakami et al. 2001). Zaobserwowane zjawisko wzmocnienia translacji TS, któremu dodatkowo nie towarzyszyła zmiana poziomu transkrypcji, wyjaśniono destabilizacją hamującej, ll-rzędowej struktury szpilki do włosów w trój-tandemowym wariancie sekwencji UTR (Kawakami et al., 2001), co wskazuje na ogromny po

PL 237 080 B1 tencjał regulacyjny sekwencji UTR na poziomie kontroli translacji. Potencjał ten został wykorzystany w niniejszym wynalazku do określenia podstawowych cech oligonukleotydów polinukleotydów oraz innych cząsteczek kwasu nukleinowego, koniecznych do wzmocnienia syntezy białek.

Technologie wyciszania ekspresji genów z zastosowaniem a) mikro RNA (miRNA, ang.: micro RNA), b) małych harpinowych RNA (shRNA, ang.: small hairpin RNA) jak również c) małych hamujących RNA nazywanych również krótkimi interferującymi RNA (siRNA, ang.: small inhibitory RNA określanych także jako short interfering RNA), należą do najbardziej znanych metod indukcji zjawiska zwanego interferencją RNA (RNAi), w którym czynniki trans takie jak krótkie aktywne kwasy nukleinowe (miRNA, shRNA, siRNA) prowadzą zwykle do obniżenia syntezy białek na post-transkrypcyjnym i pre-translacyjnym poziomie (Mathews et al. 2007).

miRNA to małe, endogenne, komórkowe cząsteczki RNA (~23n), wykazujące szereg podobieństw z opisaną w niniejszym wynalazku cząsteczką kwasu nukleinowego, która jednak w przeciwieństwie do naturalnie występujących miRNA jest zwykle 1) egzogenna, 2) sztuczna, 3) opracowana w celu wiązania się do regulatorowych elementów cis, tak by 4) selektywnie wzmacniać syntezę białek genu, allela lub jego fragmentu, co dotychczas nie było dostępne. Endogenne komórkowe miRNA 1) powstają z pierwotnych transkryptów genów pre-miRNA, a ich działanie opisuje się najczęściej jako nieselektywne, zależne od miRNA hamowanie inicjacji i elongacji translacji. Powszechnie uważa się, że wspomniane hamowanie syntezy białek jest następstwem wiązania się częściowo homologicznych cząsteczek miRNA do sekwencji 3'UTR genów docelowych (Nilsen 2007). Nieselektywne działanie cząsteczek miRNA wynikać może z 1) niepełnej homologii sekwencyjnej między miRNA a docelową cząsteczką matrycowego RNA, 2) wiązania się do co najmniej kilku mRNA w komórce, co wynikać może między innymi ze 3) słabych oddziaływań G:U zwiększających poziom komplementarności względem dowolnej cząsteczki RNA. Ludzki genom może kodować ok. 1000 cząsteczek miRNA (Bentwich et al. 2005) powszechnych w wielu typach komórek, które w przypadku ssaków mogą wiązać się z ok. 60% różnych genów (Friedman et al. 2009).

Tak więc jedna cząsteczka miRNA zwykle działa na więcej niż jedną cząsteczkę mRNA, a więc może wpływać na hamowanie różnych grup mRNA. Efekt cząsteczki miRNA, jako występującego naturalnie czynnika trans nie jest specyficzny i ani selektywny względem pojedynczego transkryptu, co można jednak uzyskać przez syntezę sztucznej, podobnej do miRNA cząsteczki kwasu nukleinowego (opisanej w niniejszym wynalazku), która w przeciwieństwie do miRNA mogłaby zwiększać wydajność translacji. Obecnie, miRNA-zależne technologie regulacji ekspresji genów związane są głównie z wyciszaniem genów (nie wzmacnianiem). Cząsteczki miRNA, stosowane najczęściej na sekwencje 3'UTR, pozyskiwane są zwykle na drodze izolacji lub syntezy zaprojektowanych uprzednio sekwencji, w oparciu o bazy danych naturalnie występujących cząsteczek miRNA , dostarczanych następnie do komórek jako cząsteczki syntetyczne lub alternatywnie jako część wektorowych systemów ekspresji miRNA.

Wykazano, że wiele cząsteczek miRNA zaangażowanych w regulację wzrostu komórek i proliferację działa jak supresor nowotworów lub onkogen (Esquela-Kersher i Slack 2006), co również możliwości wykorzystania eRNA jako selektywnego wzmacniacza syntezy białek.

W porównaniu do siRNA- (małych hamujących RNA), ang.: small inhibitory RNA) zależnej degradacji mRNA w ciałkach-P, prowadzącej do odczepienia czapeczki i zniszczenia mRNA, zjawisku zależnego od miRNA hamowania translacji towarzyszy jedynie niewielka degradacja cząsteczek mRNA, które również mogą być przechowywane w ciałkach-P (Kedersha et al. 2005, Brengues et al. 2005). Filipowicz i wspołracownicy wykazali, że ciałka-P to rezerwuar translacyjnie nieaktywnych cząsteczek mRNA, gromadzonych w celu ponownego ich wykorzystania w procesie recyklingu w translacji (Pillai et al. 2005, Eulalio et al. 2007).

Występujące w naturze lub sztuczne shRNA (krótkie harpinowe RNA, ang.: short hairpin RNA) jak również wspomniane wcześniej cząsteczki siRNA stanowią element ewolucyjnie konserwatywnej, komórkowej odpowiedzi obronnej, wywoływanej przez wprowadzane z zewnątrz dwuniciowe cząsteczki RNA (dsRNA, np. wirusowe dsRNA), które wewnątrz komórek rozcinane są zwykle na małe, interferujące, dwuniciowe cząsteczki RNA, wykazujące aktywność siRNA. Te dwuniciowe RNA (19-23 nukleotydowe dupleksy kwasów nukleinowych z niemal całkowitą komplementarnością względem docelowych cząsteczek RNA) mogą selektywnie oddziaływać z dowolnie wybranym miejscem pojedynczego transkryptu uruchamiając mechanizm jego niszczenia przez cięcie (Tijsterman et al 2002 Sanchez et al. 2006). Cząsteczki siRNA charakteryzują się niemal idealną komplementarnością względem matrycowego RNA (mRNA) i zbudowane są z sensownej i antysensownej nici kwasu nukle

PL 237 080 B1 inowego, której używają w procesie degradacji docelowego RNA (zwłaszcza centralnego jej regionu) prowadzącej do zahamowania translacji białek (cząsteczka miRNA zawiera mały, niekomplementarny fragment sekwencji w zakresie centralnej części tej cząsteczki, co skutkuje jedynie częściową represją mRNA. Podobnie jak w przypadku miRNA, obecnie stosowane, zależne od siRNA technologie regulacji ekspresji genów odnoszą się jedynie do wyciszania genów (nie wzmacniania), gdzie zwykle cząsteczki siRNA projektowane są na dowolny region sekwencji kodującej (CDS), dostarczane następnie do komórek jako cząsteczki syntetyczne lub część wektorowych systemów ekspresji siRNA. W celu zahamowania syntezy białek stosuje się również inne technologie wykorzystujące krótkie antysensowne cząsteczki kwasów nukleinowych (z pełną komplementarnością), niemniej jednak nie są one tak efektywne jak wcześniej opisana technologia siRNA (patrz Tabela 1.).

W przeciwieństwie do opisanych hamujących czynników trans, niewiele wiadomo na temat mechanizmu wzmacniania translacji, genetycznych metod zwiększania wydajności syntezy białek i selektywnych cząsteczek kwasów nukleinowych wzmacniających pojedynczy gen. Takie specyficzne oddziaływanie byłoby bardzo pomocne w biotechnologii jak również medycynie molekularnej, zwłaszcza w przypadku konieczności podniesienia ekspresji wybranych genów zaangażowanych w cykl komórkowy, apoptozę, różnicowanie, wzrost i proliferację, w fizjologicznych jak również patologicznych warunkach. Jak dotąd nie opracowano jednak technicznych ani przemysłowych rozwiązań umożliwiających selektywne wzmocnienie syntezy białek na poziomie translacji takich genów jak: TP53, BAX, CDKN2A, CDK4, RB1, NOD2, CHEK2, INBS1, MC1R, MSH2, MLH1, MSH6, BRCA1, BRCA2, APC, INS, GH1, IFNA1 TERT, COL1A1 i wielu innych wykazujących cechy supresorów i mutatorów lub genów, których ekspresja jest zbyt niska, zwłaszcza w warunkach patologicznych. Nie opracowano również selektywnych czynników trans, które można byłoby zastosować w pewnych technologiach wykorzystywanych np. w biologii medycznej i w produkcji biofarmaceutyków, gdzie specyficzność i wysoka wydajność syntezy białek stanowią najważniejsze parametry decydujące o przewadze konkurencyjnej danej biotechnologii na rynku.

Przeglądając aktualną wiedzę na temat możliwości wzmacniania translacji natrafić można na informację, że niektóre miRNA (rozumiane tradycyjnie jako inhibitory translacji), wiążąc się do sekwencji 3'UTR nieoczekiwanie mogą także podnosić syntezę białek (Vasudevan 2007). Poznano również nową klasę sekwencji docelowych dla miRNA (nazwanych miBridges), zawierających podobne miejsca interakcji w regionie 5'UTR i 3'UTR, występujące w obrębie jednej cząsteczki RNA, co wskazuje, że ta sama cząsteczka miRNA może wiązać się nie tylko do 3'UTR (jak uważano wcześniej) ale także do 5'UTR (Lee et al 2009). Co więcej, specyficzna dla wątroby cząsteczka miRNA-122, która wiążąc się do sekwencji 3'UTR zwykle pośredniczy w post-transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów przez nieselektywne hamowanie translacji docelowych mRNA, może także stymulować translację wirusa HCV przez bezpośrednie oddziaływanie tej cząsteczki miRNA-122 z dwoma docelowymi miejscami w sekwencji 5'UTR genomu HCV (Henke et al 2008). Chociaż pojedyncza cząsteczka miRNA wiąże się zwykle do wielu docelowych cząsteczek mRNA, wykazując tym samym niską selektywność, badania powyżej przedstawione wykazały, że występująca w naturze cząsteczka miRNA-122, oddziałując z sekwencjami cis regionu 5'UTR, może wbrew oczekiwanym efektom wzmocnić wydajność translacji, co dla wirusa HCV jest niezbędne do utrzymania translacji i procesu zakażania. Wykazano również, że występująca w naturze cząsteczka miRNA oznaczona jako mir-10a oddziałuje z regionem 5'UTR cząsteczek mRNA kodujących białka rybosomalne, czego wynikiem jest wzmocnienie translacji tych białek (0rom et al. 2008). Co więcej, najnowsze badania wskazują na odkrycie nowego zjawiska - aktywacji RNA (RNAa) jako mechanizmu zależnej od promotora aktywacji transkrypcji uruchamianej przez nową klasę interferujących RNA nazwanych saRNA (ang.: small activating RNAs) (Huang et al. 2010). Zjawisko RNAa prowadzi do podniesienia ekspresji genów na poziomie transkryptomu, co potwierdzono jak dotąd dla różnych typów komórek ssaków (Li et al. 2006). Pomimo wymienionych powyżej odkryć, nie opisano dotąd cząsteczki umożliwiających specyficzne i selektywne wzmocnienie syntezy białek wybranych genów, lub ich fragmentów przez wzmocnienie wydajności translacji, co można osiągnąć stosując opisane w niniejszym wynalazku sztuczne i podobne do naturalnych kwasy nukleinowe, zaprojektowane na podstawie wybranych sekwencji, zwłaszcza matrycowych RNA i wykazujących co najmniej jedną z wymienionych właściwości: 1) aktywność czynnika trans, 2) zdolność do indukcji zjawiska interferencji RNA (RNAi) prowadzącego do wzmocnienia wydajności translacji, 3) zdolności do uruchamiania mechanizmu prowadzącego do odcinania regionów regulatorowych (np. odcięcia mocno sfałdowanych fragmentów 5'UTR z udziałem RNazy H), jak również 4) możliwości zmiany termodynamicznych parametrów docelowych cząsteczek RNA.

PL 237 080 B1

Jednym z najważniejszych parametrów regionów regulatorowych mRNA (włączając w to sekwencje 5'UTR) jest wynikająca z sekwencji nukleotydów energia swobodna, która określa drugorzędową i trzeciorzędową strukturę pofałdowania tych regionów (Batey et al. 1999).

W przypadku wielu genów, proces różnicowego składania transkryptu pierwotnego (alternatywnego splicingu pre-mRNA) prowadzi do powstania kilku alternatywnych wariantów transkrypcyjnych, które w zależności od posiadanej sekwencji nukleotydowej, struktury drugorzędowej i regulatorowych elementów cis, mogą podlegać odmiennej i niezależnej regulacji, co w konsekwencji prowadzi do różnej, zależnej od wariantu ekspresji pojedynczego genu. Przykładem takiego genu może być pro insulina (Shalev 2002) lub gen SP-A1, gdzie wykazano, że każdy z czterech analizowanych wariantów 5'UTR wykazywał odmienny wpływ na syntezę markerowego białka reporterowego (Wang 2005).

Biorąc pod uwagę długość sekwencji UTR, obliczono że 90% komórkowych cząsteczek RNA opatrzonych jest krótkimi (10-200n) regionami 5'UTR. Takie mRNA ulegają wydajnej, zależnej od czapeczki 5' translacji, która wymaga obecności wielobiałkowego kompleksu elF4F zawierającego czynniki inicjacji translacji eukariotycznej takie jak EIF4A, EIF4G, EIF4E (Pelletier and Sonenberg 1985).

Niewielka część komórkowego transkryptomu obejmuje cząsteczki RNA opatrzone mocno ustrukturyzowanymi regionami 5'UTR, zawierającymi często liczne alternatywne ramki odczytu (uORFs). Takie RNA ulegają translacji jedynie w niewielkim stopniu, chyba że zawierają wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów (IRES) czemu dodatkowo towarzyszyć muszą warunki sprzyjające translacji zależnej od IRES (niezależnej od czapeczki) (Willis 1999, Stoneley et al. 2004).

Większość transkryptów genów lub ich fragmentów opatrzonych jest krótkimi (10-200 nukleotydowe) słabo pofałdowanymi sekwencjami 5'UTR, które zwykle czynią je mniej podatnymi na występującą w naturze regulację ekspresji na poziomie translacji. Sekwencje tych 5'UTR charakteryzuje: a) niewielka, bliska zeru energia swobodna Gibbs’a (Δ G >0), b) stan równowagi, który nie ma wpływu ani na tworzenie ani rozpad struktur drugorzędowych, c) większa szybkość translacji, d) ilościowo wyższy poziom określonych białek, e) dłuższy okres półtrwania, ale krótszy czas zajęcia rybosomu wynikający z zależności między translacją i degradacją, f) większa liczba transkryptów, g) zdolność do wydajnej translacji zależnej od czapeczki 7mG w normalnym stężeniu czynnika translacyjnego eiF4F, jak również h) zależna od sekwencji IRES zdolność do podnoszenia poziomu białka na drodze translacji niezależnej od czapeczki, zwykle w specyficznych warunkach takich jak: szok cieplny, podział komórki, stres komórkowy lub stres oksydacyjny obserwowany między innymi w guzach litych (Pelletier and Sonenberg 1985, Mathews et al. 2007).

Transkrypty zawierające długie (>200 nukleotydów, zwykle 500-1500n), mocno pofałdowane sekwencje 5'UTR stanowią ok. 10% naturalnie występujących cząsteczek matrycowego RNA, regulowanych głównie na poziomie translacji. Ten rodzaj regionów 5'UTR obfituje w sekwencje GC, utrudniając tym samym ich eksperymentalne wykrywanie. Długie nieulegające translacji regiony 5' stwierdzono między innymi w większości genów zależnych od cyklu komórkowego, których ustrukturyzowane formy 5'UTR stanowią dodatkowy mechanizm kontroli translacji, zapobiegając tym samym nadmiernej ekspresji genu. Pofałdowane sekwencje 5'UTR charakteryzuje a) mocno ujemna energia swobodna Gibbs'a (ΔG<<0), b) samorzutne tworzenie struktur drugorzędowych, c) niewielka szybkość translacji, d) niska lub niewykrywalna wydajność translacji, e) krótszy okres półtrwania ale dłuższy czas zajęcia rybosomu, f) mniejsza liczba transkryptów, g) duża liczba niecharakterystycznych otwartych ramek odczytu (uORFs) położonych w kierunku 5' od właściwego kodonu start, h) zdolność do wydajnej translacji zależnej od czapeczki 7mG w środowisku wysokiego stężenia czynnika translacyjnego eiF4E, któremu towarzyszy jednocześnie niski stosunek stężeń eiF4F/eiF4E, jak również i) zależna od obecności sekwencji IRES zdolność do podnoszenia poziomu syntezy białka na drodze translacji niezależnej od czapeczki, obserwowana zwykle w następstwie: szoku cieplnego, w trakcie podziału komórki, stresu komórkowego lub w guzach litych, jako efekt działania stresu oksydacyjnego. (Pelletier and Sonenberg 1985, Mathews et al. 2007).

Wartą podkreślenia jest obserwacja, że zwiększony poziom czynnika translacyjnego elF4E, w sposób selektywny i nieproporcjonalnie mocniej podnosi wydajność translacji cząsteczek mRNA opatrzonych długimi i mocno ustrukturyzowanymi sekewncjami 5'UTR w porównaniu do krótkich, niesfałdowanych wariantów transkrypcyjnych (Koromilas et al. 1992).

Wykazano również, że w trakcie skanowania transkryptów, czynnik elF4E/F bierze udział w związanym ze złośliwością raka procesie prezentacji i lokalizacji alternatywnych ramek odczytu (uORFs) (Carter et al. 1999, Benedetti and Graff 2004).

PL 237 080 B1

Co więcej, zaobserwowano korelację między a) 3-10 krotnie podniesionym poziomem czynnika elF4E, oznaczonym dla wielu raków i b) progresją nowotworową w kierunku złośliwego fenotypu (Kerekatte et al. 1995, Wang et al. 2001). Przedstawione powyżej dane prowadzić mogą do postawienia hipotezy, że długie, mocno ustrukturyzowane sekwencje UTR cząsteczek matrycowego RNA mogą stanowić pulę nieaktywnych translacyjnie transkryptów, rekrutowanych do syntezy białek jedynie w określonych warunkach, alternatywnie 1) na drodze translacji zależnej od sekwencji IRES, aktywowanej np. w niektórych typach tkanek lub w specjalnych warunkach takich jak niedotlenienie, obserwowane często w komórkach rdzenia guzów litych lub 2) na drodze translacji zależnej od czapeczki 5', aktywowanej np. w niektórych komórkach przerzutowych, zwłaszcza tych w których dochodzi do nadmiernej ekspresji czynnika elF4E.

Tak więc pule nieaktywnych lub mało aktywnych translacyjnie transkryptów, opatrzonych zwykle sekwencjami o wysokim potencjale regulatorowym obecnym także w elementach cis krótkich nieustrukturyzowanych regionów regulatorowych, mogą być selektywnie rekrutowane i aktywowane przez interferujące cząsteczki eRNA niniejszego wynalazku. Opisana zdolność regulującej cząsteczki kwasu nukleinowego (nazwanej w skrócie eRNA) do wykorzystania dostępnego potencjału regulatorowego regulowanej cząsteczki matrycowego RNA umożliwia osiągnięcie efektu selektywnego wzmocnienia syntezy białek.

Streszczenie wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest oligonukleotyd, polinukleotyd i cząsteczka kwasu nukleinowego, nazwane w skrócie „eRNA, zgodnie z jego zdolnością do wzmacniania (ang. enhancing) syntezy białek i przez analogię do opisanych powyżej cząsteczek siRNA (ang. small inhibitory RNA).

Ta mała wzmacniająca cząsteczka RNA należy do chemicznie i strukturalnie zróżnicowanej grupy związków syntetyzowanych i/lub izolowanych jako a) cząsteczki sztuczne (nie występujące w naturze) i/lub b) podobne do naturalnych, które w przeciwieństwie do cząsteczek siRNA, miRNA, antysensów i innych pochodnych kwasów nukleinowych (znanych jako cząsteczki hamujące) mogą selektywnie wzmacniać syntezę białek i wydajność translacji, co było dotąd niemożliwe i stanowi ważną przewagę technologiczną tego wynalazku.

Co najmniej jeden z wymienionych poniżej sposobów opisuje działanie cząsteczki eRNA, która jako czynnik trans może wpływać na syntezę białek przez: a) selektywne wiązanie się do elementów cis i w konsekwencji zmieniać fizyko-chemiczne właściwości docelowych cząsteczek, umożliwiając w ten sposób zwiększenie poziomu syntezy białek, b) uruchamiać zjawisko interferencji RNA (RNAi) i/lub aktywacji RNA (RNAa), tu prowadzące do wzmocnienia syntezy białek przez aktywację enzymatycznej maszynerii post-transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów, c) umożliwiać odcięcie hamujących regionów sekwencji regulatorowych docelowej cząsteczki RNA, włączając w to możliwe zaangażowanie RNazy H w odcinanie fragmentów 5'UTR, d) umożliwiając wiązanie innych czynników trans, naturalnie występujących komórkowych kwasów nukleinowych, białek regulacyjnych i/lub metabolitów, e) zmieniając zależne od energii Gibbs'a tworzenie struktur drugorzędowych (AG = AH - TAS, dG = VdP - SdT) docelowych miejsc mRNA, co ma wpływ na właściwości translacyjne docelowych transkryptów, prowadząc do wzmocnienia syntezy białek.

Projekt cząsteczki eRNA oparty jest o strukturę i charakterystyczne cechy opisane w rysunkach, tabelach i zastrzeżeniach tego wynalazku, gdzie preferencyjnie projektowanie ma na celu a) linearyzację struktury docelowego regionu regulatorowego 5'UTR i/lub b) zwiększenie stopnia pofałdowania sekwencji 3'UTR i/lub, c) uwolnienie regulatorowej sekwencji ułatwiającej translację przez związanie eRNA z dystalnymi elementami cis blokującymi tą sekwencję, i/lub d) zablokowanie sekwencji utrudniających translację przez związanie eRNA z tymi sekwencjami i/lub e) uwolnienie domen funkcjonalnych takich jak sekwencje IRES oraz innych domen istotnych dla sprawnej syntezy białek.

Wspomniana powyżej selektywność cząsteczki eRNA oznacza bezpośredni efekt wzmocnienia syntezy wybranego, pojedynczego białka, któremu towarzyszyć może co najwyżej 20% wzmocnienia innego białka, którego sekwencja ma co najwyżej 80% zgodności z aktywnym fragmentem cząsteczki eRNA.

Aktywny fragment cząsteczki eRNA to część sekwencji eRNA bezpośrednio wiążącej się do cząsteczki docelowej z co najmniej 90% homologią sekwencji w jednym ciągu co naj mniej 6-nukleotydów.

Cząsteczka eRNA zawiera co najmniej jeden fragment aktywny, której może towarzyszyć jedna lub większą ilość sekwencji pomocniczych, które nie wykazują homologii lub prezentują jedynie niewielkie podobieństwo względem cząsteczki docelowej.

PL 237 080 B1

Zależne od eRNA wzmocnienie syntezy białek oznacza co najmniej 20% zwiększenie wydajności syntezy względem kontroli niestymulowanej przez eRNA.

Przedmiotem tego wynalazku jest cząsteczka eRNA lub mieszanina cząsteczek eRNA, których wzmacniające właściwości w syntezie białek można otrzymać przez zaprojektowanie oligonukleotydu, polinukleotydu i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego wpływającego na zmianę zależnego od energii Gibbs'a fałdowania regionów regulatorowych, zwłaszcza przez działanie na sekwencję 5'UTR, co prowadzi do wzmocnienia syntezy białek, któremu towarzyszy zwykle linearyzacja docelowych struktur RNA (minimalizacja AG->0[kcal/mol]).

Celem wynalazku jest również dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, których wzmacniające właściwości w syntezie białek można otrzymać przez zaprojektowanie oligonukleotydu, polinukleotydu i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego wpływającego na zmianę zależnego od energii Gibbs'a fałdowania regionów regulatorowych, zwłaszcza przez działanie na sekwencję 3'UTR, co prowadzi do wzmocnienia syntezy białek, któremu towarzyszy zwykle linearyzacja struktur RNA (maksymalizacja AG -/ [kcal/mol]).

Innym przedmiotem tego wynalazku jest dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, których wzmacniające właściwości w syntezie białek można otrzymać przez zaprojektowanie oligonukleotydu, polinukleotydu i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnego do wiązania się do elementów cis wewnątrz regionów regulatorowych docelowych cząsteczek RNA, co w konsekwencji może wpływać na: a) wydajność syntezy białek i/lub b) wydajność transkrypcji i/lub c) wydajność wiązania czynników trans i/lub c) wydajność enzymatycznej maszynerii aktywowanej przez mechanizmy post-transkrypcyjnej i translacyjnej kontroli.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka eRNA lub mieszanina cząsteczek eRNA, których wzmacniające właściwości w syntezie białek można otrzymać przez zaprojektowanie oligonukleotydu, polinukleotydu i/lub cząsteczki kwasu nukleinowego oddziałującego z innymi czynnikami trans takimi jak kwasy nukleinowe i/lub białka wiążące się do elementów cis RNA, zwiększającymi w konsekwencji wydajność syntezy białek.

Tak więc, wynalazek ten rozwiązuje techniczny problem braku możliwości selektywnego wzmacniania syntezy białek, uruchamianej z jednego lub większej liczby alleli chromosomów homologicznych, co najmniej jednego z genów lub fragmentów genów, wymienionych w zastrzeżeniach, sekwencjach i tabelach wynalazku, preferencyjnie co najmniej jednego z wymienionych genów: TP53, BAX, CDKN2A, MYC, CDK4, RB1, NOD2, CHEK2, INBS1, MSH2, MLH1, MSH6, BRCA1, BRCA2, APC, INS GH1, EGF, VEGF, IFNA1, IFNA2, IFNB, IFNG, IGF1 i wielu innych naturalnie występujących lub zmienionych genów lub fragmentów genów, których ekspresja jest zbyt niska i/lub pożądana jest wyższa ekspresja, zwłaszcza supresorów, genów mutatorowych, genów związanych z powstawaniem guza/raka, genów zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną jak również wariantów genetycznych tych genów, ich delecyjnych, inercyjnych i substytucyjnych form, stosowanych w biotechnologii przemysłowej, farmacji, biotechnologii medycznej i terapii genowej.

Wynalazek przewiduje dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, których budowa strukturalna podobna jest do co najmniej jednego z wymienionych typów cząsteczek w tym: a) sensu/antysensu, b) sondy, c) miRNA/anty-miRNA, d) siRNA, e) rybozymu, f) dnazymu, g) aptameru, i/lub h) innego regulatorowego czynnika trans, zdolnego do selektywnego wzmacniania syntezy białek.

Wynalazek przewiduje dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, syntetyzowanej sposobem technicznym z wykorzystaniem metod chemicznych i/lub biotechnologicznych i/lub biologii molekularnej w celu otrzymania sztucznej lub podobnej do naturalnej cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, wykazujących aktywność selektywnego wzmacniania syntezy białek i działających jak selektywny wzmacniacz syntezy (enhancer).

Wynalazek przewiduje dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, które chemicznie charakteryzuje co najmniej jedna z wymienionych cech: a) są sztuczne, zewnętrzne, b) podobne do naturalnie występujących, c) niemodyfikowane chemicznie (DNA, RNA, inne kwasy nukleinowe), d) modyfikowane chemicznie (takie jak: LNA, PNA PTO, O-2'-metyl-RNA, tio-pochodne kwasów rybonukleinowych jak również innych modyfikowanych cząsteczek), w każdym przypadku wykazujące aktywność selektywnych wzmacniaczy syntezy białek.

Wynalazek przewiduje dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, które są a) izolowane z tkanek i/lub b) płynów ciała i/lub c) zsyntetyzowane sposobem technicznym.

PL 237 080 B1

Wynalazek przewiduje dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, które wiążąc się do docelowej cząsteczki RNA, zwłaszcza do nieulegającego translacji regionu 5' (5'UTR) cząsteczki mRNA, wykazuje właściwości wzmacniania wydajności syntezy białek kodowanych przez a) geny opisane w zastrzeżeniach, wykresach, sekwencjach i tabelach wynalazku i/lub b) wielu innych naturalnie występujących i modyfikowanych genów lub ich fragmentów, których ekspresja jest zbyt niska lub pożądany jest wyższy poziom ekspresji.

Wynalazek przewiduje zasady projektowania cząsteczki eRNA jak również przygotowywania mieszaniny cząsteczek eRNA, wykazujących właściwości wzmacniania syntezy białek i wysoki poziom selektywności względem docelowego allelu lub genu, a) preferencyjnie projektowanych na podstawie a.1) sekwencji genów jednego lub większej liczby alleli chromosomów homologicznych, w tym co najmniej jednej sekwencji opisanej w zastrzeżeniach, wykresach, sekwencjach lub tabelach wynalazku, i/lub a.2) sekwencji wielu innych modyfikowanych lub występujących w naturze genów lub ich fragmentów, których ekspresja jest zbyt niska lub pożądany jest wyższy poziom ekspresji, b) preferencyjnie projektowanych jako typowe oligonukleotydy, polinukleotydy, miRNA, siRNA, cząsteczki sensów, antysensów, molekularnych sond, których sekwencja projektowana jest jednak na podstawie specjalnych, docelowych miejsc wiązania eRNA, opisanych w niniejszym wynalazku jako sekwencje regulatorowe, b.1) zwłaszcza wysoce ustrukturyzowane elementy cis, IRE, IRES, umiejscowione zwłaszcza w regionach 5'UTR i/lub b.2) słabo pofałdowane elementy cis sekwencji 3'UTR.

Wynalazek przewiduje dostarczenie cząsteczki eRNA lub mieszaniny cząsteczek eRNA, które mają zastosowanie w biologii medycznej, chemii medycznej, biotechnologii, farmacji, biochemii, biofizyce, bioinżynierii, biologii, chemii, fizyce, przemyśle, weterynarii, biologii roślin i zwierząt, medycynie molekularnej a zwłaszcza w preparatach medycznych zawierających materiał genetyczny dostarczany do wyizolowanych ex-vivo komórek jak również komórek żywego ciała w celu przeprowadzenia terapii chorób genetycznych, w tym nowotworów, chorób infekcyjnych i chorób dziedzicznych.

Wynalazek przewiduje, że cząsteczka eRNA lub mieszanina cząsteczek eRNA zawierających co najmniej jedną sekwencję, jej fragment lub pochodną, wykazuje co najmniej 80% identyczności sekwencji, zwłaszcza co najmniej ok. 90% podobieństwa sekwencji, szczególnie co najmniej 95% identyczności sekwencji względem cząsteczki kwasu nukleinowego, scharakteryzowanego przez unikatowe cechy i/lub zastosowania opisane w zastrzeżeniach, wykresach i tabelach niniejszego wynalazku.

Wynalazek przewiduje, że cząsteczka eRNA lub mieszanina cząsteczek eRNA obejmujących co najmniej jedną sekwencję lub jej fragment lub pochodną, wykazuje co najmniej 80% podobieństwa działania eRNA, scharakteryzowanego szczegółowo w zastrzeżeniach, wykresach i tabelach wynalazku, szczególnie zsyntetyzowanych zgodnie z założeniami wynalazku, zwłaszcza na podstawie sekwencji genów wymienionych w tabeli 2-A i tabeli 2-B.

Wynalazek przewiduje, że cząsteczka eRNA - DNA i/lub RNA i/lub pochodna kwasu nukleinowego, jest zdolna do hybrydyzacji w rygorystycznych warunkach z co najmniej jedną z sekwencji opisanych w tabeli 2-A i 2-B tego wynalazku.

Przedmiot wynalazku przedstawiony w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunkach: Rys. 1,2, 3, 4.

Rysunek 1. Kontrola translacji jest jednym z ważnych mechanizmów regulacji syntezy białek odbywających się na poziomie post- transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów, włączając w to zależną od allela translację z macierzystego (A.1) lub ojczystego (A.2) allela, wykazujących różnice w zakresie SNP (polimorfizmów pojedynczych nukleotydów) pokazanych na Rys 1 .A.2 w postaci małych gwiazdek. mRNA, pełniąc funkcję matrycy syntezy białek, składa się z trzech regionów: nieulegającego translacji regionu 5' (5'UTR), sekwencji kodującej (CDS) i nieulegającego translacji regionu 3' (3'UTR), zawierających zwykle kilka regulatorowych elementów cis (np.: w zakresie 5'UTR: element odpowiedzi na żelazo - IRE, wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu -IRES, element przesunięcia ramki odczytu, rybo-przełącznik, sekwencja liderowa białka rybosomalnego, alternatywne ramki odczytu -uORFs, specyficzne drugorzędowe i trzeciorzędowe struktury sfałdowanego RNA, struktura spinki do włosów, sekwencja kierująca wbudowywaniem selenocysteiny- SECIS, w zakresie 3'UTR: element bogaty w sekwencje AU, sygnał poliadenylacji, jak również inne sekwencje kwasów nukleinowych. Sekwencje cis znaleźć można również w DNA: operon, promotor, terminator, kaseta tata, element odpowiedzi hormonalnej -HRE i wiele innych sekwencji cis). Wszystkie te sekwencje regulatorowe mogą wiązać czynniki trans (takie jak: miRNA, zwykle rozumiane jako czynniki wiążące się do 3'UTR i hamujące syntezę, cząsteczka antysensu, sztuczna cząsteczka siRNA, białko regulacyjne, podjednostka rybosomu, polimeraza, odwrotna transkryptaza i wiele innych). Trójkątami wskazano

PL 237 080 B1 cząsteczkę kwasu nukleinowego zdolnego do selektywnego wiązania się do jednego lub większej ilości alleli genu lub jego fragmentu, selektywne wzmacniającą syntezę wybranego białka (B., tutaj: jako sztuczne, podobne do miRNA oligonukleotydy, selektywnie wiążące się do 5'UTR mRNA alleli p53). Cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest przedmiotem niniejszego wynalazku została oznaczona w skrócie jako eRNA, na podstawie jej zdolności do wzmacniania syntezy białek i przez analogię do opisanych powyżej cząsteczek siRNA.

Rysunek 2. Przykład zastosowania eRNA jako cząsteczki kwasu nukleinowego umożliwiającego wzmocnienie syntezy białka w sposób selektywny względem genu lub allelu [B.1., B.2.], Jednoniciowe lub dwuniciowe eRNA pokazano pogrubioną linią prostą lub linią zawierającą pętlę zakończoną strzałką na 3' jej końcu (czerwone linie) [B.1., B.2., B.3., B.4.a., B.4.b., B.4.C., B.5.a., B.5.b., B.5.C., B.6.a-g., C.1.]. Naturalnie występujące cząsteczki miRNA i siRNA przedstawiono linią wykropkowaną zakończoną strzałką na 3' końcu sekwencji (niebieskie linie) [C.2., C. 3]. Mutacja C2756T obecna w sekwencji IRES 5'UTR transkryptu c-Myc [A.] conajmniej jednego z alleli, obserwowana w 42% próbek szpiku kostnego (Paulin et al., 1996) prowadzi do zwiększenia wydajności wiązania czynników translacyjnych (Paulin et al, 1998) a w konsekwencji do nasilenia inicjacji translacji białka c-Myc-2 w sposób niezależny od czapeczki [A.], co wskazuje na nowy mechanizm onkogenezy (Stephen et al., 2000). Nadekspresja c-Myc-2 może być selektywnie zredukowana przez zastosowanie poznanej wcześniej technologii wyciszania genów przez zastosowanie cząsteczek siRNA [C.2] selektywnie wiążących się do zmutowanego allele genu [C.] i/lub przez zastosowanie eRNA, jako środka przeciwnowotworowego o budowie przypominającej sztuczne miRNA [B.1.], sondę, antysens/sens [B.2.], umożliwiającego selektywną nadekspresję prawidłowego białka c-Myc-1 z prawidłowego (nie zmutowanego) allelu [B.]. eRNA przedstawione w punkcie [C.1] prezentuje możliwość wzmacniania syntezy białek w oparciu o zmutowany allel lub sztuczną sekwencję lub gen lub fragment genu, którego wydajność syntezy białek jest zbyt niska lub powinna być wyższa. Naturalnie występujące miRNA, wiążąc się do 3'UTR [C.3] może niespecyficznie hamować syntezę grupy białek w (miRNA wiążą się zwykle do co najmniej kilku mRNA). Niepełna homologia sekwencji między eRNA i matrycowego RNA [B., C.,] została przedstawiona jako centralnie położona pętla na liniach eRNA zakończonych strzałką na 3' jej końcu [B.1., B.3., B,4.a., B.4.b., B.4.C., B.5.a., B.5.b., B.5.C., C.1.], gdzie eRNA o strukturze szpilki do włosów [B.4.b] lub dwuniciowe eRNA [B.5.b] zawierające dwie pętle, stanowią przykład pełnej lub niemal pełnej komplementarności obydwu nici eRNA względem siebie i jednocześnie niepełnej homologii sekwencyjnej względem docelowego RNA. Punkt [B.6.a-g] przedstawia eRNA, zakończone na 3' końcu sekwencją (3'(N)n) zawierającą n-nukleotydów, Nzasad (G, A, C, T,U lub modyfikowanych), zwłaszcza homologicznych do docelowej sekwencji i stosowanych w celu zwiększenia selektywności i/lub N-zasad sprzężonych z transfektantem i/lub cząsteczką ochronną i/lub modyfikowanymi nukleotydami stymulującymi pobieranie eRNA przez komórki (e.g.: tiofosforanowe nukleotydy DNA, tio-rybo-pochodne lub nukleotydy amino-NTP włączane do eRNA przez transferazę nukleotydów terminalnych).

Rysunek 3. Przykład sekwencji i struktur eRNA umożliwiających selektywne wzmacnianie syntezy białek [A., B., D-J.] lub wyciszanie genów [C] z geno- lub allelo-specyficzną selektywnością, zaprojektowanych na przykładzie genu MYC (c-Myc). Sekwencje wynalazku przedstawiono w dziale „lista sekwencji”.

A. Sekwencja sztucznej, podobnej do miRNA cząsteczki eRNA, stosowanej w celu selektywnego wzmocnienia prawidłowego allela genu MYC.

B. Sekwencja sztucznej, podobnej do miRNA cząsteczki eRNA, stosowanej w celu selektywnego wzmocnienia zmutowanego allela genu MYC.

C. Sekwencja cząsteczki siRNA, stosowanej w celu selektywnego wyciszenia zmutowanego allela genu MYC (technologia wyciszania genów).

D. Sekwencja podobnej do antysensu cząsteczki eRNA, zmodyfikowanej przez dodanie 3'(N)n końca zawierającego n-nukleotydów, N-zasad stosowanej w celu selektywnego wzmacniania lub jako transfektant/protektant.

E. Sekwencja podobnej do sensu cząsteczki eRNA.

F. Struktura podobnej do miRNA cząsteczki eRNA z centralnie położoną pętlą (niedopasowaniem względem sekwencji docelowego RNA).

G. Struktura podobnej do miRNA, dwuniciowej cząsteczki eRNA, zawierającej dwie centralnie położone pętle z pełną lub niemal pełną komplementarnością nici eRNA i jednocześnie niepełną homologią sekwencyjną względem docelowego RNA.

PL 237 080 B1

H. Struktura podobnej do miRNA, dwuniciowej cząsteczki eRNA, zawierającej jedynie jedną centralnie położoną pętlę na nici antysensownej z częściową komplementarnością nici eRNA i jednocześnie wysoką homologią sekwencyjną nici sensownej względem docelowego RNA.

I. Struktura podobnej do miRNA, dwuniciowej cząsteczki eRNA, zawierającej jedynie jedną centralnie położoną pętlę na nici sensownej z częściową komplementarnością nici eRNA i jednocześnie wysoką homologią sekwencyjną nici antysensownej względem docelowego RNA.

J. Struktura spinki do włosów, podobnej do miRNA, dwuniciowej cząsteczki eRNA, zawierającej dwie centralnie położone pętle z pełną lub niemal pełną komplementarnością nici eRNA i jednocześnie niepełną homologią sekwencyjną względem docelowego RNA. Ta struktura spinki do włosów reprezentuje grupę harpinowych eRNA podobnych do powyżej zaprezentowanych dwuniciowych eRNA.

Rysunek 4. Przykład efektywności l selektywności cząsteczki eRNA skierowanej na element cis sekwencji 5'UTR genu TP53. Materiały i metody: chemiczna synteza cząsteczek 2'-0-metylo-RNA; wprowadzenie eRNA (o budowie podobnej do sensu, antysensu, anty-miRNA, miRNA) lub siRNA (jako kontroli technologii eRNA), wszystkie zaprojektowane tak aby wiązać się do cząsteczek mRNA białka p53; lizat linii komórkowej HeLa; analiza western biot (średnia +/-błąd standardowy) poziomów białka (N = 30); analiza poziomów transkrypcji real-time PCR (N = 30); dane wyrażone jako gęstość optyczna (OD) białek. (A. p53, B. β-aktyny) znormalizowana do 100% kontroli (bez dodatku eRNA) I podzielona następnie przez znormalizowane dane transkrypcji w celu wyeliminiowania efektów regulacyjnych eRNA na transkrypcyjnym i post-transkrypcyjnym poziomie, statystyka: ANOVA *p < 0.001 wzgl. kontroli.

A. Wydajność translacji białka p53. Sekwencja sztucznej, podobnej do miRNA cząsteczki eRNA wzmacnia wydajność translacji 2,98-krotnie. Interesującą wydaje się być obserwacja, że cząsteczka eRNA podobna do sensu jak również antysensu może wzmocnić syntezę białek, zwłaszcza kiedy zostanie zaprojektowana w oparciu o element cis sekwencji 5'UTR. Inne, nie pokazane tutaj dane wskazują, że pełna lub niemal pełna homologią eRNA (o budowie podobnej do sensu/antysensu/sondy) z docelową sekwencją RNA działa bardziej efektywnie jako wzmacniacz syntezy białek w przypadku roślin, niższych organizmów i biotechnologii opartej o rośliny, podczas gdy niepełna homologią eRNA o budowie podobnej do miRNA jest najbardziej efektywna w komórkach ludzkich i ludzkich/zwierzęcych systemach biotechnologicznych syntezy białek (jak to pokazano na wykresach słupkowych).

B. Translacja białka β-aktyny. Sekwencja sztucznej cząsteczki eRNA podobnej do miRNA jak również innych rodzajów struktury eRNA, które zostały zaprojektowane by wiązać się do p53, nie ma wpływu na wydajność translacji β-aktyny, co wskazuje na wysoką selektywność eRNA.

Opis preferowanych zastosowań.

Powyższe oraz inne przedmioty, cechy i korzyści wynikające z tego wynalazku przedstawione zostały w kontekście zamieszczonych rysunków, sekwencji, tabel, opisów i zastrzeżeń.

W preferowanym zastosowaniu, cząsteczka eRNA posiada strukturę podobną do microRNA (miRNA), zwłaszcza zakończoną sekwencją dwóch nukleotydów TT na jej 3' końcu, zaprojektowaną na podstawie sekwencji 5'UTR supresora, zwłaszcza TP53, BRCA1, BRCA2, CDKN2A lub sekwencji cytokiny, szczególnie IFNA1, IFNA2, IFNB, IFNG, ILI, IL6, IL8, IL10 lub innych genów, szczególnie wymienionych w Tabeli - 2 tego wynalazku. Cząsteczka ta wytwarzana jest sposobem technicznym na drodze chemicznej syntezy i/lub w oparciu o biologiczne systemy wektorowe, otrzymywana jako oligonukleotyd i/lub polinukleotyd i/lub cząsteczka kwasu nukleinowego typu RNA i/lub DNA i/lub jej modyfikacja, szczególnie zawierająca pochodne tio-rybonukleotydów lub analogi oligonukleotydów z wiązaniami fosforotiolowymi (PTO), i/lub O-2'-metylo-RNA i/lub pochodne kwasów nukleinowych typu LNA - usztywnianych mostkiem metylenowym lub mieszaninę tych cząsteczek. eRNA znajduje zastosowanie szczególnie jako składowa preparatu medycznego wprowadzanego do żywego ciała ludzkiego lub zwierzęcego, zwłaszcza z wykorzystaniem ochronnego nośnika transfekującego, w szczególności pochodnej kwasu tłuszczowego i/lub kardiolipiny i/lub innej cząsteczki oligo/polinukleotydu sprzężonej z polikationem, zwłaszcza cząsteczki DNA lub jej pochodnej sprzężonej z co najmniej jednym z nośników takich jak: poliimina, poliimid, poliamina, nukleotyd kowalencyjnie związany z aminami (amine-NTP), selektywnie wiążący aptamer, selektywnie wiążące białko, selektywnie wiążący oligonukleotyd, liposom, nośnik pochodzenia wirusowego. W preferowanym zastosowaniu cząsteczka eRNA znajduje zastosowanie w terapii przeciw-nowotworowej, szczególnie działa

PL 237 080 B1 jąc przez selektywne wzmacnianie genu supresora lub w terapii skierowanej przeciw mikroorganizmom, szczególnie działając przez wzmocnienie translacji genów odpowiedzi immunologicznej.

W innym preferowanym zastosowaniu, sztuczna cząsteczka eRNA posiada strukturę podobną do microRNA (miRNA), zaprojektowaną na podstawie sekwencji 5'UTR muratora, genu naprawy lub genu związanego z procesami starzenia, zwłaszcza MLH1, MLH3, MSH2, MSH6, PMS1, TERT, COL1A1-COL9A1, SIRT1 lub innych genów, szczególnie wymienionych w Tabeli - 2 tego wynalazku. Cząsteczka ta wytwarzana jest sposobem technicznym na drodze chemicznej syntezy i/lub w oparciu o biologiczne systemy wektorowe, otrzymywana jako oligonukleotyd i/lub polinukleotyd i/lub cząsteczka kwasu nukleinowego typu RNA i/lub DNA i/lub jej modyfikacja, szczególnie zawierająca pochodne tio-rybonukleotydów lub analogi oligonukleotydów z wiązaniami fosforotiolowymi (PTO), i/lub O-2'-metylo-RNA i/lub pochodne kwasów nukleinowych typu LNA lub mieszaninę tych cząsteczek. eRNA znajduje zastosowanie szczególnie jako składowa preparatu medycznego wprowadzanego do żywego ciała ludzkiego lub zwierzęcego, zwłaszcza z wykorzystaniem ochronnego nośnika transfekującego, w szczególności pochodnej kwasu tłuszczowego i/lub kardiolipiny i/lub innej cząsteczki oligo/polinukleotydu sprzężonej z polikationem, zwłaszcza cząsteczki DNA lub jej pochodnej sprzężonej z co najmniej jednym z nośników takich jak: poliimina, poliimid, poliamina, nukleotyd kowalencyjnie związany z aminami (amine-NTP), selektywnie wiążący aptamer, selektywnie wiążące białko, selektywnie wiążący oligonukleotyd, liposom, nośnik pochodzenia wirusowego. W preferowanym zastosowaniu cząsteczka eRNA znajduje zastosowanie w medycynie estetycznej, zwłaszcza przez wzmacnianie ekspresji genów takich jak kolageny, telomeraza lub inne geny biorące udział w procesach starzenia.

W kolejnym preferowanym zastosowaniu, cząsteczka eRNA posiada strukturę podobną do oligonukleotydu typu sens i/lub antysens, zaprojektowaną z pełnym lub prawie pełnym dopasowaniem do sekwencji genu rośliny, którego ekspresja jest zbyt niska lub pożąda się większej ekspresji tego genu. Cząsteczka ta wytwarzana jest sposobem technicznym na drodze chemicznej syntezy i/lub w oparciu o biologiczne systemy wektorowe i znajduje zastosowanie w biotechnologii roślin.

W innym preferowanym zastosowaniu, cząsteczka eRNA posiada kombinację strukturalnych i funkcjonalnych cech, przedstawionych szczegółowo w zastrzeżeniach, tabelach, rysunkach, opisach i sekwencjach niniejszego wynalazku.

PL 237 080 Β1

T a b e la 1

Porównanie najważniejszych właściwości wybranych czastczek kwasów nukleinowych, wykazujących aktywność czynników trans jak również indukujących zjawisko RNAi (interferencji RNA) lub aktywność związaną rozcinaniem RNA - miejsce eRNA w grupie cząsteczek wywołujących zjawisko RNAi

Naturalnie występujące cząsteczki kwasów nukleinowych.	Cząsteczki kwasów nukleinowych, wyprodukowane sposobem technicznym.
typ interferujących RNA:	dopasowanie/ homologia/konipl ementarność z docelową cząsteczką RNA	typowe pochodzenie komórkowe	typowa natura biochemiczna	typowe» docelowe regiony mRNA /działanie w komórce	dostępne podstawowe technologie, wykorzystujące cząsteczki kwasów nukleinowych / typowe działanie w komórce	pochodzenie/ selektywność/ specyficzność/	typowe, docelowe regiony mRNA	typowa natura biochemiczna
miRNA (mikro RNA)	niepełna homologia, zwykle z małą 2’5 nukleotydową pętlą w środkowej części miRNA	endogenne transkrybowane w komórkach eukariotycznych z genów miRNA	jednonięiow ę (2125 nukleotydowe) ssRNA	docelowe regiony 3’UTR, częściowe zahamowanie translacji któremu nie towarzyszy degradacja mRNA; jeden z najważniejszych mechamiznów regulacji ekspresji genów; -działanie na poziomie post-transkrypcyjnym, precyzyjniej pretransiacyjnym	1, technologia zależnego od miRNA hamowania translacji (np. onkogenów); 2. syntetyczne antymiRNA stosowane dla celów blokowania natywnych miRNA	syntetyczne lecz projektowane na podstawie baz danych miRNA lub natywne miRNA; nieselektywne ,nlespecyflczn e włażące się do licznych mRNA.	zwykle 3’UTR	RNA, DNA i modyfiko wane pochodne
shRNA /siRNA (krótkie harpinowe RNA / małe hamujące cząsteczki RNA)	niemal pełna komplementarność	endogenne, wytworzone z egzogennych przez pocięcie dwunlciowego RNA (dsRNA) np.: w wyniku odpowiedzi przcciwwirusowej, rzadko występujące naturalnie	dwuniciowe (19-23) dsRNAs	zwykle, docelowe sekwencje kodujące (CDS) / całkowite zahamowanie translacji z jednoczesną degradacją mRNA, -działanie na poziomie po st-transkrypcyj nym	zależna od siRNA / shRNA degradacja transktyptów I niemal całkowite zahamowanie translacji (np. wyciszenie onkogenów)	syntetyczne, sztuczne cząsteczki zaprojektowane na podstawie sekwencji docelowej; selektywne; specyficzne	zwykle CDS (sekwencja kodująca mRNA)	RNA, DNA i modyfiko wane pochodne
oligonukleotydy, polinukleotydy typu sens / antysens /sonda	pełna komplementarność	endogenne, wytworzone z egzogennych przez pocięcie jednoniciowego RNA (ssRNA) np.: w wyniku odpowiedzi przeciwwirusowej; rzadko występujące naturalnie	jednoniciowe (1625 lub dłuższe) ssRNA	zwykle docelowe sekwencje CDS, częściowe zahamowanie syntezy białek; -działanie na poziomie pre-translacyjnym	sens/ antysens/ sonda/ zależne od oligonukleotydu / polinukleotydu zahamowanie translacji	syntetyczne, sztuczne cząsteczki, opracowane na podstawie docelowej sekwencji; selektywne; specyficzne	zwykle CDS (sekwencja kodująca mRNA)	RNA, DNA i modyfiko wane pochodne
opisana w niniejszym wynalazku cząsteczka eRNA - nowy rodzaj kwasu nukleinowego» który może uruchamiać zjawisko RNAi i/lub odcinania hamujących sekwencji regulatoro- wych, prowadząc w konsekwencji do selektywnego wzmocnienia I syntezy białek	całkowita lub częściowa komplementamość, zwykle zależna od gatunku	endogenne lub egzogenne cząsteczki	dowolne cząsteczki RNAi DNA zdolne do wzmocnienia syntezy białek, zwykle nieselcktywn e	1. zwykle docelowe sekwencje 5’UTR, 2. wzmacniające translację grupy genów, zwykle niespecyficznie/ -działanie na poziomie pre-translacyjnym	1. technologia selektywnego wzmacniania syntezy białek i wydajności translacji wybranych genów/ strukturalnie: jednoniciowe cząsteczki podobne do: miRNA (szczególnie w odniesieniu do ludzkich i zwierzęcych komórek) jak również podobne do sensu/antysensu/sondy (zwłaszcza w odniesieniu do roślin oraz komórek niższych organizmów) i/lub dwuniciowe kwasy nukleinowe; 2. technologia dotychczas nie była dostępna	zwykle, sztuczne, syntetyczne cząsteczki, zaprojektowane na podstawie dowolnej sekwencji docelowej / wysoceselektywne i specyficzne wzmacniacze syntezy białek	5’UTR lub dowolna sekwencja RNA poniżej sekwencji 5’UTR, szczególnie regulatorowe sekwencje cis i/lub mocno pofałdowane sekwencje 5’UTR i/lub słabo pofałdowane sekwencje 3’UTR	RNA, DNA j modyfiko wane pochodne, LNAs PNAs, UNAs, 2'O-Me, PTO, tio-rybopochodne oraz inne modyfika cje

PL 237 080 Β1

Tabela 2-A

Lista sekwencji cząsteczki kwasu nukleinowego (eRNA) będącego przedmiotem wynalazku. Sekwencje przedstawiono w konwencji od 5' do 3' końca. Tabla-2.A. Lista sekwencji:

i Nazw^SiKWENCIA:

id iel iCGTCTGGATCCrrAlCAGAAGGTGCCATAtCĆATOC i :e7 AKOAACGCCGCCGTATGGAAGCAGTGTGTCTGG ie3 ggcatccccactgatgga ” >4 1TCTTCAGAAGGTGCCATATCCi

CG TCTGGATCCTTAGAAGCATTTGCGCHGGAi >6 CGGCATlXTCA£CAACTG '' >7 GCtGGSGTSTTGAAGGtĆtC eE ATCGAAGGCCGCGGTATGGATGATGATATCGCCG i_e9 GGTTATATTAGTiSATCCCTGCAT^--— >10 GASCTGATAACAGAASTTGGT..............................

>11 GATAtóĆGAATGTGAAGĆAGAG >12' ĆCWCTrGGTACCAffrrTGn

Iel3 icCGAATT^CKm^ >14 CAGAGGTTGCAGTGAGCłGA >15 'AeTTTAOS&Ś^ ......................

el6 ĆGlAĆTGAATAATACACAtaGTA el/ COIAAAGTGATAGGATTACAG :el8 iAKTATGGGCTJkCACCTCrCA ’el& '«3<SGACG©3CAATAGGATAS ;_e21 CeAGCTTGAGOCAGGAGACA ........ ...... Ί i_e22 CGGtóATGTGG^fACfTGGA 1 >23 iTGCCCATCTTTCATrCTGTG ~.................

:e24 iÓATTGCTATGGGAAGTGCTG >25 iGATGGATGATAATGATGGAGA >26 ^GACFTGTTGGCATGGCAGA >27 :GCGTGTAA’GATGAGSTGA] >28 iCM^MTOlGAG^^ ..... Ί >29 .GACGOlGATGnTGCTMA‘ ·Ο7Αάτ&5ΑΤα·Α0ΑΟΑα7Α.................’.................

>31 ioraĆAŚCArACnAAAIGlĆA.............;

>32 :GAGTGTTAGCTATĆaĆCTaĆ7 ' >33 iTĆAGfcATGTtiATrGTGef 1 >34iATTCAGGCCTAAAGTTGGGrA ie35 iGATGTAAGTATTGCTCTTCTGC >36 tgttgctcagcagccatga >37 ICATGCAOCAFGACTGAGGTA ;e38 iGCFATAITTCAATGGTGTCACA ieBB iGCrnTAAGTGGTAGCCATAGT >40iTGACACCACArGGTACGA ΐβ41 CGCTAAGAAAGĆCTACAĆCr >42 ifGd^GATTACAGGTGTGA................................................ .............................................

ίβ>4 ~ FgAGTAGCACMATGGC.TGAT ί

Ϊβ45 ^GTAAATATttttn^ ...... J

[>4e''’ą^GATM^

ICTCACII GUI IATTTCATCI ILI ATTATG7GT >47 śjiSTrTGTCAAAGCCATTCCAGCATATCGTCrrAGrGTA iATACTGTAi >48 iteCCTGCAAAfAGMG^ ’ ĄCTaGGKAGCTGAAGaTCC j ie49 iACAGGATAAOTTGTACTTĆcrrGATIGTĆTTTGCTCAC J ί JTTtATTTCATCTTCTATTATGTGT >só ί . 1ATACTGTA >51 !M<XTGCAAATAGCAGAAATAAAAGATTGGAaCTAG 1

...... igrcAGcreMSATcc _i >5? iTCCTrGnGGCTACATĆTĆ:’’ “ .Ί >53 Fgtggactgtgaaatgtatggi ie54.....IŚGATGTMfaWACGACAĆAG........ 1 :e55 IcTGCTGSAACrrÓBCTCACA >56.....iGTGCTCTGkGTATA^CAGGAT| >57 IaCGGCAMGTĆCTTĆaĆAGA ί >58.......inGTOLUGoSfrCCMŚC ’ β59 iCCCTBCAAATAGCAGAAATAAAAGA;

>60 IITGATTCCTrGATTGTCTTTGCTCACTTr“Ί >61 i^^CZCAGTATAAACA&SA-AAGTTGTACTni >62 = >63 iCAGCAAGCAAGTTGGCAAGT '>64 iGGMTTGTGTACĆATAAGCCAT\ >65 i&GACCTGAACAAGAGĆTGACA~......... ( eS6 iCMseerras^^ ”;

>67 >AGGCCCTCTAGCrGTAAGTG ¢68 >AGTG^GCci^^i >69 iACTGAGIGACTGACTCX7TCACTAGCAATAGTTCCTGAA:

! IFATTCCC

570 nAGATGGCTCGATCGAfcGAAAATrf TGCTGGAGAA1 i GŁCAOUJWU ................................. _ __ J >71 pMTC*CłSiiCT6^^ : jGCCCTCTAGCTGTAAGT $72......acatćtcćcctaćcgctat............ 1 >73 iCGTCTGGATCCTTATCATCTCCAAGCCACAG Ί >74......AfcG^GCaŚCGGTATGA^Ί >75 GAG^ Ί >75 ^?CCACAGATGCAAGAAfĆA(5C.....

>77 TGTCTGGATCCTTATCAGTTTCCCiGATTCrGGAG >78 >αππ^Ατ£ατΑτοώτ^ i i e 79 atcGaaggccgĆggtatgaagcctcacttcagaaacaI

CAGTG _J >80 atcgmggcmcggtatggaagi^gcggKgcatc 1

......... i >82 FaCAGAGCAAGTGAGTGGTAGAG ...................

>83......jCACCTGCTĆcrfciccrCGT..................... i >84.....jĆGGAACT^AGGAACAACTGAĆ !

>85......ΐά^60ΕτοδτΑ«ΐτβ....................................·

±86 e87 e88..... eSO eÓo’ e91 *92	CTGCTCCTTCAOCTCGTCCAG CCSACATGGAGSACGTGTGC | GraGA«TC6AGGACGfG......................—·—] GACCAĆTCGA{XA.GGTrCTG 1 GCreAACn^TATCCT^OTW............ I ccACAAAGAiGarcAOSGrc * i ^GAee^CCGTO^ .............. ί
*93	SCnGAGGASTCFCACCCAAC
	................................................................................
*94	CAAGGCCCTGTGCACCAAG
e95	GSTGAGGAGGCTIGAGGAGT .......’
	—..................... μ.—·.......
*98	GGAGCGGCGGTGATGGA 1
*97	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΛΛΑβΰΑΑΑ6Α60ΤΑΒΒΒΤΐΑΒΑ
*98	SACTTCACGTGACCCGG5CG I
	......................................................................................................
*99	gttgggtgagctaactcctcaagc
*100	GCTTGAGGAGnAGCTCACCCAAC
*101	CCUCUCGCGSSSUCCSCG06GGC
elDZ	JCUCGCCGGGLUALCCSCGCGG—
Pini	AACCGCGCGGAUAACCCGGCGAGA
*104	UCACGUGACCCGGGCGCSCUGCGGCCGCCCGCGCG i
	GtCCCGGCGAGAGSCGGCGGCGGSAGCGGCGGLG i
_	AUG ’
*105	GCraCGCGGACCCGGCGAGAGG
*106	TCGOTTACTTATCATTGCCT i
	—»..> .................
¢10/	OCTACAAAGCTTAnCCTCA
elD8	CATCCTGGCTTAGAACTAACG
*109 ‘TTCACCAGGCAAATCTACTGA
ellO	AGATCGTACTTGCCGTCTT
Al1’	CCCTCTAATTTGGTGCCAT
ell2	GACACTGACAGTAGTGCTGCT
*113	GCATTTATTGGGAATAGGTCT
*114	CGTCrGGATCClTAACCATACTTTCrCAAAAAACC
*115	Al LllAAUULLULLL» 1 |AICjC^rvVI * 1 II 1 liiAUA
*116	CGTCTGGATCCTTAACCTCTCAAAAAACCACCATAACC ;
	ACC
*117	AICGAAGGCCGCGGTTATGGTGG! i IJGGTGGTTATGr
	G F
*118	GAAAASCGCGGSAADJACAGAUAAAUll
*119	AACAAAGCnTCTACCTTTCTGTCCTGSGG ATTCTCTT
	GCTCGCTAGAAAGCTTTGTA
[*12O	CGACCTGGACTTGGTGAGGCCCATCTCTGCAAAGG
	.
*121	CGACCTGCACTTGCTGATTACCTTTCTGTCCTGGG
*122	CGACCTGSACTTGCTGASA&AAGAAAGGGCaTCAC
	AG
e!23	CGACCTeOACTTGCTGAGCAGGAAnGGTTTCAGATG
	ΑΤΘΑ
*124	CGACCTGGACTFGCTGAGACTCACAACACTTGTTATTT!
	GSTAAA ί
*125	cgacctggmttgctgaactgactgtaggcattgcac i
	cgttgctaoc
el26	CGACCTGGACTTGCTGAACTSACTGACTGAACCGnG i CTACCGA6TGTCT ΐ
el27	CGACCTGGACnGCTGAGĆTGAĆfGACf&AĆCTGACT =
	TACCAGAT6GGACACT i
	CGACOISGACTTGCTGAGCTGACTGACTGACTGACAA i
*128
	GCCnCACAGTGTCCTrTA
*129	CSACCTGGACiTGCtGAGCTGACTGACTGACTGACTG i
	ACTTATGGGOinTCACCAACA !
*130	AACAAAGtTTTCTCATCTCrGCAM,CeGGA6TGGAAT i
	ACAGAGTGQASAAAGCTTT8TA ΐ
e!31	AACAAACCTTTCTCATCTCTGCAAAGGGGAGTGGAAT1
	ACGGAeTGGAATACAGAGTGGAGAAAGCTTTGTA
e!32	AGCCAGCAGTCCACAGACACFGAGAAGGTATAnGTTi
	TACTT i
*133	AGCCA6CAGFCCACASACTCCTCeGT<jl łLI IAGACA ·
	G
*134	ALCCAG'LAGICCACAGACAAGCCCfiTTCCTCTTTCn ;
el35	A50CAGWGłCCACAG<3AAGCTATOCAGAAAATCTTA:
*136	^GAG _ i AGC&G&OTCi^WGGGTtmCTT^^ i
*137	AGCCAGCAGTCCACAGAATCAnCTTACATAAAGGAC i
	A i
*138	AGCCAGCAGTCCACAGACrnTSGTTATATCAnCTTA i
	CA
el39	AGCCAGCAGTCCACAGAGGCTCTTACTTCTGGGCAT i
*140	AGCCAGCAGTCCACAGACAAAGCGAGCAAGAGAATC I
	CCA
*141	AGCCAGCAGTCCACAGGCCACCACTCTG7ATTCCACT
	CCCCT
t*142	AACAAAGCTrTCTAAGCGCCTTCACAGTGTCCTTTATG
TAAGAAT6ATATAAAGAAAGCTTTSTA
8143	AACAAAGCTrrCTAAGGGCCTrCACAGTGTCCnTACG:
	TAAGAATGATATAAAGAAAGCTnGTA
«144	AACAAAGCTnCTGGCCCrTCACCAACATGCCCACAG ί
	GTAAGAAG AAAGCTFTGTA
el45	aacaaagctttctggcccttcaccaacaggcccacag
	gtaagaa g aaagctttgta
e!46	gcatcaccagagaacgagactgasaaggtatattgt i
	ttacca
el47	GCATCACCAGAGAACGACTCCTCGGTCrrTCTTAGACA c
elTB	GCATCACCJUłAGAACGADtóGaDCGTTCCTĆT^
el49	'GGATCACCAGAGAACGGAAGCTATGCAGAAAATCTTA
	!GTG
ei50	iGCATOłCCAGAGAACGAGTSTTCnAGACAGACACA
*151	•WICACOtótóMCGMT«TTC^^ iC
>152	iGCATCACCAGAGAACGACTTTTGGTTATATCATTCTTA
i	iCG
>153	iGilATCACCAGAGAACGGijGt, iĆi 1 Αίϊ 16 IUG6i.L b<s
[e!54	iGCATCACCAGAGAACGACAAAGCGAGCAAGAGAATC
	= CCC
•el55	•tiCATCACCAGAGAAOGACCACCACTCTGTATTCCACT
1	CCćTA
|el56	iGCGATAATAAATTCTCCTCTGTG

i el 57 : CAAGAGĆnCĆĆTGĆTTÓCA...............................................

>158 ^CTTCCAACCTAeCATCATTACC >159 ^^«GAA^CTCAAO: “““j

............................I :eiei CttĆCTAAG^GAATCCATGC”......... i

.......... ...................[ >163 'CGGASATAATCATAGGAATCCCA >164 *TACA<3>^^’ i >165 iCAGAGGAGATGTGGTĆAATGG ~ ’i >166 IagcggĆccatctĆtscaaί >157 >GGGCTAGAWTCTGTTGCrj >168 iSACAAAGSCTGSTSCTGGA Ę >169 ' : CCAĆ&^ | >170 ŁCUCCUGAGCGCAGGGGCCCAGn >171 UCCUGAG&G^^^ I >172 UCCUGAGTOCAGUAGGGGCCCAGTf~ł >173 iAAaiGGSCCCCIjiaJGCCCU ί >174 iGUACaJUGAUUUĆGUAJUa^AGA^

UAGCGGLAGCCCCUIJGGUUUCCGLJGGCAACGGAA j iAAGCGCCGGAAUUACAGMJAAADUAAAACUGCGaC i ;UGCGCGGCGUGA6CUCGCU3AGACUUCCUGGACG :

I iGGGGACAGGCUGUGGGGUJUCLFCAGAUAACUGGG :

ŻCCCCIJGCGCIJCAGGAGGCCUUCACCCUCUGCIICUG i i_____iGGUAAAgUjęAUUgBAAW3AAAGAAAUC J >175 iAAĆUGGGCCCCUGCGCUCAGGAGG ~ «176 :CUŚ®BÓXCl«ScUCAiŚeCTT ........... 'i >177 iMa^GĆTTrĆTAMGGĆĆ^

...... Igtmgaatgatagaaagctttgta >178 jAAAGi^drn^GGmĆAGATGATGMG^ _______ iGAACGGGCTAGAAAGCrrTGTAĄ____________j ; el79 |AAA£AAAGCTfrCTGGTfrCAGATGATGAGAAAGftG

IGAACGGGCTAGAAAGGTTTGTAA:

e 180 ^AÓCuiGCnTĆTACAcmrrATT^:

iAATATACCnCTCAGTCAGAAAGCTnGTA _ >181 jAW^GOTrCTA^:

>CCnrTCAGTCAGAAAGCTTTGTA >182 FAACA^GCrTrCTACC^GCTAĆĆGis^ iABAACACAGAGGAAGAAAGCrnGTA' >183 |*AÓWGCn^^ACaAGf6TCTMGMGACAS łASGAASAAAGCTTTGTA __ >184 iA*aWAeCTTTCTAa«nTO lAGAAUCAGAAAGCnTGTAί >185 iAACAAAGCTTrCTCCAGATGSGACACTCTAASATFTTC: iTGCATAGCATAGAAAGCTTTGTA ________ >186 iAACAAAGCTrrCrCCAGATGSGACACTAAGATTTTCTl l IGGATAGCATAGAAAGCTTTSTA >187 ?CCCTATAAGCCAGAATCC4GA >188 iGCAGATGTĆAGAlACCACAGCA^ i >189 iAGWGCASTCl^GACmACATTCAfGmĆrTACj >190 iGCATCACCńGAGMCGGCTnACAKG^STnOTATl iC >191 iCGACCIGGACnGCrGAGACrGACTGACrATAAAGAA i l rCCAGGAGTGGAAAG >192 :AACAAAGCJTTCTCXAGGAGTGGAAAGGrAAGAAAC i : ;ATCAATGTAAfiAAAGCTTTGTA I >193 'aACAAAGCTTTCTCCAGGAGTGGAAAGATAAGAAAC i atcaatgtmgaaagctttgta _ _ j >194 MCAMGCnfcTACCTTTCTGTCCTGGSATTĆTCTTG^-' i '<^CCCTTTG6ACGTTAGAAAt3CTTT6TA _ i >195 iagxagcagtccacagacaaggtccaaagcgag'ca i e!96 gcatcaccagagaacgacaaggtccmagcgagta i >197 FcGACTGGACnGCTSACCTnCTGTOCTeeGATrcrel >198 iAACAMGCTTTGTTCCTGGGAnCTCTTACTCGCTETG^

TACCTrAGAAAGCITTGTA iel99 iASCCAGCAGTCCACAGACCATGCnTGCTCTTCTTGAT!

¢200 iGCAlCACCAGAGAACGACCCATGCriTGCTCTTCrTAT , >201 IĆGAĆCTGG^^ iGAAAATAA ..... j >202 >AACAAAGCmCTGOTGGAAGAAAATAATCAA6AAl IGAGCAAAGCA1GGAGAAAGCTTTGTAAί >203 '; AAACA^CTTT^ :CAAAGCATSGAGAAAGCTTTGTAA_‘ >204 CCTCCTCCAAGGTGTATGAAiST | >205 iCBrATTTGTTACATCCSTCTCA ”I ’e206 AGCUGCAGTCCACAGAaGTaCAGAMATf^^ >207 GCATCACLAGiM5AACGACCGTCTCAGAAAATTĆAĆAG’i

!......... JCAGCTGCT^_______________________________ >20? ^ACAAAGCrt^ATTn^ ί GAGAlt3AGAAAGrTT~GT4_ i >216^*^« (GAGACGAGAAAGCTTTGIA >211 iGCTCBTGTACAAGTTTGCCA;

[ć212 1g»GCAGA^^ ..... .......

>213 lAGCCAGCAGTCCACAGGGTCTCnCAGTAATTAGATT IAGT

[e214'‘eaYĆADOiaŻi^a3GGTĆT’crTCAOT ^e215 I^AĆCTiSGACTraCTGAGACTG^ iCACTTTAACTAAT

[e216I^AAAGCTTTĆraCĆ^^ iTTACTGAAGAGAGAAAGCTTrGTA >217 lAAi^ccmĆTGACWcATCArm : iTGĄĄGAGĄGAAAGCmGTĄj >218 IGGAGCGGACTTATTTACCA *1 ' .............

>220 iCAGGCrGTGGGGTTTCTCA ........ .........!

>221 IŚGGOTCCTOTeecra^ Ί >77? IcACCAAATACGAAACACCCAT· 'e^y-jTGTĆtoŚCTAnGM^ i >224 iAGCCAGCASTCCACAeAAAGAGAAATnrCATTGAATr: ίΤΓΓΓΑ >225 IsÓiTĆAĆCAGAGAAĆGG^AGAMf™ jTTTAA _{_}__ __ J «226 I^OTGfiAOTGĆTGAĆfCTCAGATGA^ i >227 ; (AATGAAATTTCAGAAASCTTTGTAΐ >228 ?M^i«iWCnćiiisA^^ ; ίΑΑΤ6ΑΑΑΠΤ€ΑΰΑΑΑβΟΤΤΤ6ΪΑ__j ;>229 jACGAĆGI^AĆTACAtcTCr . ·

TTAGnGUAnG^^ = >233 iCGACCTG^ACTTSCTGAA^GGAGAGTTCCCAGGCC ’; i.......... jAGTA j >234 (AALAAAGCTKCTA&AGTrCCCAGGCCAGTACGSMGi (AATGTGAGAAAAAGAAAGCTnGTA >235 iAACAAAGCTTrCTAGAGTTOCCAGGCCAGTATGGAAGi jiAATGTGAGAAAAAGAAAGCTTTSTA «236 pOTAeTASTeCM^^ i =e 2 3 7 ............... .i >238 FAGCCAGCAGlCCAl^AGGAfCTAAinGGGCĆnAM:?

>2^~jGKATOĆĆAGAGA«^Gli^^ >24θΊω*άτ0βϊ^'σβΣβΑέ^^ jctatgct i>24r'jMCWĘCTnCTĆAGATGGGTG6fA^-GC3n l. . - . CęęAfiTTAGATCAGAAAGCHTGlAί i^tó jAAWAAGt^ĆfĆ^ i _ CCCAGTTAGATCAGAMGCTTTGTA ί>243 GCATTĆ-5ATGAnCAGAGcA |Sw'rn3TO^CTG**TGTC*^ ......................................]

[>245 ΊΑ6ΟΑ6αΰ3Τε&

ί............... i >246 |gcatcaccagagaacgggcaaaaaccttafgtgaat i [ _ ŚGCA___________ _I >247HcGACCTGGACTTGCTGAGACTGCTCTAGńTAATG*TL i i fAATGTAGCA j CACATAASSTTTAGAAASCTTTGTA !

>249 |AACAAAG C^CTA~AAGATGMT^ΐ

I ICACATAAGGTiTAGAAAGęnTGTA >250 (CATGATTCTGTranTGAATGT ‘'| ξ

l>252 lAGGaGÓkGTC^^^

IsTTC >253 SećATttOMGAGAACBBCi^SGCATnATrATrnTt ί..............hx..............._ i >254 =CGAŁCTGGACnGCTGAGACTGCTAATGATAAAACrŚ ‘i ; __ TAAGTGAAAAAA| >255 TAACAMGnTrCrreATAAAACTGTAAGTGAAAAMA! ί iTAATAAATGCCAAGAAAGCTTTGTA js256 iAACMA&ĆTncnGATAAAACTGTAAGTGWiAAAArl AATAAATGCCAAGAAAGCTTTGTA _e257 CAĆACfGAACAl^AlTrGGT ...............

6258 (GTCrrcirnCGAGCCTITCW .....

>^9’>k^GCA5rCCACAGAt^ >260 >caicaccagagaacgacatcatiggagggia1gag i :CT >261 iCGacctggacttgctgagactgalCtgacgcatacagT i iTGGCTGATGGTGGAT......................................... j >262 'MCAAAGĆnTCTAGrrGGCnsATSGTGGATtiGCrCA i

TACCCTCCAATGASAAAGCnTGTA i

0263 AACAAAGCTTTĆTAGTTGGCreAT65TGGATAGCrCA :

.TACCCTCCAATGAGAAAGCTTTGTA >264 IKAGCTGSCTTCAACTCCAA «265 CTACCATATTGCATTACTTACCT >266 lAŚCTIACCAGTaACACAAGAne^^ >267 (CCATi^CCAGAGAACGAAGAnGGTACAGCGGCAGr :CA e268 jCGACCTSGACTTGCTGAGACTGAGlGACTCGACGCTC

,..............lAAAGAGCAAgGGCTGACT >269 AACAAAGCiTTCTCAAAGAGCAAGGGCTGACTCTGCC ί GCTGTACCAATCAGAAAGCTTTGTA |e270 AACAAAGĆnTCTDkAW5tó'^ | JGTACCAATCAGAAAGCTTTGTA >271 GCTCAAGAAGCATGTCATGGTA |e273 agccagcagtccacagaaaaacggagcaaaatataa ...............iAMA......................................................................

]e2?4 iGCATCACCAGA6AAC6AAAAACOGAGCAAAATAIAA j iAATA_____ >275 iCGACCfGGAĆTTGCTGAÓWTC^ ί................iatgtatcagaagtctcaaaat ..........................

>276 iAAOWAGCTfrĆTCTATÓWAAGTĆTCAAAAT i jTATTTrGCTCCAGAAAGCTTTGTA >277 iAACWGCmCTGTA7(^AAGTCTC4AAATATTTTA| : iTATTFTGCTCCAGAAAGCTTGTA I >27S -GTAAATAGCTGCAAASACCACA >279 iCTTCTTCAGAGGTATCTACAACT >280 ;AGCCAGCAGTCCACAGATGGAAAGTCAATGCCAA >281 :GCAT«CCAGAGAACGATGGAAAG7CAATGCĆAC >287 iMACCTGGACTTGCTGA-......................... ί : GGATGACrGACTBACTGACTCATATACTTCAlCTTCTA Ϊ h— ’^ggacat , j >283 FAACAAA6ĆTTTCTACTTCATOTCTAGeAi5ifrrs5cA| (TTGACTnsXAAGAAASCnTGTA j _e2S4 ;AAÓWAGCnTĆTA’crr[>rcScTAGG^TCTG^

i.......... :TTGACTTTCQiiA6AAAGCTTT&TA !

.................................

e285 >mGCTC5TA&5AGa:ACA ................. ?

'ί2^'^β^ΠβΑβΑΟ«?Λ«Τβ.................................. j >288 ^«O^GCGACTGGATiSA ~Ί ¢289 ĆCACĆCCAACTĆCACCTACT......... i >2M ^G6freWCATA^mAfi“.................... i >291'FAGGTCCraCTCCĆATGTGT ............. 1

.................... ............

PL 237 080 Β1 *293 'CTGCTGGSAGGCTGGATAG| *294 iCTGAGncrCACCrcTGCTfiCT *295 iCTCGATGCrGGACGTCTGC T *296 leGCCACGAACATGCAAGTG' *297 fTCCTACTTCAAATGTGTGCAGAI *298 iGAaGCGGTCCAGGtaGTtCa *299 ^:GCTCTCATTTTCCATACAGTC4GI *300 -CCCftGBAATCATCmACCAGI *301 tjA<5^^0ĄTGA^~j>CA~_ “i *307 CCTGCAGCrcrCATnTCCATACA _e303 !CGCAGGTAfiAGAGGAACACTI

Ιρ3Ο4 ίΚΤβΤΛΑΜπβΑΛΧΛβΤΤβi *305 AGTTCTCACCTGAGSGACCTTCCG “ *305 GACrGACEGAGCCCAACTGCGCCGACCCi ¹«307 AGCTGASGCAAGACCGGAfiACTi *308 GCnTTCTTGACrGCACGTaAGCCSCGGCC| *309 ACrmOGCCCASGCATCGCSCACGrCCAGOCŚĆ ”] *310 CTCCTCCGAGCACTCGCTCA 'j *311 ITrTArrTGAeCTTTGGTTCTGCCA!

*312 ^;CAGGGGTt»CCACATroGCrA *313 CTGGATCGGCCTCCGACCGTA *314 C6AAGCGCTACCTGATTCCA!

*^15 :GGCGGCTGĆGGAiXAG* *jGGGGAGA!

*3?6 ifOTcecĆTcr&sTccecAĆccGcci *317 AGCAGfiCAGeeSTAGCGBCGBGGA *318 rceccGci^EiACCGCTGCCTGCi “ *319 GGCGGĆTGĆGGAGAGG6GGAGA *320 TCrCCCCCTCTCCGCAGCCGCC *321 AGCAGGCAGCGGGCGGCGSGGA ~ *322 iTCCCCGCCGCĆCGCTGCCTGCT *323 GCAAGTTCAACATTATTCĆCTI *324 iGGGTTCCAĆńTAABGTTCTCAl ί^ϊΐ'Ι^αΛβ&β^^ *326 GCATCACCAGAGńACGnGTACTGAATnTAGAKAT 1

[_ iG I *327 iSAaTGGAtnTGCTGAGTCAAATCTTGGAGTGCCCA j • __AAATCA ______ *328 lAAĆAAASCnTCT j ;CTTGGAGTGCCCAAAATCA5TAATaAAAATrCAGTA i ' iGABAAAGCnTGTA *329 iAACAAAGCTTTCTCTTGGAGTGCCCAAAATAGTAATC ΐ TAAAATTCAGTACASAAAGCTTTGTA j

....... ............................] *331 TACAAAGGT-CCATTSCCACT ..................................!

*332 [AGCCMiaCTaCAci^ *333 iGGATCACCAGAGAACGASTSATCrrCTATGTATGCAG ί *334 ''CGACCT&SACneCTGA-'....... .....’................

L_______iGAOGĄCIGGOTCTĄAAAAęTOTACA *335 iAACAAAGCl ΓICI ;GTCCTAAAAACTCTTACATTGCATACATAGAAGATCA i 'GAAAfiCTTTGTA *33^ ^C^GCmCTOT i

[ .....; CATAGAAGATCABAAAGęnTGTA _ I _ ”Ί *338 TAOUAGGHcdm *3W ie^GOierócA^cii^GCTAncATTAccTAC । *340 1^TCAO>GAGiŁACGCATGGGTATTCA1TA^ i *341 :M«CTMAmGCri^AeGCT^I

;......iGAirrręAGG.............

*342 Aacaaagctttct iCACTnCGGATFnCAGGGTAGGTAATGAATACCCAA j iGAAAGCTTTGTA_ .»343 'lAAC*«£cnTcr’““............

’ icAcmcggattttcaggataggtaatgaatacccaa j___.jGA^CnTGTA _ .......

*344'‘iCACCrGAG^GGAAGTCA’'’ ~ . ] ; e34^~lGAGCTGTCCCTCAGTATCCATΐ *346 'CTGAGCCTTrCACraTTACCA ”:

e347 IcCAGGTTCAAGTGAnCTCGTi *348 ŚĆGA<XrGGACnisĆlGAGACTGACTG>CTG^

[ iAGAŁTCTGCCTCAAAξ *349 ;CGĆAnCAGACAATCACTATCT ’J ;e350 1 *351 TGCCAGCASTCCACAS’j i iGGAGAGGTAAAGCTGGCTTTCGA^ *3Ś2’’’lBGAf<^2A^JK^A^GCTAA^ ϊ _ JCAĄ.

*353 ŚĆAfGACĆkGAGAAĆGĆGAGAGGfAAAGCTGGCTTT' ίiCTA *354 tcGACCTGGACTTGCTGAGCGATGGCTATGGCATATG&i (GCTACTTTCTTAGĄTGTTTTCCTCTj *355 ’ *A’Si«e(T^^ :CGAAAGCCAGCTTTACCTCAGAAAGCrrTGTA ] *356 '-MGAMGCTTrCTGGCTACnTCTAW ! iASAAA&CCAGCTTTAŁŁTCAGAAASCnTGIA | *357 iAACAAAGCnTCTGGCTACrnbTACATOTTTrĆCTCT I ; [TOAAABCCASCTTTACCTCAGAAAGCTTTGTA j *358 feSCTĆrrCCATGAACCTCAA I *359 iGGTAGATCTCCTCGCAGCAj *360 jAGCCAGoiGTCCACAGA’............——————j ‘_________jŁATCAAAGCCCCAGGCTACAi *361 'GĆATCACCAGAGAACG A| | iCATCAAAGCaCAGGCTATA _i ί«352^Γ&ϊίσ®^

J*353' iAACAAAGÓTTCT.............................~™ i iGTACnSATGTOTGTrTGTAGCCTGGGGCrrTGAA I

...........JGAAAGCTTTCTA________J *364 ;AACAAAGCTTTCT iGTACTTGATGTGjTGTTTATAGCCTGGGGCTTTGATA ;

iGAAAGCTTTGTA r *365 iAGAGGAM^lGAGAGTSSTABT i *365 :CACAGAĆCTCACGSACATĆA ’= *367 iAGCCAGCAGTCCACAGA} iTAATSTAGCGAAIAGAATCG__ Ϊ *368 *CATCACCAGAGAACGA “|

[ _ TMtgtagcgaaiagaattgi *369 iÓSAttfGGAOTGCTGtóAC^ . irscGcrc * le370 iAACAAAGCTrrcr “I

I ICACATTGGAAGCTOCGCTGSATTCTATTCGCTACATA ?

i iGAAAGCTTTGTA;

*371 lAACAAAGCWCri

I ICACATTGGAAGCTGCGCTCAATTCTATTCGCTACATAGj ;__iAAAGCTTTGTA!

*372 iACUCUUUGUGGCUGGGGAGGGGGTT;

*373 iAACCCCGJCGUCCCCAGCCACA;

*374 ILIAGCGUCCGCUCUUCAUGCGUGOTT *375 iUGUGGCUGGGGACGAGćGGGTT i «376 iAACCACgTaUgTaGAGCGGACG CUA *377 IUCACACUCCGCGLJCGLJGCCLJCCUGTT *373 iAACAGGAGGCACGACGCGGASUGUGA *379 iUCGUCGGAGCflGAĆGGGAGUyUCUCCJCGGGGUC ś

I !GGAcjCAGGAGGCACGCGGAGUGUGAGGCCACGCA^

S IGAGCGGACGCUAACCCCCUCCCCAGCCACAAAGAGU :

ί iCl/ACAUGUCUAGGSUCUAGACALG *380 iAACCCCCUCCCCAGCOkCAAAGAGIJ *381 'UCUEAJGUGSCUGGGGAGGGGSn ~ 4 *382 ^!CCCCOJKCCAGCCACAAAGATT *383 'GACAAAGCTTCACACTAGCAATGGCAAAG ’ ^384 łAGTGGGATCCTTGTAACATAACTGCGTGCT' *385 iGACAAAGCrnGACAGTTGGGTGAAGTfGC *386 iAG^GAłcCTTGGĘTTCCAGTCFÓTCĆAGT *387 iGACAAAGCTTGTfAAATGCAAACGCTGCTCTG **388 iAGTCGGATCCTGaGAnWG&CrrCCCAA *389 iGAWAAGmcrArGTCAGCACCACTGTGA *390 AGTOjGATCOGGCCAnCCTCCnCAGA *391 iGACAAAGCTTCCTGGCATCAGTTACTGTG i _e392 ITGCfGT!GTCCTĆCAAGCTĆT :

e393 iAGASCTTGGAGGACAACABCA “i i e394 iGATGAGmeAACrnCAAAAGAAAACAGC'.........ί _;e395 iGCTbl I MU 11 IGAAAGTTCAAACTCATCΊ *396 iCGTCTGiaifca^^ e397 : ATOSAAGGCCKGGTAW^TGACTCTGAATGTCCC' *398 iCTATOCCATŚBCCCTSAGTCAGCrCCATiTSG”;

p399 iTGACTAAGCrTACI&lUjGGABAGGAATCCT ¹ i e4Q0 ilGAttCCAGAUGCGGCUGCCij' e401 ^; ugacccćamug7o'gćggćugcSji e402 !AG0cagĆcgcaoc^ e4Q3 iAAAAASAGAAACUGUUGeGASAGGMijCGUAiicU ' 'CUWUOUCUUCUUUCAGCCCOAUCCA^ i :v^uvuutiAAtUUUCCAUCAGUUCUUCCUUUCUUU ’ iuUCCUCUCUAAGCCUUUBCCDUBCOCUGOCACAGji iGAAGUCAGCCAGAGUGGGCUGIAJAAACUOJGUG ; iAAAOUUGUCAUAAGGGOGliCAGGUAllUUCUUACIJ^! ;G&CUUCCAAAGAAACAUAQAUAAAGAAAUCUUUCC ;UGUG6aJUt£CUUGGCASGCUGCAUU(2A6AAGGU |cucjcaguogaagaaagagcuuggaggacaacagc iACAACAGGAGAGUAAAAGAUGCCCCAGG&CUGAGG kcUCCGCUCAGGCAGCCGCAtafGGGGUCAAUCAtJ t !4CLJCACCUUGCCCGCqCCAUGCk!CCAGCAAAAUCAA!

t 5GCUGUUUUCUUUUGAAAGUUCAAAC1JCAIJCA4GA I ! muAUG i •e404 ^AGGCAGCCGCAUCUGGGGUCA !#405 iTGACTAAGtTrACTGnGGGAGAGGAAKGT *40$'jcTATCCCATGGCCCrGASTCAGCTCCATTTGG *407 łATCGAAGGCCGCGGTAATAGTGACrCTGAATSTCCC l *408 ^η CGTCTMATCCnACGMJCGCWnl·^^ *403 iCTCCGTCCCSAGCTCTTCGSaSAGC i e410 [GCTCCCCGAASASCTCGGGACGGAG »41’ ^GACTAAGCTTCGCCAACGCCACAACTAr. I «412 ICCACCTCCTGGATGGTCnT ' »413 ’ccrCCTĆCĆAGTGĆCTGA...............................................' e414 fCAGCCre&SAGCATGrrCA ( e4i5 [tggtagtgtgggtctctgctg ’ !

g41fi TcTAfĆHLATGGCĆT^ĆTCGAATAAATfcAĆTG^''..........ΐ e417 TcĆATGAĆĆAĆĆfTCTGTATCTGC^-' ' ' ' ' j e413 1gagtg<^sctagg«caag..... 1

..... ............ i

..... ......-.....j ^^'n^S^GGCCAArACTAGIG j *422’1itAAGGiCtó^TAAAGAĆAGG ....................”'Ί

......

Η2Ϊ7ί*ΑβΑΑβΐ^^ 1

6425 ΙάώττϊτΑτίτΑΟΚΐπ^^ ................... ’ί ¢426 jGATGATGAfraTOGTSG^ __________£______________________________________ ______ ; _e427 fTTAAACAAĆAAACCTATTTTTAęTGG !

e428'pCTMGiSS^^ 'gagta e429 UgtSwcttcmmć^^ «430 IgagSc*^^ .............................

¢431 iGACTClCGAACCGGAAACCA ~ ...............

......... '7 ~ e433 jGA^aOW^^ ;

l«434 ^lei^CWtóeĆTTAGATCGAiCTGATCGCACAA i ! ?cc _______ ;

ie435 iATGAGACTTCTCĆTnTATATCT :

je436 iWATATAAGAGGAGAAGTCTCAT ’ 1 ie437 iAGTATAGAAATGCTGCCAAGTTGT ............ Ί

...........................:

*439 jAACAAAAGCAAAACAACAAATGA ........................] *44Q jTCATnGTIGTnTGCTTTTGTT J gii- JJCUSGCrAiGUSACCGAJAU^^CCGT- ί *442 li^aĆCAĆGU^ j e44£]Atóiwi«^JCMiWCGuGGCWGA^ «444 lAACGGACA^ ' i «^57ćSuSSi^AijSłO^ Ί «446 !CGGACAUMJĆXGUCACGTT^-........... Π

Sj^FuGGC^i^^GGAiLMWOTT...... !

'e44g‘lMCAUAUCCGuEsUG^ Ί e44^AA6TGGMSĆTCAi^^ ί «450 AGGTGGMGACAIGAGACrĆCACTT i «451 *GAGGAui^^ j

«452 e453 «454 «455 «456 «457 «458 «459	TDAATCTCATTAG ii i h iłctct AAGTGGAGTCTCATGTCCCCCACTTTr ΚΑΗΡΙΝΑΖ2Χ 3T0WWAN6 _ ____________ AAAAGTGGGGGACATGAGACTCCACTT GACUGGGĆGACUCCGĆGGGA UCCCGCGGASUCAUCĆOCCŚGn' AACUGGGGGAUGAOJCCGCGGGA UCCCGCGGAGUCCCCCAGUC GUCCC6CGGAGUCCCCCAGTT
e45C «461 e462	CUGGGGGACUCCGCGGGAUT GGGGCGAG&CGGAGCGA&GCTGGAGGCGCGSGAG ggcagcgagagwlisusguiijcmcgcacaggag ACC_ GCACAGG~CAGCCTGCATACACrrciTrr(XTG^^ ACATTATTTAAAAGCATGGCAAATAGTAATGAGACAG TGTCTTCTTCATTAGAACCTTAGGAGTCTAGTAGATTT CTTCATCTCTATTTGTTGnATTAGTAGCCAAACTGTG CAAAAAACACGGTCTTGAGAAATGACAGCACAGTATC TTAGAGGGAAAGGAAATGTASGArGCCAGTGTGGG GACAAATTTCrGAnGCCAGTGATTGTTGTGAGCATA ACAATAATrrCATGAACATTAAAGCCTCTATTGAGGG GAGCTGCAGTTGTAAAGGAAAAAAAATGGTCCTGAA CATTTAAAjmTACACTGGTGTACATCATAATĆAAACAA AGTAAACAGAAAAAAATnAAACTTTGCTAAAAAAAA AAAGCAGAAGCACTTGATCrTTAGGAAGGCACGCAG ΤΤΟΟΓΓΑΓΓΑΤΰΑΑΤίΑπτCTAGAGTCCGATGCAnr TCAAAGCCGGTTACAGTCATTACGAAGCACACCCnG tgaggtaagtgtatcatcaccttt ggfcatawtaa AAAAGCT&AGACGCCGAGCGATTAASrCACTCGCCTA aggagaatgagtuacgtcaagagtutmttgacc CGGCCTAAA6 actccagaccatcagtccag G GOTAG TCAGCGGGSCCCGGAGTeGCrrCCCTGfiCTGGCATCT ogacttaggctatttccgtgcacgiaaaagcggaata T1GGAACGG TTGCACAGAACFI CC ΑΑΑΤΛΑ FiTlTACC GCCAOGCAAGATTrAGCCCtGAGGtcrfAATCTCAGG ArnGGSACAGTAAAAGCTGTCGTCCCTCCCCCTCGTC CAGCCGGTGGCAAGCGGGTACTGCGGGCGGnCCGT CCGTGCCCrTTCGCAGAAATGGCAACGAATGACCACC AGCATTAG<TGAGCCAGBCQACGTGG3AGGGTTGAT rGCCTAAACGACTClGCATCGCęGCCTCTTTTTGAAAC rAAGAGAAAATG6TGGGAGATCAAAAGAAAACIAAA rAAACACACAGGCAACnGTCCFCGGACCTCAACTAA GCAAAIGAAGCCTTATTOTGTGTGCTGAGCCTGCAGT rCCCAACCTTCCSGGSAAGATGGGAGGACAGGGCGA CAAAGGGCACAGTAGGCTTGCCTGGCAGTAAGTGTG ACCSCAGCTATCCAGGCSGAAGAGCAGAGGACTGAA
	ACCACCCTCCAGCAAGCGAeTSTCCGCCtreGnGAGA ACCGCGCACCCTACCCAlCSGCCACGrGACCAGICCr ΤΤΓΤΑΑΑΑΑΑΑΑ·ΤπεΤΤΤΑιΧπΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAGSTGSfiGGAGAGACTCCACn CCCAGAAGC ^CT«rrrACTCACGCACCCGCAGTCrrGCCCACGFG CCGCCAGGGCCAAACGGACATATCCGTCACGTGGCC AGAAGCTGGCGAATCCGGTTTGAATCTCATTTTTnCC TCnACCCCCCCTTCTGGAGCGGnGTGCGATCAGATC CATCTAAC
«463	GAGTATTGCCTTTGGCCCCCiCCCCCACGGGTCCCCG CGCTCCGTCTTCCTTCTGACTGGGflGACTCCGCGGOA CĆGCGnOCCGGCGCGCACTGTACCCCrrGCCGĆCCĆ TTCCCCTTC
e*ł64	TTTCTTACTAGTAGGGCGAAGGTGeCTTT
>465	CCACCGCGGGAGGTACCAG
e466	CGGCAaSCTCTTCAGCAC
e467	CCGGAATGGT6GGCAGAT
«468	CGTCTGGATCCAATGTCCATCrCAAACTGTG
«469	AGTAGCCACCATGGGTTCCGGGGGCAGCAGC
«470	GTCACCTGATnAAATGTCCATCECAAACTGTG
e471	G CATCAG TGGAG G CAGCACAA GG A GG
e472	OCTCCTTGTGCTGCaCCACTGATCC
e473	TAGTSCTCCACCACAtGATfiGCrG
«474	caoccatcgtgtggtggagcacta
«475	TCCAGCCTCGCCTATCCGCCTCGC
«476	GCGAGGCGGATAGGCGAGGCTGSA
e477	IdGĆACĆĆGCGAAOAACCLTCUCGTT
«478	AACGAGAGGlfUGUUCGCSGGiJGCA
«479	GCACCCSCBAACCUCUCerr
e480	CGAGA6GU0CGCSBGUGCTT
e4Bl	GCCTACTACATCCCreSAG*
«482	GGGCTTGCACCTGGATASA
C4&3	CBACCTGBACTTSCTGAGATCASATCCCrSSACAGSC
«484	CGTCTAAAACTATGenCCCAA
«485	GGTATTACTfiGCTCTTCCTGAG
«486	CGACCTSGACTTGCTGAAŁCCAAIAAAAG1 GALI UC
	AGC
«487	SCCTC7GGGCTAłTA6GACT
«488	CCCCATIATTTAGCCAGGAS
e489 e490’ e491 *492 S493 *494 :«49Γ «496 *497 «498 *499 *500	GSCGCTCAGCTCCGTTTGG frCWCCftĆCAGCTĆCTCCA TT^AeA1CT^A^COA£^AG6t^C0SMTC TGCGATTTCCTCGAGGCCACCATGGACAiCACCGA TTOW™ AGATCTGTAAGTCGACTGAATAAGAAGGAGATGTCA GCTCGAGGCCACCATSGACAACACCGA __ nCAG................ ”............. ...................... AGATCTGTAAGTCGACArACTCCCCCACACACCTrAC AATCTŁSAGGCŁACCATGGACAACACCGA . CAGTTATCTAGATCĆGóTGGA ggcaccżgtcaaggćtgao ggtggtgaagacgććaetg” UGWUGGUUtra^ ’ AACC^CUĆĆC(>^ ............................. UGAGWSUUWG^GGGAĆ^T'™'' 2...........2 ^ucocgaccgaaocaćuca

*501 iAGGAUCCCAAGGCCCAACLICCCCGAACCACUCftGGG L. lUGOJGUGGAŁAGCOCACaJASCUGCAAUB ........J *502 *GAGUGGUUCGGSiAGUUGGGCCTT *503 iAAGGCCCAACUCCCCGAACCACUGA^ ’ ’^Ί * 504 ^«^^^^ .......

* 5θΓ^<^ί·^ ......’2 1..............

* !^7 -A7Ć(^WGĆa;^ *508 iGGABTCATATGGŚSAATGAG e509'TGCGA3nAT^GTGTG’AG'c~' *510 GGAGAAGGCGTCCAAGCA *511 LTACTCCTCCCAAGACCFGTGTTC *512 jcTCTATGGGAAGGACCAGCAG *513 jGGGGAGffnCACGTACTCAG *514 [GGAGmCGCCGCCGCAGT, *51S kGGGGTAAAAGCCACACGAC l *516 rCCGGTCĆĆÓ4ATCTC^r 1 *S17 icAgcCcaaggcacctgag™ i *518 WGęACCTCCGCrSCAAATAC!

*519 ^rAGGAGAATCTGGGACTCTGGT| *520 ^CTCACTGTTTCCCGTrGCCA~i *521 jCCrGAlCTGCTirGTcrK ~” r *522 {ACGAAGGATAGIGGGTAGCTgai *523 iGGTACGGCIGTCAtCACriAGF *524 fGCACTGACUCCCACATTCCΓ *525 ^CGTGCCTATCAGAAACCCAAGi *526 Iatggtgcatcigactcctg~ *527 fCTeGGTTrCTGATAGGCAOTC ~i *528 ffiCTACTTATCCCCrTCCTATG *529 tOCGCTAGAATCCAGCTACCA *530 jTGGGGACACTGGATCACCTA *531 GGGGTCTGGACGCAGAAAG ¹ *532 GACT&GAACTCACCCrrCACA= *533 ĆACASCCTCAGCCACCTGT~ *534 GGGTATTTCCTTCCTCCAAKTi *535 TCAGGGAGUGCrSGTGrCi *536 'GTTGAGATGGGTGAATGAGGAĘ *537 iCTAGCCACGTttZAGGGTTCΊ *538 jGGGGAAGAGCAGAGATATACGT ' ......

*539 66AGTTCGGGGCTCCACACGGCGAC>

*540 fGTGĘATGACCMCTGTTCGTGTTCTATGAT . I *541 -togcgtcctgattagtgatg.................................... 1 *542 'CAGmWGGCTACAATGTGATG _1 *54J LAGCTGGCCĆAAAĆTCACGeTC>

*S44^UG^GAGAUG^U3aScÓGJ^ ί &S4S iAAAGUCACCACCCAUCUOkGCAj eS45 JjG^UGA^UGGGUGBUGAObn ί *54? ^AŚMĆCFAGAGikcM^!

:GCAAGCCCAGAAGTA7CTGCAATATCTACGATG i *548 iAAGGULFGACiAGLfOCCCAUCIJCAGCA............1 *549 iAUGCLGCUAGACUGGUUBAAALJGGGUj *550 iUGClWĆUAGACUACDGGOUGAAATT'i e551 iMUUUCAACCAGUAGUCUAG^ I *S52 :5agaacc^agccuaagg^iuasgcucatc^ iUCAAGCAGUCLFAGCASCAUCOGCAACAUCUACAAUj :G!

*553 iACCCAUUUCAACCAGUCUAGCAGCAŁT' !

*554 CAGUGUCGCCUACUACCUGllJŚLf’ ί *555 łUGUCGCCJACUACUACCUeuUETTΊ *556 !AACAACAGGUAGUA6UA6GDSACA *557 ^ACAUUCUAACUGCAACCUULfOBi^CCW^ GGCACAACAGGUAGUAGGCGAĆACuGujCGuglfL· i

GUtAACAUG *5581acaacagguaguaggcsacacug *559 'AAGCUGAUCAGGuĆĆaaaGGACTT ’ e560 I *ltól~UGAuTwGUĆ^^ I *562 IcACAUUGUUCLGAUCAUCUGAACAOCŁGĆUAUiji l I GAA&A&AAAGA0C4GUUAA&UCCLFUUSGACCUGA ! UCAGCUUGALJACAAGAACUACUGAUUUCAAaJLftU iuuggcuumuucucucggaaacgaug

Γβ563 iAAG .....................

e564 i^^^łiGAGAUGGGAGAUSufr .....!

*565~!hOÓkGAGAGAUGaJ$Q$AGAUGUi>Tr *^6~'|ΑΑ£Άΰώΐία^^^ Ί *567 iLGCGCAMCUCUACUAUCUGCUCWMn:

*568 lAAUUCABAflCABAUASUAGAflaiwĆSai’ .......

*569 luecścAGGcuajcuAUĆUGĆLrrT· :«570 ^aagcagTuagagagizugcgca

V71 ^;UUUUGUń^UAMUGUGAGGAUbV^^ i iCOliCUUCUGJUUGCUAAAUCUCACuGUCACuGCyA ^AAUUCAGASCAGAUAGAGCCUGCGCAAUGGAAIMA jAGUCCOCAAAAUUGAAAUGUGACAUUGcUCOO^AC i lAUCUCCCAUCUCUCUBGAUUUCUUUUUGCUUCAU

I lUAULJO^GajAACCAAUUCAłjyiAJCAGACUlJEJGlJ i jAOJUCAGAAGCAAUG *572 [mÓLcucccaucucucuggatt ;«573 SucCagagagaugggagaugtti ]

ΐ«^|ΰβΛ6««Αΰβΐ^^Ϊ *576 lUOMGCłEAOeUA&G^ * i le5?7 i^OUijUcijAUUCWiji^ ΐ jeS78 iG&UAC^GCCLiGCeUG^^ GCU UUCACAAAaCCACCCACAAAGCAGCADWBUU i iLlUUAAGACUUGMWUUUCUAUUt^UOeS^ r i !AUAALfACCCACCtUGACCUGCUGUAAAAGACCO6G

I Iaacaaacaaaaaug ___ ______________i

ns:«r ΙΛ Φ; r^·co:a>.co cosec »;co ΟΊ; ol; m s j lo i tr.. ' φ j fll | B) · ŁJ aj : ŁhJ CJ ‘ O	AGUUUUCUALIUCACAOCGSOCUCA UUUUCUAUUCAOiijreGĆcrT GGCCCAUGliGMUAGMSifr’' tAjaicuttóĆAÓcajijficcuc^ ACUUGCWCUGUCCCCUCCULtCU........... .............. u^ciuaTuctii^ AACAGAGGCAAGUAGGAUGAUGAGA UGCU UCUG UCC CACCC u ęcu u TT
e5S7	AAAAGGAGGGUGGGACAGAAGCA
«588	uuggccaaacacacauccaggaggggaacagaagg AGGGGACAGAAGCAAGUCUGCAGAUCAGAGGAAAS aagaaagagcagaggasggagauuggaaguagaa augcugaaugcagaggoaaaaagcaaaaugaas gacagsaggauuaaacagacagagscaasgauga U(jMM3AGGAGCA5ACAGCAAGAAUGAAAAGCAGA aaauacaauagaggaaaugaagaaaaguaggccug CUGGAGCUASAlGAUSAklGUGAUGGAMUAGAAG UA
e&89	AGACA64GGęAAGGAIjęAUGAGAGAG

PL 237 080 Β1 iCTGCTBGGAGGCTGGATAG| >294 ^!CTGAGrrCTCACCTcTGCrfiCT >295 iCTGGATGCTGGAGGTCTGC Ί >296 iGGCCACGAACATGCAAGTCl

Ie297 ;TCCTACTTCAAATGTGTGCAGAl >298 iGMGCGGKCAGGTAGTTCAi >299 ‘GCTCTCATTTTCOATACAGTCAGI ie300 .CCCMieAAfCATCTnACCASI ie301 iGAfJ^ĆAGATGACaiTGAC*.” _ _ i

CCTGCAGCTCTCATTTTCCATACA >303 !CGCAGGTAfi*GAGGAACACTI >304 CCTuTAACSTGńACCACTTG;

'6305 AfinCTCACCTGAGGGACCTTCCG “ e306 GACGACEGAGCCCAACTGCGCCGACCCi

J «307 ^AGCTGASGCAASACCeGAfiACri >308 GCnTTCTTGACrGCACGTaAGCCSCEGCC| >309 'ACrrrTOGCCCA&GCATCGCGCACOTCCAGCCŚĆ ”] >310 :CXCTCCGAGCACTCGCTCA ^—। >311 'lYrTATTTGAeCTTTGSFTCTGCCA!

«312 GAGGGGTGCCACATTCGCTA >313 CTGGATCGGCCTCCGACCGTA ’e314 CGAAGCGCTACCTGATrCCA!

>115 GGOjGCTGCGGACCAGACGGGGAGAI >316 ifOTcecĆTcr&GTccecAGCCGcci ‘6317 agcaggcagcggtagcggcgggga ieilg rccecGCćGciAccccTGCCTGCr ~ >319 GGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGA 6120 TCrCCCCCTCTCCGCAGCCGCC >321 AGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGA ~ ^;e322 iTCCCCGCCGCĆCGCTGCCTGCT >323 iGCAAGTTCAACATTATTCĆCTI >324 iGGGTTCCACATAAGGTTCTCAi k-.......--------------------------------... i >325 iGCATCACCAGAGAAOGTTGTACTGAATnTAGATTAT ϊ j .. iG ___ i >627 kGA(XTGGAciTGCTGAGTÓUATCTTGGAGTGCCC* Ϊ •__iAAATCA >328 AACAAAGCnTCT ί ;CTTGGAGTGĆCCAAAATCAGTAATrtAAAATrCAGTA i ! iGAaAAAGCnTGTA_ >329 iAACAAAGCTTTCTCTTGGAGTSCCCAAAATAGTAATC i

TAAAATTCAGTACAGAAAGCnTGTAj

Fę330'1Scf^^....... 1 >331 TACAAAGGTTCCATTGCCACt | >332 }agĆcagÓ>btccacag ct^tckctatgtatscmtI =«333 iGCATĆACCAGAGAAOeASTSATCrrCTATGTATGCAG j

Fe374.............. 1 !_______iGAOGACIGGOTCTĄAAAAęTCTTACA __' >335 iAACAAAGCiriCl '' ;GTCCTAAAAACTCTTACATTGCATACATAGAAGATCA ί

SAAAGCTTTSTA

CATAGAAGATCAGAAAGCTTTGTA I >337 GCTCTG^AnCAAAGTCTGĄΠ >333 TACAAAGGTTCCaTTGCCACT >339 AGCCAGCAGTOCACAGCATGGGTATTCATTACCTAC ! i e340 7g«tcaccagagaacgcatgggtattcaitacctat i «341 ‘CGACCTGGACTTGCTGAeGCTGACTGCAACACTTTCG !

i ;GATTTTCAGG ________ >347 AACAAAGCTTTCT

I ‘CACmCGGATmCAGGGTAGGIAATGAATACCCAA iGAAAGCTTTGTA >343 ‘AACAAAGCTrTCT ’ iCAGTTTCGGATTTTCAGGATAGGTAAtGAATACCCAA i___ίβΜΑβαπβτΑ. ......

>344 ^aĆCTGAGĆTTGGGAAGTCa’’ ~ . i e345 ?GAGOGTCCCTCAGWCCATΐ >346 'CGACCCTTTCACTGTTACCA :

«347 XCAGGTTCAAGTGATTCTCGTi

6348 sCGACCTGGACTTGCTGAGACtGACTGACTGGGAGTG :

^! AGACTCTGCCTCAAA ξ >349 CGCATTCAGACAATCACTATCTJ >350 GaGATGATCTTrATGGĆTACr ..... J >351 TGCCAGCAGrCCACASi

I GGAGAGGTAAAGCTGGCrrTCGA^ «352 ieCATCAzfAGAGAACGGGAfiAfiCT^ ^:CAA, >353 iGCATGACCAGAGAAĆGGGAGAGGrAAAGCTGGĆTn' iCTA =«354 CGACCTGGACTTGCTGAGCGATGGCTATGGCATATGG GCTACTTTCTTACATGTTTTCCTCT _e355 >ACAMGCmCTGGCTACTnciTA&7Gfm lOSAAAGCCAGCTTTACCTCAGAAAGCTTTGTA ί e356 AAGAAAGCmciBGCTACrrTCTTACATGTTTTtXTCTj ‘ fAGAAAGCCAGCTTTACCTCAGAAAGCETTGIA _ l >357 iAACAAAGcrrrCTGGcrAcrrręaACATGTTTrcCTCT;

TGAAABCCAGCmAOCTCAGAAAGCTnGTA e358 ;GGCTCrrCCATGAACCTCAA >359 ‘GeTAGATCTCCTCGCAGCA i«36O ‘AGCCAGCAGTCCACAGA1 jŁATCAAAGCCCCAGGCTACAI >361 -^GCATCACCAGAGAACGA~1 : jCATCAAAGCttCAGGCTATAi >352 jcGAÓTOSAOTG^^ >353 Imcaaagct^ i jGTACTTGATGTCGTGTTTGTAGOCTGGGGCTTTGATA;

iGAAAGCTTTGTAI >364 :MC*AAGCffTCr ‘ί ‘GTACTTGATGTCGTGTTTATAGCCTGGGGCTTTGATA;

iGAAAGCTTTGTA f >365 :AGAGGAAAC1GAGAGT®3TAGT ’” i >366 CACAGAĆCTCACjGACA-CA’ Ϊ «367 ‘AGCCAGCAGTCCACAGAj iTAATSTAGCGAAIAGAATCG__ Ϊ «363 jGCATCACCAGAGAACGA ~I

TAatgtagcgaatagaattgi >369 iÓGAĆCTGGAOTGCTGAGACf-BACACACAiTGGA^ ‘ iTGCGCTCI le370 iAACAAAGCT?TCT “:

I ICACATTGGAAGCTGCGCTCSAKCTATTCGCTACArA ?

iGAAAGCTTTGTA;

>371 lAACAAAGCmCTi

I !CACATTGGAAGCTGCGCTCAAnCTAnCGCTACAIAG;

;__iMAGCnTGrA!

>372 ‘ACUCJUUGUGGClJGGGGAGGGGGn;

>373 ‘AACCCCGJCGUCCCCAGCCACAi >374 ILIASCGUCCGCUCUUCAUGCGUGOT >375 iUGUGGCUGGGGACGAGĆGGGni >376^ΑΑΕί^ΈΐΙΚ!7ΑβΑθΈ^i >377 nJCACACllCCGCGUCGUGCaJCCUGn1 >373 iAACAGGAGGCACGACGCGGASUGUGA:

>379 iUCGUCGGAGCflGACGGSAGUUUCUCCJCGGGGUC i Iggagcaggaggcaogcggagijgugaggccłcgc*ui |GAGCSGACGGUAACXCCCUCaXAGCCACAAAGAGU :

iCUACAUGUCUAGGGUCUAGACAlJG >330 iAACCCCCUCCCCAGCOCAAAGAGIJ >381 lUCUUUeUGGCUGGGGAGGGGSTT

i ca r rai a ott: 601 m. ; 4J i ά> f U 1 a> i aj 1 Łi !	CCCCCUCCCCAGCCACAAAGAn GACAAAGCnCACACTAGCAATGGCAAAG AGTGGGATCCTTGTAAGATAACTGCGTGCT GACAAAGCrnGACAGTTGGGTGAAGTfGC ag^wccttgggttccagtcfótcćagt GAęAAAGCTTGTTAAATGCAAACGCTGCTCTG
e388	AGTCGGATCCTGCAGaTTCAO&CTTCCCAA
e389	GACAAAGCTTCTATUTCAGCACCACTGTGA
e390	AOTCOGATCCCAGOCCATTCCTCCnGAGA
£391	jACAAAGCTTCCTGGCATCAGTTACTGTG
e392	TGCTGT!GTCCTCCAAGCTCT
re393	AGASCTTGGAGGAĆAACASCA
e394	GATGAGTTTGAACTTTCAAMGAAAACaGC
e395	GCTt i i i i li i i IGAAAGTTCAAACTCATC
«396	CGTCTGGATCCTTACCAGCGCAGTTCCOkCCACTTCA
&397	ATCGAAOGCCGCGGTfiAT^TGACTCTGAATOTCCC
«398	CTATCCCATGGCCCTGAGTCAGCTCCATTTSG
«399	T<5ACTAAGCrTACTGTTGG6A5A6GAATC0T
«400	LGACCCCAGAUG CGG CUGCCU
e401	UGACCCCAGAUGAUGCGGCUGCCU
e402	AGGCAGCCGCAOCAUCUGGGGLICA
«403	AAAAAGAGAAAaJGUUGGGAGAGGMUCGUAUCU
	α^οΑυυυΓυυουυυΓΑοα^<^υζο^
	v?>uvuuGAALUUUCCAUCAGUUCGUCCUUGCUUU
	UUCCUCUCUAAeCCUUUGCCDUOCOCUGbCACAGJ
	ŁAAGLCAGCCAGASLAGGGCUGUUAAACUaJGtJG
	AAAOUUGlJCAUAAGGGOGliCAGGUAUUUCUUACIJ
	GGOJGCCAAAGAAACAUAGAUAAAGAAAUCUUUCC
	UGUGSaJUCCCUUGGCASGCUGCAUUCAGAAGGU
	CUCiJCAGUiIGAAGAAASAGCUUGGAGOACAACAGC
	ACAACAGGAGAGUAAAAGAUGCCCCAGGGGUGAGG
	CCUCCGCUCAGGCAGCCGCAOCIJGGGGUCAAUCAU
	ACUCAKUUGCCCGGGCCAiJGCklCCAGCAAAAUCAA
	GCUGUUUUCUUUUGAAAGUUCAAACOCAIJCAAGA
	UUAUG
«404	AOGCAGCCGCAUCUGGGGUCA
«405	TGACTMGCnACTGTTGGGAGAGGAATCGT
«406	CTATCCCATeGCCCTGASTCAGCTCCATTTGG
e4D7	ATCGAAGGCCGCGGTAATAGTGACTCTGAATSTCCC
	m·™ m». — ........ . ,
«408	CGTCTGGATCCTTACCAGCGCAGnCCCACCACTTCA
«409	CTCCGTCCCOAOCTCTTCGGGGAGC
e410	GCTCCCCGAAGAGCTCGGGACGGAG
Ϊ411	TGACTAAGCnCGLCAACGCCACAACCAC
«412	CCACCTCCTGGATGGTCTTT
e413	CCTTCCTCCCAGTGCCT&A
e414 e415	CAGCCrCGASAGGArGTTCA tggtagtgtgggtctctgctg
p416	CTATCCCATGGCCTGCTCGAATAAAnCACTG
«417	ccatgaccaccttctgtatctgc
Η18	GAGTGOGTSCTAGGACCAAG
e419	ggttatgatgtgattgctcaagc
«420	CCAGAATTACCTnTGGATCreT
e421	TGGTGGGGGOCAArACTAGIG
«422	TCAAGĆACAGGATAAAGACAGG
>423	GTCTCCAAAGCTATCATCACCT
«424	TMGAtóAĆAĆatĆfSAOrAnC-Ć
«425	CACATTTTATTTACAOTTTTGrńCAC
«426	GATGATGATCCAIGGTGGCTCGATCTGATCGCACAAC
	£ ...
e427	TTAaaCAaćaaaCCTatttttaotgg
e428	tctaasccgc&iccaacatggcgactgtggaaccggt
	gagta
«429	AGTGAAGCnUt^CA£TCCAGĆ{TGGGTA
«430	G AGCCCAGGAGTTTGAGACCAG
e431	GACTOICGAACCGGAAACCA
e432	ćCCAATGCOCITrGAATCTC
ί«433	GAGTGCCCATCTGnCTCTAGG
«434	ĆAl GTrGGCCGCGGCTfaGatCOatctgatcgcacaa
>435’	CL ___ ______________ __ ______ lATGAGACrrctĆCTCTrATATCT
>435	AGATA! AAGAGG AGA A5TCTCAT
>437	AGT ATAGAAATG CTGCCAAGTTGT
>438	AĆAACTTGGCAGCATTTCrATACT
>439	’aacaawgcaaaacaacaaatga
j«440	TCATTTGTIGTnTCCTTnGTT
	.....
>441	oocuggccacgugacggauauguccgtt
>442	ucuggcmcgugaugacggauaogk
e443	mcauauccguowcacguggccaga
«444	iAACGGACAUAUCĆGUCACGUGGCCAGAA
«445	CGuGACGGAUAUGuCCGTr
	............ ....................... ...
«446	• CGGACAUA LJCCGUCACGTT
e447	'UGGCCACGUGACGACOGAUAUOn
e448	iAACAUAUCCGUCGUCACGUGGCCA
e449 «450	AAGTGGAGTCTCATGTCCCCCACCT Aggtgg&ggacaigagactccactt

«451 :AGAGGAAAAAACTAATGASfiTTCA

«452	TGAATCTCA7TAG11 Η ί ILCTCF ί
e453 «454	AAGTGGAGTCTCATGTCCCCCAfTTTT KARPINA?2Xi 3T0VSRHANG_ _____ 1 AAAAGTGGGGGACATGAGACTCCACTT i
«455 «456	GACUGGGGGACUCCGCGGGA UCCĆŚCGGASUCAUCĆOCCAGIT i
«457	AACUGGGGGAUGAOJCCGCGGGA
«458	UCCCGCGGAGUCCC<XAGUC
«459	GUCOCeCGGAGUCCCCCAGTT
e45C	CUGGGGGACUCCGCGGGACrr
«461	GGGGCGAGGCGGAGOGAGGCTGGAGGCSCGGGAG ;
	GbLAGCjjAGAGeTTaeeeSeTGOAuLGCAOAGijAG ί Acc 1
e452	GCACAGGCASCCTGCATACACTCCTTTTCCTGGTGTCA‘ ACATTATrTAAAAGCATGGCAAATAGTAATSAGACAG ί TGTCTTCTTCATTASAACCTTAGSAGTCTACTAGATrT | CTTCATCTCTATTTGTTGTTATTAGTAGCCAAACTGrG i caaaaaacacggtcttgagaaatgacascacagtatc! TTAGAGGGAAAGGAAATGTAGGArSCCAGTGTGGS ί GACAAATTTCTGAnGCGAGTGATTGTTGTGAGCATA ! ACAATAATJTCATGAACATTAAAGCCTCTATTGAGGG · GAGCTSCAGTTGTAAAGGAAAAAAAATGGTCCFGAA ! CATTTAAAAZTACACTGGTGTACATCATAATĆAAACAAi AGTAAACAGAAAAAMTnAAACTTTCCTAAAAAAAA: AAAeCACAAGCACTTGATnTTAGGAAGGCACGCAG TTGCrTATTATGAATiATTTCTAGAGTLXGA7GCATTl TCAAAGCCGGTTACAGTCATTACGAAGCACACCCTTG tgaggtaagtgtatcatcacctttggitcataaataa AAAAGCT&AGACGCCGAGCSATTAAGTCACTCGCCTA AGGiGŁŁTGAGTCAACGTCiAGA(jTCATAGTTG4(X cggcgtaaagactccagaccaicagtccagggct^ag TCAGCGGGGCCCGGAGTGGCTTCCCTGfiCTGGCATCT ggacttaggctatttccgtgcacgiaaaagcggaata TIGGAACGGnGCACAGAACnCCAAATAAFinTACC: GCCńCGCAAGATTrAGCOTGAGGtcrfAATCTCAGG ! ArnGGGACAGTAAAAGCTGTCGTCCCTCCCCCTCGTCj CAGCCGGTGGCAAGCGGGTACTGCGGGCGGTTCCiST 1 CCGTCCCCnTCGCAGAAATGGCAACGAATGACCACC i ASCAITAGiTGAGCCAGBCGACGTGeSAGGGTTGATj TGCCTAAACGACrCIGCATCGCCGCCTCTTTTTGAAAC TAAGAGAAAATG6TGGGAGATCAAAAGAAAACTAAA; TAAACACACAGGCAACTTGTCCTGGGACCTCAACTAA GCAAATGAAGCCTTATTGTGTGTGCTGAGCCTGCAGr TCCCAACCTTCCSGGGAAGATGGGAGGACAGGGCGA CAAAGGGCACAGTAGGCnGCCTGGCAGTAAGTGTG , ACCGCASCTATCCASGłjSGAAGAGCAGAGGACTGAA.
	accaccctccagcaagcgastgtccgccgwttgaga! ACCGCGCACCCTACCCAlCfiGCCACGTGACCAGTCCr ί ΤΤΓΤΑΑΑΑΑΑΑΑΤΓΤΧΠΤΑιΧΤΤΛΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ : aaaaaagstgggggasagactccacttcccagaagc ctct-cgtfactcacgcagccgcagtcttgcgcaggtg i ccgccagggccaaaosgacatatccgtcacgtggcc ’ AGAAGCTGGCCAATCCGfflTreAAlCTCAr 111111 CC TCnACCCCCtCTTCTGGAGCGGTTGTGCGATCAGATCj CATCTAAG
«463	GAGTAUGCCTTTGGCCCCCACCCCCACGGSTCCCCG CGCTCCeTCTTCCTTCTSACTEGGGGACTCCGCGGGA; «GeGnCCCGGeGCGCACTGTACeCClTGCCGĆCCC rrccccrrc
«465	T7TCTTACTAGTAGGGCGAAG6TSGCTTT CGA£C(XGGGAGGTACCAG i
«466 e4G7 «468	CGGCAGGCTCrTCAGCAC 1 CCGGAATGGT6GGCAGAT j OlTCTGGATCCAAfOTĆcifcTCAAACTffris' ...........1
«469	AGTAGCCACCATGGGTTCCGGGGGCAGCAGC ;
«470	GTGACCTIiATnAAATGTCCATCTCAAACrGTS
e471	GCATCAGTGGAGGCAGCACAAGGAGG i
e*72 ^CTCenGTGCTSeaCCACTGATGC i
'ra i ts'i f»jf» Tri1 5' * l5 S ‘δ	TAGTGrtCCACCACACfiATAGCTfi 1 OMj CCATCGT6TC6TGG AGCACTA TCCAGCCTCGCCTATCCGCCTCGC j GCGAGGCGGATAGGCGAGGCTGGA UGCACCCGCGAACAACCiJCUCGTT
e478	AACGAGAGGtJUGUOCeCGGGiJGCA i
«479	GCAcccGCSAACcucucerr
e480	CGAGAGGOUCGOjGGUGCrr 1
	GCCTACTAGATCCCTeGACA S^CnGciccrGGATASA j CeAiCTGGACTTGCrGA^TCAGATCCCTGSAGiGGcj CGTCTAAAACTATGGTTCCCAA GGTATTiofiGCrcrrcĆTGAG
«486 «4 W	CGACCrGGACTTeCTGAACCCAATAAAAGTGACTCTC AS C............................... , SCCTCTGGGCTAATAGGACT................. ;
«488	cSrATTAfnAGcSifiGAG
e489 «490	GSCGCTCAGCTCOSTTTCG nCCACCAOCA^CTCCTCCA
«491 «492 i«493 >494	TrCAGAGA1CT6TAA6TCGACGGAG6CAQCSGGATC TGCGATTTCCTCGAGGCCACCATGGACAACACCGA ttcac AGATGTGTAAGTCGACTGAATAAGAAfiGAGATGTCA GCTCGAGGCCACCATGGACMCACCGA __ TTCAG AGATCTGTAAGTCGACATACTCCCCCACACAGCnAC AATCTCGAGGCCACCATGGACAACACCGA . CAGTTATtTA^TCCSGTGGA
>495	GGCACCGTCAAGGCTGAG
>496	GGTGGTGAAGACGCCAGTG
>497	UGAŚ UGGUUCGG U6GGG AG U UGGGTT
>498 >499	AACtCAACuCCCCACCGAACCACuCA UGAGliGGW^^ .............................
ie5CD	AtóUCCCl^CGAACCACUCA
>501	AGGAUCLCAAGG(XCAACUiXCCGAACC4CuCaGG6 UCCUGUGGACAGCUCACCUAGCUGCAAUG
>502	UGAGUGGUUCGGGGAGUUGGGCCTT
>503 >504	aaggcccaacucccćgaacocuca CGGUUCGGGGAGULGIM^
>505	GG CCCAAĆUCCCCGAACCATT
>506	CGTCTGGATCĆrTAGCCGAAGCCAĆAGCfGCĆCT
>507	'ATĆi^AGGCaŚCMGiT^CTACAGGdÓCCGGA
>508	GGAGTGATATGiJGGAATGAG
«509	TGCGAGTTA1TCTGTGTGTAGC

>510 ;SCAOAAGGCGTCCAAGCAj ieśiT^ACTCTĆarM^^ ..... .......-.....

>512 CTCTATGGGAAGGAĆĆAGCAG ......... i >513 iGGGGAGGnCWGTACTCAe >514 iGGAGTnCGCCGĆCGCAST· >515 XGGQGTAAAAG0CACAĆGAC”™——— ™ >516 'CĆGGTcttÓZATCTCGT“ 1 >517 ICAGCCCAAGCCACCTGAG ' ......

>518 WGęACCTCCGCTGĆAAATAĆ................... j >519 'AbLiAGAATLIGGGACTCTGGT| >520 ]CTaCTGfiTOC6nGCĆA !

>=21 ™' !

>523 [ >5247ggactoacctcccm*ttcc1 >525 IoSgcctatmgaawccaagi >526 1*^=5100.70^^ i >527 fCTGGGTTTCTGATAGGCACTGΉ ^^[^AmATĆCCOTCCfATG................... ;

>529' tKGCTAMATC^^ i ^^“TGGGGAi^i»^ ' >531 iGGGGTCTGGACGCAGAAAG ” ”f

.....J i >534 ^LGGGTATm^CCTaSv^ .....1 >535 fTCAGGGAGCTGCTGGTGrc'..................~j ί«536 l<5nGAW3GGTGAATGA&GAĘ >537 lÓAGĆCAĆińtĆa^ ...............ΐ >538 iGGGGAAGAGCAGAGATATACGT= >539 GGAGTTCGGGGCTCCACACGGCGAC” = >540 iGTGĘATGAOAGCTGnCGTGlfmTGAT ~1 >541 :TGGCGTC57GATTAG7GAT6 ] >542 łCAGAGOGCTAbwCTOATG“Ί >54j 'Agctggcccaaactcacggtc ^¢544^-iuGCUGAGAUGGGlIGAGJClJGAAĆCTT ' Π >545 iAAAGUCACCACCCAUOJCAGCA| >546 iUGCUGAGAUGGGUGGUGACUTT ] >547 :AGAACCTAGAGĆCCAAGGTTĆAGAGTCAtXCATCTCA!

^gcaagcccagaagtaictocaatatctacgatgί >548 iAAGGUUGAGAGUiLACCCAUCUCAGCA..... ί >549 iAUOCLGCLAOACUGGUUGAAALJGGGUj >550 iUWWĆUAGACUAClIGGOUGAAATT ] >551 ‘AAUUUCAACCAGUAGUCUAGCAGĆA .!

>552 ‘GAGAAĆCUGGAGCCUAAGGUUUAGGCLKACCtiMjijl iUCAACCAGUCiJAGCAGCALJCIiGCAACAUCUACAAUi :G!

>553 :ACCCAUUUCAACCAGUCUAGCAGCALt !

>554 iCAGUGUĆGCCijACÓACcijialJljśij’’....... ί >5Ś5 łueuCGCCUACUACUACCUGijuGTTΊ >556 |«CAAttGGĆAGUAGijAGGO3ACA i >557 ‘A(^UĆU^UGÓAĆajULfOB^'Ćcij5uGci’ĆU! j :GGCACAACAGGIJAGUAGGCGAĆACUGUUCGUGUU ;

j __ ^GUCAACAUG__________________ >558 ;acaacagguaguaggcgacacugi >559 lAAGCUGAUCAGGuĆĆAAAGGAĆn ’ ~ ™ ·-—·η ę56Q ';Ai^UCaiuijGG^G^UGMJCA '“l

UGAU&WGUĆO^^ ’ ’' । e562 loCAUUGUUCLGALicAlJCUGAAeAUCtóCUAUUA ’ gaagagaaagaocaguuaaguccuuijggaccuga i j iUCAGCUUGAUACAAGAACUACUGAUUUCAACUUClli , iuUGOCUUMUUCUCUCGeAAACGAUGj >564 tMUCCraAÓAGAUGG^AUÓm^i >565 IlccaGaGaGaugcuGogagauguutt Ć^iT^AACWCJCĆĆAGO^Ί >567:

>568 .........

Ϊβ569 ' >570 AAAOGAGAUAGAGAGCOJGCGCA >571 ‘UUUUGIJMMAAAUGUGAOGAWUUCUC^^ j XCUCUUCUGUWCCUAMUCUCACIASUCAC^ ί aauucagagcagauagagccugcocaauggaauaa aguccucaaaauugaaaugugacauugclcgcaac 'AUCUCCCAUCGCUCUGGAUUUCUUUUUGCUUCAJ χΑυοκυοαίΑΑα^υυοϋϋυυύΑδΑαιιυδϋ ; .ACUUCAGAAGCAAUG >572 ^aaCaucucccaucucucuggatt >573 łUCCAGAGAGAUGGGAGAUOTT >575 SUGAGGCCGAUGUGAAUAGMAACT >576 ϊύέΑΟέέώΑυόόΛώΟΑΑυΛΞΑΑΑΑπ :_β577Ί^ΰυΰαΪΑυϋΕ^ .......................

rGCliUUCACAAACCCCACCCACAAAGCAGCACAOGUU i iLlUOAAGACUUCAGOiJUUCUAUUCACALKGSeajC [ :AlIAA1JACCCAC£C1IGACCUGCUGUAAAAGACCUGG ;

[ :ĄACAAACAAAAAUG _ 1 >579 .AGUUUUCUAJjCACAJCGGCCUCAi eSŚb' ΠύϋύςΰΑυΰω^ΰ^απτ .....”.....”1 8581 iGGKGAUSJGAAJAGMAAfr'.............’......Ί >382Γ^^^ε^ύάΑϋα:υυδα:οόϋ5Ϊίευ?

>583 (aCUUGCUUCITGLICCCCUCCUUCU ......I >584“tucuo^l >585 |aA»6AGGCAAGUAGGALGAUGA5Ai >586 |uGajuajGucccACCciJcajuTTi j~ę5S7' |AA^G^SSU«'GAOO'AAGĆA^ .....'Ί >588 IUU^CCAAmIACaCAUĆCaGGagggGAA^j ! lAGGGSACAGAAGCAAGUCUSCAGAUCAGASOAAAG |aasaaagagcagaggagogagauuggaaguagaa >augcu6Mogcagaggcaaaaaaggaaaaugaag ! Isacag&aggauuaaacagacagaogcaaggaliga

UOAGAOAOeAGCAJSACAGCAAGAAUGAAAAGCAOA -aaauacaauaoasgaaausaasaaaagijaggccug ŹCUGGAGCUAGAOGAUGAUCUGAUGGAAAUAGAAG ,^UA....................................

¢589 ;AGACAGAGgcaai3gavgaug*GAGAG

PL 237 080 Β1 ί jUGGACUCCAAGGCCACGGAUAGGLGUCUGUUUCA i i jUGUGGAAUACOJGAGUUGiMaGUGAAGGGAliGGUA i i iUULAUeCUĆGCCUUGdJGLAGi^LJCCCAGALJCU i iUCCAGAUCCUCAAGCGAUG :

‘«920 iAAUACaJGACUUCAGGUCAAGGGAUGi «921 [UJCCUUGACCŁIGAAGUCAGGUATTi >692? ilACCUGJKljiiĆAGGUCAAGGGAn““1 i_e923 iAGTGGGATTGTAGGCATGAG «924 iCAGTSGGAATACACATGCACA ;_e925~ JTGĆTGGTCTGCCTACTAGTGA «926 iCAATTCGTCAAGCCTCTGGT 6927 IGCAGCTTCCRCrTTTTGATTTTGTCT «928 iCcrrrATTTTCęrTACAGGGTTT _ «929 rrGGACTCrATTTTGAAAAACCATCTCTA4AAGACTG t «930 rTGGCCTCCCAĆCCCCAOC” i «931i

i..............Jgtt...................· i

«933 rTGACTGACTGACTGACraACTGCTATCTATATATAGCT I ( :ATCTAT «934 iTGTnTCGAACATTTMAAAsffCAGATGnA ” i «935 TGACTGACTGACTGACTGACTGCTATCfAfATATAGCr i i 'ATCIAT

e936 sacacigcagbgtaagacagc e937 ^GGATGGATGGACATAAIGGA
6938	5CCTGATGGTCATGTGTCTGA
e939 re940	5ATAGACAGGATCUATA'iATACAi:G SGĆCAGAACAArFGCTGGTTC
e941	SATTTCACGtaCttGGCAAGC
e942	5GGCATAAAAATAGTACAGGAAGC
e943	5CATGGATGCAGMTTCACAG
6944	SACCTGTTGTATGeCAGCAGT
e945	5TCATGTGACAAAAGCCACAC
e946	5GA7GATAGAGATGGCACATGA
e947	SCnjrcCTCTAGGCTCATrTAGC
e948	SCTCTCrrCATCCACCATTGG
6949	satgctgaggagaatttccaa
e9S0	SAGTG7CTCACnCAAGCAiXAAGCAC
e951	stgggagaogcaaggatccaa
e952	stcgagttgttatggttttaggtct
e953	CGATGTGAGTCAATTCCCCAAG
e954	CGTCTTAffrCAATGTTCTirAG
1955	GCGTACAT6TGTCTGGGAAG	......
«956	GCCTCTACA7ATI7ACTGCCAAC
e957	CGCAACAGAACCAATASGC7ATC
e958	CGCAGTAAATCACTTGGTAGSAG	-Ί
«959	GCGGTACGATACGTAATACTTGAC
«960	GACTCCCAAAGSACCTGCTC
«961 6962	GCT7GCAGTCCAATCTGGG7 TCffrTCCTGGGCrCTG7AAAGAATAGTG
«963	GACGATClGnCTTAAACTGGSAAGCrG
«964	cgaaatcaacagaggcttgc
6965	AGGAAATGAGACAGTGGCAT
«966	A7GAGGAC3GTTGACATCTG
e9ń7	CGATCATAGGTTAA7GGG7G
e968	ĆTGTTTG CC CTACAACCTG
«969	GCTACAnCTGCACACGTACC
e970	CGACTGTAGGATTCCAAAGG
6971	G GCAGGCAGGTAGATAGACA
e972	GCACTACACAAGCATAG7CAGG
e973	TGGTRGCOCTGAGTAGGAGT
6974	cttgagggaatgatttgggt
e975	CCAGAGAAACA&AATCAATAGG
e976	GCTTACCTGGGTCTCCAGC
e977	SGAAGOTCCiAAGCTGAAGTG
e9?8	5A1XACCAACATGAAAGGGTACCAArAAC
e979	5AATCTGGGCGACAAGAGTGAA
«980 6981	SGAAGGTOGAAGCTGAAGTG SAT£ACCAACA7GAAAGGffTACCAATAAC
e982 e983	SAATCTGGGCGACAASAGTGAA agacagaaatatagatgagaatgca	J
e984	TCTTCATACATGCTTTATCATGC
e9&5	TATGAAGCAGTGATGCCaa
6986	GCTGTAAGAGACCTGTGTTG
e987	gctattcatccatcaatctatccatt	.—
e988	GCAGCAAAATTCACAGT7G3AAAAATGT
6989 6990	GTCATATTTCTGGOCfiGTCTGG GTGGCrrGGAATTCTTTFACCC	—
6991	AnAGAATrCTTTAA7CTGGACACAAG
e992	TGGGT7ATTAATFGAGAAAACTCCnAC
e993	CGTTnCnCCAATCCCAGTGT
	GACCTGCAAGCA7AACAGATCA

'β995 iGTAAATTGGAGAGTAAATCCCCC te996'^CGTGGGTGeci^^ ........... i_e997 iGATĆCCriTITTMCTaACATCT'..... «998 l&lWrCTGTttTA^^ ...... t«999 jCAGTGCTl □GGnTGTCCCń'...........

.......

klDOl iCATGCAACCA^CATCAGGA «1002 i€l 111GGGATGATGGaaatgtTC :el003ieśWrCTCCTCAATTA7CACTĆ '

61004 i CG AATACTAAAGGCTGCAATGA C10Q 5' CTCCTGAAT7A7CACTCCCAAG elDDgiGTCCCiCATGACACCATCAA elOOTiCGATAATGAAAATAGCTGCCAA elMJSiGAGAATATGCACTGnGTAAAGCXTG 61009 ΐ GCTATTGAGATAATCATGTGGT I filUlO^CAlCAAlAAAOGlAATCCAGCA el011iACTCGFAATCCAGCATATAAACAGAACCAA i elOliiACTGAGACrAGCTCATGCACA eiÓlijGĆTCTACTGAGGAAGGCTGAC e!014!CTCGAnGCACAT7CATCAGGCAGArrCAG ~ i elCllSOGTlTAnCTGTGCATTAIACA ' e 1016 iTGAGACACAACCCACACTGA β1017|^ΑΑΑΓΤΑίΓΑΤΓΓΤΑΓηΑΟΓΓΛΛΑΑΑΤ€ΑΠβΤΓΰ
61018[CCACTGACTGTAAAATGCTGA elO19‘GCATATT7AGTGCAGGTACAA 61020lGAClGACTGACCGAAnCAAAGAGGGAGAAACAGAC > iCTA e^rCATirUGCCAlAGTCGnAG ~ ! elOiZJCTGAGGGAFGGiTGCIGTCA elO23^GACTSACT<5ACTATGGAAACAACrAATGGGAATCTC 5ACTA7 J e 1024: ci r ag Faacac f cagaacaai c ś elO25iCGTAGAGAA7TACATGT7GATC 61026iGACTGACTGACTGACrGACTCAATCATTCTTTGTTATC i :TGFGTGA ; elO27AGAAnGAGCTGAAaTGCA elO28:CAAACCGCTATGAAGCAGTC S elG29!CAATTGGCW3CTCfCTTCAGG i el030:CrGGGTGATGGTGSC7CAG --- elOSrCCCTTGGATGACAGArTGG 61032 CGTCTGGATCCnAGATTAnGAGCTCTCCAGr elO33iAICGAAGGCCGCGGTGGTTCTGAG5GAGACAC elO34iATCGAAGGCCGCG<nGGT«EAAGGTCCCTC I 'G 2103^ACGliGCGCAGCAGGACŁCAjCGCJ
el036 61037 61038 61039 61040 61041 e 104 2 61043 el044 61045 61046 71047 elO48 elO49 elOSO eW51 61052 elO53 61054 61055 e!055 61057 61058 61059 61060 61051 61052 61053 el064 610&5 e 1066 elO67 61058 61069 61070 elD71 61072 61073 el074	UCCCACGUGCGGACCAGCAGGAn AAUCCUGCUGGUCCGCACGUGGSA : UGCGGAGCAGGACGACGCAGCGTT | aacgcugcgucguccugcugcgca 1 AGCGCUGCGUOCUGCUGCGCACGL GUGCGUGCAGGACGCAGCGn i CGCUGCGLCCUGOJGCGCACTT 1 CAGGCAGCGCUGCGUCtUGCUGCGCACG JG6GAAG i cco/GGrccęGGcęĄcęcccGCGAUG ^AG^.CAGGTTAAGGTCCA TTCTCTGTCTTCTTGGGTTCCT GGAAGTGCAGCTTGCTGTGTA GAGCTACGGTTTCCCrATci ~ GTACAGGATATCAGTTCAGAAGA i TCGTmGTACTGACGTTGCT CAGGACAAATGirAATCACAGA 1 CCCnTAAGTrCCCAGTCCA i AGAGnCACGCTGCATCCAT CAAATAATCCCTCCCAACACA i GGCATCACCTTTCACACTCA i CATCACAG GACCGGAGAACG CGffTGACAESCTTCCCTGGATTGGCAG ctgcuatccagggaagcgtgtcakg i GnCGGGCTGGGAGCGTGCnTCCA GnCGGGCTGGTACGAGCGTGCTTTCCA I TGGAAAGCACGCTCGTACCAGCCCGAAC ctgccaatccagggtacaagcgtgtcaccg TGGAAAGCACGCrCCCAGCTCGAAC i CTGGGCTCCGGGGACACTTT ’ CTGGGCTCCGATAGGeACACTTT AMGTGTCCCCGGAGCCCAG i AAAGT3TCĆCTATĆGGAGCCCAG ! CAAAAGTCTAGAGCCAGGGAGCAG oiaa^ctagagcćw^cagggagcag CTGGTCCCTGGACGGTGGCTCTAGACrTTTG i ęTGC-CCZK-GCTCTAGACTTnG ! UCUGOKXCUGGAGGCGGUGGCSJCn cAGajAaajGcuGGGcuccen CGGGUAGCUGCUGGGĆLJC^fF ~ ’ aagagccacógccuocagggagcgga i
61075 61076	5CCA¢£¢UCCAgG^¾^ιXA¢gTT _ 1 GCCAĆCóUCCASG&AGCGGGTT
61077	CGGAGCCCAGCASCWACCUGTT
61078	CGGAGCCCAGCAGCUACCCGTT i
61079	UCCGCUCCCUGGAGGCGGUGGCJCrr !
elDBO	cojgojcccj&gacgglggctt
61081	CCCGCJCCCUGGACGGLJGSCn
61082	AACDCUCUGUUCLrAGCUCGClJA
61083 61084	TGAGGCCAGiśAGATGGAGSCTGCASTGAGCrGTGAT: CACACCACTGrGCTCCAGCCTGABlGACAGAECAAGAi CCCTATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGCrCC | tgaggtgtagacgcgaactctctgtagctcgctagtg i GGTTGCAGGACGTGCrTACGCATGTTTGTnC ί UQAGG£CA6GAGA0GGAGGĆŁJGCA5UGAGciiGUGl AUCACACCACUGUGCUCCAGCCiJGAGUCACAGAGC i AAGACCC UAUC UCAAAAAAAAAAAAAAAAAASAAAA ί

I eGCUCCUGAGGUGUAGACGCCAACUCUCUCJAGCUC i sGCUAGUGGGUUGCAGGAGGUGCUUACGCAOGUUU l fGUUUC ielO85iMCUCUCUCllAGa^ ....................................... ię 1D86: CUOJ CUCUAGCUĆGOIAGTT «1087 cawagogagojagagagagtti «lOBa^AGCGAGCUAGAAGAGAGASTT ielOMAAGCUCCUGMGUGUGUAGACGaA| :elO91!MGCUCCUGAGGUG^GACGÓCAA' 1 «1092 GCUCCUGAGsJsUAGACGCCTTi łeH^3lUUeeeGUCUACACClEA^AGQT «1094 iJJGGteuCUAĆAĆAOCueAGGAecn «1^5^GCGUOiAĆACCLCAGG4GCTT «1096 iAAGGJUCCCUGGAUGAUUGGCAGOCA «1097!fiATTGaGGrrTrCCCCTCCCATGTGCTCAAGACfGGC ; GCFAAA AGTTTTGAGCTTCTCAAAAGTCTAfiAGCCAC • CGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCtCCGGGGAC !A€TTTGCI5TTO3GGCreGGAGCGTGCnTCCACGACG !6TGacacgcttccctggattggcagccagactgcctt i ICCSGGTCACTGCC ;_elO98iGAUUGGGGUUU1JCCCeUaCAUiSUGCUCAAGACU ’ iGGCGCUAAAAGUUUUGAGOJUCUCAAAAGUCUAG i i IAGCCAECGIWMSGCtAGCAGGUAGCUGCUGGGCUC i iCGOGGACAClIU JGCGUUCSGGCUGGGAGOGUGCU ’ iUUCCACGACGGOGACACGCUUCCajGGAUUGGCAG;

i iCCAGACUGCCOUCCGGGUCACUGCCi ipinggiUUGGGAGCCAGACmKCnS'i e 1100! UGGOJGCCAAUÓ.UCĆAGGGAAGCrr • eliOljAACGCŁFUOCĆUGCUGSAUUG&CCA“i iellOąluUGGCCAGAłu^' ‘eil04il/G..GCCAAUCCAGCAGGGAAGCGn’^r ™ «1105 iGGAAGGCAGUCUGGCCAATTy ’!

iellO6IAAGGCUGGGAGCUGCGUGCŁJVUCXAE «11071U GGAAAGCACGCAGCUCCCAGCCTT «1108'MGGUGCUGGGCUKliCCGGGGACA ^s 61109^{* 1}1GUCCCCGGAGCAGCCCAG CAG CTT «uio^^agccaccglcuccagggagcaga «1111 tgtgaagcttcagtctgagtcaggcc^ «1112 iTGTTACCCATGGAGGAGCC GCAGTCAi jął ll^jCTATCCCATSfiTCTGAGTCAGGCCtTrCT:

^iiiąacgcFccctggattggca «1115 «GCTMACGCTAGGATCTGA felll6^ACTAtóCnACTfGTCATGGCGACTGTCC «1117‘CACCCCTCASACACACAGGT «IIISeACTTGTCATGGCGACTCTCCAi «HiglACrAGGGTCAACTAGGGTGAACTAGGGTCAACTAGG^ l iGrCAACTATGACCCTAGT_ I iellJO^TGGGGTCAAGCACGGGAGAAGCrrCTCCCC «iiji^tgggagctggcaggtggccagtggtgatgaaagccc :AGGGGACTGCCCCTGG

Śp1 1?-J-SGTGGGTCATCrGAGtjTCAGACTGCTEA£CTCj ’ell23'CCACAGAGCTCGCATCACCAGAGAACG «1124^GCCATCTAGAGCATCACCAGAGAACG:

«11?5^gTGS&ATCCGCATCACCAGAGMCG ~i «1125:CTCCAAGATCTG0A^-CACCAGAGAACG1 «1127i6r<XAACTAGTGCATCACCAGAGAACG 1 «1128CAGTAGGATCCAGCCAGCAGTCCACAGi «1129 CCGTAGAAnCAGCCAGCAGTCCACAGi «1130!CACCAGAGAACGTAGGCAGACGCTATGTAAATGGCr I I _ iTCCACTGAACGATAACGTTCTCIGGTGATGC ielBl^CSTGGTCCTCTĆATTCCCrn· ~ «1132j^CA^T1>CCAGAGAACGGCrrrcrrTj «1133 i CTTGCATCACCAGAGAACG «1134 CAGCCAGCAGTCCA CAG ’j

[ell35^AATTGAAGOTGGC^rCCGGTACTGTTGi i_e 113e:CCCGAATG(X^^i «1137‘CTATAGG&CGAATTGAAGCTT ........

«1138 śCATGTGAAKOGATCGCATATCTAATACGACTCACTAT^ i ]AGGGAAGCTTC _ i lellSSiCWGGAAGCnCCCTATAGTGAiaTCGTATTACATATG ' ś ?CGATCGAATTCA_ _;

«liaD^BCTGGGAGGCAGCGGGATcrGCGATTTAI «1141^AGCnAMTCGCAGATaDMCTGCCrCCC~( «1142^;G^ATCGGG.AGGCAGCGGGATGrGCGATrTG i_e1143iGATCCAAAICGCAGATCCCGCTGCCTCCC «1144:CATCACCAGAGAACGG(XTCCCAAAGTGCGi i e 1145; GCCAG CAGTCC ACAGCCTGTAATCCCAGCG ¹ ί β 1146 ‘ CTCAAAGTGCTGGGATTACAGG। iell47:TCGACCCATGGAĆATtjTGAATTCGAICGCATATGTAA i JTACGACTCACTATAGGGAAGCnGAGArGTCAGTGAA

EAAAAGGGATCCAGAATG »61148s^ACCCATGGAAGCnGAGATGTCAGTGAAAAAAG’ i GGATCCACiAATGATTĄCTAACCTATGAC «1149 iGGCCATTTTCTGTCATACTGT «1151'TATCGGAGGGCATAGCAGGGCAGCA............................

«11*52: TAIGCTGCCCFGCrATGnrrraSA «1153 iTCtjkGCGmttS6rix^7AGGa^^

JMATeecnCCACTGAACGATAACGACCTGGACnG i jCTGA j jCACAG_____ __ «1155 iCATATGTAATACGACTCACTATAGGGGACTGACTGAC iTGACTGACTGACFGACTGACTGACTGACTGACTGACT i jGACTGCATCACCAGAGAACG ell56 iTAATACGACFCACTATAGGG1 «1157 :TATG7AA7ACGACFGAC7A7AGGi

[ell58leceAAATTAAĆCCTCACTAAA6;

............

iell60iCATACGA7TTAGffTGACACT «lieiiGCCWGGTTirĆ^GfĆAĆGA........................................ «1162 GCGGATAACAATTCACACAfiG ] ίβΐϊκ'Ϊ!^ ‘ «1164 «^,D(CAGSMACAGCTATGAC)3' «l^'iGi^MC^A*CCTWAGŻ^............................

«1166 TGCTCTCCAGGTACGGTrCCATC «1167 SATGGAACCGCTGGASAGCAACH «1168 iGTTGCTCTCCAGCGGTTCCATCTr leliGgtrAiGrAATAreACT^ 1 «1170 CCCTATAGTGAGK^ .........

«1171 i GTAATACGACTGTACACTATAGGG..................................... ;el{^]ttCTATAGiGTA^rĆG7AnAC....................................... eM 73 TATGtaatacgactcactatagggtt «inilcCCTATA^ACTMTATTA^ ....................

£1175 CATATCG AG GT3 G ACATCACTTACG «1176' CGTAAGTGATGTCCACCTC6ATATS «1177’CArATCGAGGCTCTGGACATCAC «117B ^GTGATGTCCAG AG CCT03 ATATG ril^ATOAGGTGGACATGACn «1180 «7G A7GTCCACCTCGATA7T ellBliTAlGTMTACGACTCAClATAGGG «1182 ECCCTA7 AGTGAGTCGTATTACATA ell83iGTMTACGACTGTACACTA7AGGG ell84iCCClATAGTGTACAGTCGTAnAC ‘ellggiTATGTAATACGACTCACTATAGGGn «H&BrCCCTATAGTGAGTCGTAnACArA «1187iG7GTAA7ACTAGTGCGTCGACGGAGGCAGCGGGATC i 7GCGATTrCCICGAGGC£ACCATGACTTCQAAAGT «1188:GTbrAATACrAGTGCG1CGACTAATGAATAAGAAGG ^! _ AGATGTCAgCTCSAGGCCACCATGACTTCGAAAGT !

«1189:6113TMTACrAGieĆGTCGACATACTCCCCĆACAĆAG ;

CTTACAATCTCGAGGCCACCATGACTTCGAA4G7 «1190^:GCCGCTCTAGAAnAnGnCAi «1191rtGGCTCTAGAGGAGGCCTAGGCTnTGCi «1192 agtgaagotgccgccaacatgggccaccatcaccat i :CACCACCTGgnCCACGCGG7TCi «1193 iAcTttATATCGAATl CGCCACCGGAT-CCACCAGCACC i «CGGGAACCGCGTGGAACCAG «H94iU0CCCCUGU0GUCGCULIIJCGCUGn «1195 iAACAGCGAAAGCGACGACAGGSGCA

EAASSACGAGGGATCCAGAAGCSGGTCCTGGCAGrG : iGTGATTCGTATCGCTGCCAGGACCCGCTTCmTrAA i «aTrTCAGGACGAGGGATCCGCCGCTACCAGGAGGT! ;TCTCFGATTCGTACAGAGAAGCiSTCęTGGTAGCGGCT: ίΤΓΊΑΑβατπ ccsaaagcttaaaaaagcacactcag e iCTGAACGTCTGAACAACGTTCGAGĆTAAGCGTGCri C i !GGATCCCTCGTCCTncCCEAAGCT7AAAAACAACTAA; CTCGAAGGCGGA£TCTGAACAAGKCGACCnCGAGC! TAGCTAGGA7CCC7CGTCCTnCC6TGAAGaiTCTCG i i iAGeCGCAGACACTGCTCGGTACGTGAAGCnTCTCGAi «GCGCAGACACTGCrCGGTACGTGAAGtTTTCTCGAG; :CATATGACGTCAOTrAAnGGACACGTGCCTGCATG i •TG CCCCAGTGG AAAGACGCCGTGAAG CrTTCTCGA&C i iATATGACGTCACCTTAA7TGGACACGTGCCTG»TG7 ! iGCGCAGACACTGCTCGGTA i «ligSOC&^AGGCjJCMSGlAĆCCGGGUAGCUCGGAG ‘ «UCGUGGCGCUGGGGGCUAGCACGAQ06CUaJGLJ : :CGGGAGGCGCAGCGGUUAGGUGGACCGGUCAGCG e iGACUCACCGGCCAGtsGCeCUGGGUGCUGGAAUULIGi AUAJLCAUJGAUCCGGGUilLUAUCCOJCLUCUUJ i •UUUCUOAMlAULUUUUUUUAAAAaJGUAlJLJGiJU: :UCLX3óUUUUAAUULAUUUUUGCUUGCCAUUOXC « ·ΑίυυεΑΑυεββ3Γ06ΑΜσςυυ6δ65Α6Αυυΰ0ϋ i :CUACUUCCCCAAAUCACUGUGGAUUUUGGMA(XA; :GCAGAAAGAGGAAAGAG<J'UAuCAAGAϋLL^lL·CAGAC: agaagucgaggaagacagagacg&ggugagagag E i iAGCGCGCGGGCGUGCGAGCAGCGAAAGCGACAGGG!

:GCAAAGUGAGUGACCUGCUULłUGGGGGDGACCGC ; i ^CGGAGCGGGCCGliGAGCCCUCrrCCUUGGGALICC'· i

OCAGCUGACCAGUCGCGCUG «1197:GAGCAGCGAAAGCGACAGGGGC4AAGU ieliggACUUUGCCCCLGUĆGCUUUCGCUGCUC

PL 237 080 Β1

Tabela 2-B

Lista preferowanych sekwencji nukleotydowych, zgodnie z nomenklaturą NCBI (National Center for Biotechnology Information), określonych poniżej na podstawie numerów referencyjnych genów, zawierających regiony, do których może wiązać się cząsteczka kwasu nukleinowego wykazująca homologię sekwencyjną względem tych genów oraz aktywność eRNA.

: Nazwa

tD

Nr dostępu j

COL2A1

1260

NM_O01844.4

CHI

2688

NMJXW515.3

:MSW6

2956

iNMJXX)179.2

TGFBR2

7048

NM_003242.5

genu wg

genu

^referencyjnej j

C0L2A1

1280

NM 033150.2

GUI

2688

NM 022559.2 ϊ

MSH6

12956

NM 000179.2

TNF

7124

NM 00O594.2

sekwencji nukleotydowoj :

C0L3A1

1281

NM_000090.3

GH1

2688

NM_022560.2

MT-C02

14513

YP_003024029.1 !

TNFRSF1A 7132

NM_001065.3

igenu i

ICOL4A1

1282

NMJX)1845.4

GHR

2690

NM.000163.2 '

MT<OI

(4512

yp_Ó0302402&.l

TNFRSF1B 7133

NM_0t)1066.2

=A1CF

29974 NM_001198818.1 r

COL4A2

1284

NM.001B46.2

IFNAl

3439

NM_024013.1

(MTOR

2475

:NM_004958.3

ΤΡ53

7157

NMJJ00546.4

iAlCF

29974NM_C01198319-l

COL4A3

1285

NM_000091.4

IFNA2

3440

NM_00Q605.3

:MYC

:4609

!NM_002467.4

ΤΡ53

7157

NM_001126112.1

;A1CF

29974lNM_001198820J :

COL4A4

1286

NMJJ0O092.4

IFNAR1

i 3454

NM_000629.2

NBN

(4683

iNMJ»2485.4

TP53

7157

NM_001126113.1

;A1CF

29974;NM_014576.3

C0L5A1

1289

NM_OOOO93.3

TFNAR2

(3455

NM.000874.3

NGF

4803

NM_0025Q6.2

TP53

7157

NM_001126114.1

(A1CF

29974NM_138932.2

COL6A1

1291

NM_001848.2

IFNB1

=3456

NM.002176,2

NGFR

14804

1NM.002507.3

TP53

7157

NM_001126115.1

A1CF

29974 NM_13B933.2

:COL7A1

1294

NM-000094.3

bFNG

;3458

NM_000619.2

NOD2

164127 NM.022162.1

TP53

7157

NM-001126116.1

ĄPC

324

NM.000038.5

COL8A1

1295

NMJ3D1B5O.3

ilFNG

(3458

NM_OOOS19.2

PMS1

i 5378

ΐΝΜ_000534.4 i

TP53

7157

NM_001126il7.i

APC

324

NM_001127S10.2 .

COL8A1

1295

NM_020351.2

pFNGRl

13459

NM.000416.2

PMSi

15378

;NM_001128143.1 i

TSC1

7248

NM„D00358.4

;APC

324

NM_001127S11.2 :

COL9A1

1297

NM_0D1851.4

hFNGRZ

13460

NM_005534.3

PMS1

5378

:NM_001128144.1 i

TSC1

7248

NM_001162426.1

ΒΑΧ

581

NM-004324.3

iCOL9Al

1297

NM_078485.3

hGFl

(3479

NMJM0618.3

PMS2

15395

:NM_000535.5

TSC1

7248

ΝΜ.001162427.Ϊ

ΒΑΧ

581

NM_13B761.3

iCXCR2

3579

NM_001168298.1

JGFl

Ϊ3479

NMJM1U1283.1 (

PTEN

5728

NM.000314.4

T5C2

7249

NM_000S48.3

BRCA1

672

NM_007294.3

iCXCR2

3579

NM_0D1557.3

ilGFl

(3479

NM_001111284.1 |

RARA

15914

(NM_000964.3

TSC2

7249

NM_001077183.1

BRCA1

672

NM_007297.3

EGF

1950

NM_001178130.t

MG FI

(3479

NMJM1111285-1 i

RARA

5914

iNM_001024809.3 i

TSC2

7249

NMn001114382.1

BRCA1

672

NM_OO729&3

Έ6Ρ

1950

NM_001178131.1

ilGFIR

;3480

NMJW0875.3

(RARA

5914

NM_001145301.2

VEG FA

7422

NM„001025366.2

BRCA1

672

NM_007299.3

1EGF

1950

NM_001963.4

IGF2

(3481

NMJK0612.4

RARA

(5914

NM_001145302.2

VEGFA

7422

NM.001025367.2

WCA1

672

NMJO07300.3

(EGFR

1956

NM.005228.3

HGF2

13481

NMJK1007139.4 1

RARB

i 5915

NMm0O0965.3

VFGFA

7422

NMu001025368.2

BRCA1

672

NM_007294.3

EGFR

1956

NM_201282.1

IIGF2

i3481

NM_PQ1127598.1 i

RARB

; 5915

NM_Ó16152.3

VEGFA

7422

NM_001Q25369.2

BRCA1

672

NMJD07297.3

EGFR

1956

NM_201284.1

(IGF2R

[3482

NMJM0876.2

RARG

5916

:NM_00J»66.4 ł

VEGFA

7422

NM_001025370.2

BRCA1

672

NMJM7298.3

Ieimai

1973

NM_001416.2

ilLJO

>3586

NM_OOOS72.2

RARG

;5916

NM.Ó01042728.1

VEGFA

7422

NM.001033756.2

WCAl

672

NM_OO7299.3

EIF4A2

1974

NM.DO1967.3

jlLlORA

13587

NM_001553.3

RB1

5925

NM_000321.2

YEGFA

7422

NM_001171622.1

BRCA1

672

iNM_007300.3

(EIF4B

1975

NMJW1417.4

pLlORB

3588

NM_M0623.3 ‘

Rtl

|5979

NM_020630.4

VEGFA

7422

NM.001171623.1

BRCA2

675

NM_000059.3

ElME

1977

NM_001130678.1

I ILIA

{3552

NM_000575.3

(RET

5979

iNM_020975.4

VEGFA

7422

NM_001171624.1

BRCA2

67Ξ

jNM_D000593

(EIF4E

197^

NM_001130679-1

IL1B

j3553

NMJW0576.2

RXRA

16256

ίΝΜ_002957.4 (

VEGFA

7422

NM_001171625.1

CASC3

22794 NM_007359.4

EIF4E

1977

NM_DO1968.3

jlLlRl

<3554

NM_000877.2

RXRB

6257

iNM_021976.3

YEGFA

7422

NM_001171627.1

CDK4

1019

:NM_00007S2

:eif4ebpi

1978

NM_Q04095.3

|lL6

'3569

NM_000600.3

RXRG

16258

NM_006917.4

VEGFA

7422

NM_00117162S.l

CDK4

1019

iNM_000075.2

EIF4GI

1981

NM_0O1194946.1

ilL6R

|3570

NM 000565.2

;5iRTl

i23411:ŃM_00il42498.1 ]

VEGFA

7422

NM_001171629.1

CDKN7A

1029

;NM„D00077,4

(EIF4G1

1931

NM-001194947.1

|IL6R

13570

NM_181359.1

(SIRTl

123411 :NM_012238.4

VEGFA

7422

NM„001171630.1

ICDKN2A

1029

:NM_001195132,l

jEIF4Gl

1981

NM_004953.4

=IL8

13576

NM_000584.2

;sti4

|6768

NM_021978.3

VEGFA

7422

NM.003376.5

CDKN2A

1029

‘NMJ358195.3

I&F4G1

1981

NMJ82917.4

•INS

3630

NM.000207.2

(ST5

16764

NM_005418.3

VEGFB

7423

NMŁO03377.3

CDKN2A

1029

;NM_058197.4

I&F4G1

1981

NM_198241.2

HNS

'3630

NM_C01185057.1 i

iST5

16764

iNM_139157.2

VEGFC

7424

NM_005429.2

CDKN2A

1029

iNM_000077.4

j6F4Gl

1981

NM_198242.2

UNS

(3530

NM.001185098.1 j

15T7

ί7982

iNM_018412.3

VHL

7428

NM_O00551.2

CDKN2A

1029

;NM_00119SB2.1

;EIF4G1

1981

NM_ 198244.2

INSR

3643

NM_000208.2

;ST7

,7982

jNNL021908.2

VHL

7428

ΝΜ_Ϊ98156.1

:CDKN2A

1029

INM_058195.3

IEIF4G2

1982

NM.001042559,2

i INSR

(3643

NMJM1079817.1 !

:TERT

17015

NMJ0O1193376.1 ;

oraz inne sekwencje genów, do

CDKN2A

1029

NM_0S8197.4

= EIF4G2

1982

NM_001172705.1

MC1R

74157

NM_002386.3

ŚTERT

=7015

1NM_1982532 ί

których może wiązać się cząsteczka

CHEK1

1111

ίΝΜ„001114121.1

:EIF462

1982

NM_001418.3

MLH1

4292

NM 000249.3 i

TGFA.......

7039

NM 001099691.1 ;

kwasu nukleinowego wykazująca

iCHEKl

1111

:NM 001114122.1

IEIF4H

7458

MM 02217(11.......

MLH1

4292

NM 001167617.1 :

=TGFA

7039

|nm 0032367..........1

homologię sekwencyjną względem

CHEK1.....

liii

:NM 001274.4

IBF4H' '17458

“HM 03Ϊ992.Γ.........

iMLHl

;4292

NM 001167618.1

TGFB1

(7040

(NM 000660.4

tych genów oraz aktywność eRNA,

CHEK2

11200 NM_001005735.1

IERCC2

2068

NMJ3M400.3

jMLHl

14292

'νμΊ^Ϊ67619.1Ί

TGFB2

17042

^NTpdiiSsM^I

zgodnie z Zastrzeżeniami wynalazku.

ΪΗΕΚ2

U200;NMJ»7194.3

IERCC2

2068

NM_001130867.1

jMLH3

:27030 NM_001040108.1

TGFB2

7042

(NM_003238.3

ŚCHEK2

11200;NM_145862.2

FAS

355

NM_000043.3

:MLH3

(27030 NM_001040108,l

TGFB3

7043

iNM„003239.2

COLlOAl

1300

NM_000493.3

iFAS

35S

NMJ52871.1

|MLH3

(27030 NM„014381.2

TGFBR1

7046

|nM_001130916.1 j

iCDLIAl

1277

NM„000088.3

(FAS

355

NM_152B72.1

;MLH4

(27030 NMJJ14381.2

:TGFBR1

7046

:NM_004612,2

(COL1A2

1276

:NM_000089.3

jFASLG

355

NM_D00639.1

jMSH2

4436

NM_0002Sl.l

TGFBR2

7048

•NM_001024847.2

Dane bilbiograficzne.

Abbott CM, Proud CG. Translation factors: in sickness and in health. Trends Biochem Sci. 2004 Jan;29(l):25-31. Review. PubMed PMID: 14729329.

Albesiano E, Messmer BT, Damie RN, Allen SL, Rai KR, Chiorazzi N. Activation-induced cytidine deaminase in chronic lymphocytic leukemia B cells: expression as multiple forms in a dynamie, variably sized fraction of the clone. Blood. 2003 Nov l;102(9):3333-9. Epub 2003 Jul 10. PubMed PMID: 12855567.

Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Celi. 2004 Jan 23;116(2):281-97. Review. PubMed PMID: 14744438.

Batey RT, Rambo RP, Doudna JA. Tertiary Motifs in RNA Structure and Folding. Angew Chem Int Ed Engl. 1999 Aug; 38(16):2326-2343. PubMed PMID: 10458781.

Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad 0, Barzilai A, Einat P, Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z (July 2005). “Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs”. Nat. Genet. 37 (7): 766-70. doi:10.1038/ng1590. PMID 15965474.

PL 237 080 B1

Brengues M, Teixeira D, Parker R. Movement of eukaryotic mRNAs between polysomes and cytoplasmic processing bodies. Science. 2005 Oct 21;310(5747):486-9. Epub 2005 Sep 1. PubMed PMID: 16141371; PubMed Central PMCID: PMC1863069.

Carter PS, Jarquin-Pardo M, De Benedetti A. Differential expression of Mycl and Myc2 isoforms in cells transformed by elF4E: evidence for internal ribosome repositioning in the human c-myc 5'UTR. Oncogene. 1999 Jul 29;18(30):4326-35. PubMed PMID: 10439040.

Chappell SA, LeQuesne JP, Paulin FE, deSchoolmeester ML, Stoneley M, Soutar RL, Ralston SH, Helfrich MH, Willis AE. A mutation in the c-myc-IRES leads to enhanced internal ribosome entry in multiple myeloma: a novel mechanism of oncogene de-regulation. Oncogene. 2000 Sep 7; 19(38):4437-40. PubMed PMID: 10980620.

Chatterjee S, Pal JK. Role of 5'- and 3'-untranslated regions of mRNAs in human diseases. Biol Cell. 2009 May;101(5):251-62. Review. PubMed PMID: 19275763.

Chen X. MicroRNA biogenesis and function in plants. FEBS Lett. 2005 Oct 31;579(26):5923-31. Epub 2005 Aug 9. PMID: 16144699.

Cornelis S, Bruynooghe Y, Denecker G, Van Huffel S, Tinton S, Beyaert R. Identification and characterization of a novel cell cycle-regulated internal ribosome entry site. Mol Cell. 2000 Apr; 5(4):597-605. PubMed PMID: 10882096.

De Benedetti A, Graff JR. elF-4E expression and its role in malignancies and metastases. Oncogene. 2004 Apr 19;23(18):3189-99. Review. PubMed PMID: 15094768.

Dorsett Y, McBride KM, Jankovic M, Gazumyan A, Thai TH, Robbiani DF, Di Virgilio M, San-Martin BR, Heidkamp G, Schwickert TA, Eisenreich T, Rajewsky K, Nussenzweig MC. MicroRNA155 suppresses activation-induced cytidine deaminase-mediated Myc-Igh translocation. Immunity. 2008 May;28(5):630-8. Epub 2008 May 1. PubMed PMID: 18455451; PubMed Central PMCID: PMC2713656.

Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer. 2006 Apr;6(4):259-69. Review. PubMed PMID: 16557279. Kedersha N, Stoecklin G, Ayodele M, Yacono P, Lykke-Andersen J, Fritzler MJ, Scheuner D, Kaufman RJ, Golan DE, Anderson P. Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol. 2005 Jun 20;169(6):871-84. PubMed PMID: 15967811; PubMed Central PMCID: PMC2171635.

Eulalio A, Behm-Ansmant I, Schweizer D, Izaurralde E. P-body formation is a consequence, not the cause, of RNA-mediated gene silencing. Mol Cell Biol. 2007 Jun;27(ll):3970-81. Epub 2007 Apr 2. PubMed PMID: 17403906; PubMed Central PMCID: PMC1900022.

Filipowicz W, Jaskiewicz L, Kolb FA, Pillai RS. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr Opin Struct Biol. 2005 Jun;15(3):331-41. Review. PubMed PMID:15925505.

Filipowicz W. RNAi: the nuts and bolts of the RISC machine. Cell. 2005 Jul 15;122(1):17-20. Review. PubMed PMID: 16009129.

Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP (January 2009). “Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs”. Genome Res. 19 (1): 92-105. doi:10.1101/gr.082701.108. PMID 18955434.

Graff JR, Zimmer SG. Translational control and metastatic progression: enhanced activity of the mRNA cap-binding protein elF-4E selectively enhances translation of metastasis-related mRNAs. Clin Exp Metastasis. 2003;20(3):265-73. Review. PubMed PMID: 12741684.

Greenman 1C, Gomez E, Moore CE, Herbert TP. Distinct glucose-dependent stress responses revealed by translational profiling in pancreatic beta-cells. J Endocrinol. 2007 Jan;192(1):179-87. PubMed PMID: 17210755; PubMed Central PMCID: PMC1831533.

Henke Jl, Goergen D, Zheng J, Song Y, Schuttler CG, Fehr C, Junemann C, Niepmann M. microRNA-122 stimulates translation of hepatitis C virus RNA. EMBO J. 2008 Dec 17;27(24):3300-10. Epub 2008 Nov 20. PubMed PMID: 19020517; PubMed Central PMCID: PMC2586803.

Huang V, Qin Y, Wang J, Wang X, Place RF, Lin G, Lue TF, Li LC. RNAa is conserved in mammalian cells. PLoS One. 2010 Jan 22;5(l):e8848. PubMed PMID:20107511; PubMed Central PMCID: PMC2809750.

Inhan Lee,1,7,8 Subramanian S. Ajay,2,7 Jong In Yook,3,9 Hyun Sil Kim,3 Su Hyung Hong,4 Nam Hee Kim,3 Saravana M. Dhanasekaran,5 Arul M. Chinnaiyan,5 and Brian D. Atheyl,6. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites, Genome Res. 2009 July;19(7): 1175-1183. PMCID: PMC2704433.

PL 237 080 B1

Jang SK, Krausslich HG, Nicklin MJ, Duke GM, Palmenberg AC, Wimmer E. A segment of the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation. J Virol. 1988 Aug;62(8):2636-43. PubMed PMID: 2839690; PubMed Central PMCID: PMC253694.

Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAS and their regulatory roles in plants. Annu Rev Plant Biol. 2006;57:19-53. Review. PubMed PMID: 16669754.

Kawakami K, Salonga D, Park JM, Danenberg KD, Uetake H, Brabender J, Omura K, Watanabe G, Danenberg PV. Different lengths of a polymorphic repeat sequence in the thymidylate synthase gene affect translational efficiency but not its gene expression. Clin Cancer Res. 2001 Dec; 7(12):4096-101. PubMed PMID: 11751507.

Kerekatte V, Smiley K, Hu B, Smith A, Gelder F, De Benedetti A. The proto-oncogene/translation factor elF4E: a survey of its expression in breast carcinomas. Int J Cancer. 1995 Feb 20;64(1):27-31. PubMed PMID: 7665244.

Koromilas AE, Lazaris-Karatzas A, Sonenberg N. mRNAs containing extensive secondary structure in their 5' non-coding region translate efficiently in cells overexpressing initiation factor elF-4E. EMBO J. 1992 Nov; 11(11):4153-8. Erratum in: EMBO J 1992 Dec;11(13):5138. PubMed PMID: 1396596; PubMed Central PMCID: PMC556925.

Kozak M. A short leader sequence impairs the fidelity of initiation by eukaryotic ribosomes. Gene Expr. 1991 May;l(2):111-5. PubMed PMID: 1820208.

Kozak M. An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control. J Cell Biol. 1991 Nov;115(4):887-903. Review. PubMed PMID: 1955461; PubMed Central PMCID:

PMC2289952.

Kozak M. Effects of long 5' leader sequences on initiation by eukaryotic ribosomes in vitro. Gene Expr. 1991 May;1(2):117-25. PubMed PMID: 1820209.

Kozak M. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J Biol Chem. 1991 Oct 25; 266(30):19867-70. Review. PubMed PMID: 1939050.

Li LC, Okino ST, Zhao H, Pookot D, Place RF, Urakami S, Enokida H, Dahiya R. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Nov 14;103(46): 17337-42. Epub 2006 Nov 3. PubMed PMID: 17085592

Liu L, Dilworth D, Gao L, Monzon J, Summers A, Lassam N, Hogg D. Mutation of the CDKN2A 5' UTR creates an aberrant initiation codon and predisposes to melanoma. Nat Genet. 1999 Jan; 21(l):128-32. PubMed PMID: 9916806.

Lodish HG, Housman D, Jacobsen M. Initiation of hemoglobin synthesis. Specific inhibition by antibiotics and bacteriophage ribonucleic acid. Biochemistry. 1971 Jun 8;10(12):2348-56. PubMed PMID: 5114993.

Macejak DG, Sarnow P. Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature. 1991 Sep 5; 353(6339):90-4. PubMed PMID: 1652694.

Mamane Y, Petroulakis E, Rong L, Yoshida K, Ler LW, Sonenberg N. elF4E - from translation to transformation. Oncogene. 2004 Apr 19;23(18):3172-9. PubMed PMID: 15094766.

Mathews MB, Sonenberg N, Hershey JWB. Translational Control in Biology and Medicine. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2007.

Minn AH, Lan H, Rabaglia ME, Harlan DM, Peculis BA, Attie AD, Shalev A. Increased insulin translation from an insulin splice-variant overexpressed in diabetes, obesity, and insulin resistance. Mol Endocrinol. 2005 Mar;19(3):794-803. Epub 2004 Nov 18.

Minn AH, Pise-Masison CA, Radonovich M, Brady JN, Wang P, Kendziorski C, Shalev A. Gene expression profiling in INS-1 cells overexpressing thioredoxin-interacting protein. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Oct 28;336(3):770-8. PubMed PMID: 16143294.

Mukhopadhyay D, Anant S, Lee RM, Kennedy S, Viskochil D, Davidson NO. C >U editing of neurofibromatosis 1 mRNA occurs in tumors that express both the type II transcript and apobec-1, the catalytic subunit of the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme. Am J Hum Genet. 2002 Jan;70(1):38-50. Epub 2001 Nov 27.PubMed PMID: 11727199; PubMed Central PMCID: PMC384902.

Myasnikov AG, Simonetti A, Marzi S, Klaholz BP. Structure-function insights into prokaryotic and eukaryotic translation initiation. Curr Opin Struct Biol. 2009 Jun;19(3):300-9.

Epub 2009 Jun 1. Review. PubMed PMID: 19493673.

Nilsen TW. Mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in animal cells. Trends Genet. 2007 May;23(5):243-9. Epub 2007 Mar 26. PubMed PMID: 17368621.

PL 237 080 B1

Ohnishi Y, Tamura Y, Yoshida M, Tokunaga K, Hohjoh H. Enhancement of allele discrimination by introduction of nucleotide mismatches into siRNA in allele-specific gene silencing by RNAi. PLoS One. 2008 May 21;3(5):e2248. PubMed PMID: 18493311; PubMed Central PMCID: PMC2373929.

0rom UA, Nielsen FC, Lund AH. MicroRNA-10a binds the 5'UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation. Mol Cell. 2008 May 23;30(4):460-71. PubMed PMID:18498749.

Paulin FE, Chappell SA, Willis AE. A single nucleotide change in the c-myc internal ribosome entry segment leads to enhanced binding of a group of protein factors. Nucleic Acids Res. 1998 Jul 1; 26(13):3097-103. PubMed PMID: 9628905; PubMed Central PMCID: PMC147696.

Pelletier J, Sonenberg N. Photochemical cross-linking of cap binding proteins to eucaryotic mRNAs: effect of mRNA 5' secondary structure. Mol Cell Biol. 1985 Nov;5(11):3222-30. PubMed PMID: 3837842; PubMed Central PMCID: PMC369138.

Pickering BM, Willis AE. The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 2005 Feb;16(l):39-47. Epub 2004 Dec 10. Review. PubMed PMID: 15659338.

Pillai RS, Bhattacharyya SN, Artus CG, Zoller T, Cougot N, Basyuk E, Bertrand E, Filipowicz W. Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science. 2005 Sep 2;309(5740): 1573-6. Epub 2005 Aug 4. PubMed PMID: 16081698.

Preiss T, W Hentze M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. Bioessays. 2003 Dec;25(12):1201-11. Review. PubMed PMID: 14635255.

Shalev A, Blair PJ, Hoffmann SC, Hirshberg B, Peculis BA, Harlan DM. Aproinsuiin gene splice variant with increased translation efficiency is expressed in human pancreatic islets.

Endocrinology. 2002 Jul;143(7):2541-7. PubMed PMID: 12072386.

Shalev A, Pise-Masison CA, Radonovich M, Hoffmann SC, Hirshberg B, Brady JN, Harlan DM. Oligonucleotide microarray analysis of intact human pancreatic islets: identification of glucose-responsive genes and a highly regulated TGFbeta signaling pathway. Endocrinology. 2002 Sep;143(9):3695-8. PubMed PMID: 12193586.

Sonenberg N, DeverTE. Eukaryotic translation initiation factors and regulators. Curr Opin Struct Biol. 2003 Feb;13(1):56-63. Review. PubMed PMID: 12581660.

Stephen A Chappell, John PC LeQuesne, Fiona EM Paulin, Matthew L deSchoolmeester, Mark Stoneley, Richard L Soutar, Stuart H Ralston, Miep H Helfrich and Anne E Willis; A mutation in the c-myc-IRES leads to enhanced internal ribosome entry in multiple myeloma: A novel mechanism of oncogene de-regulation Oncogene (1998) 16, 423 ± 428.

Tijsterman M, Ketting RF, Plasterk RH. The genetics of RNA silencing. Annu Rev Genet. 2002;36:489-519. Epub 2002 Jun 11. Review. PubMed PMID: 12429701.

Tinton SA, Schepens B, Bruynooghe Y, Beyaert R, Cornelis S. Regulation of the cel-cycle-dependent internal ribosome entry site of the PITSLRE protein kinase: roles of Unr (upstream of N-ras) protein and phosphorylated translation initiation factor elF-2alpha. Biochem J. 2005 Jan 1; 385(Pt 1):155-63. PubMed PMID: 15330758; PubMed Central PMCID: PMC1134683.

Valencia-Sanchez MA, Liu J, Hannon GJ, Parker R. Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev. 2006 Mar 1; 20(5):515-24.

Van Der Kelen K, Beyaert R, Inze D, De Veylder L. Translational control of eukaryotic gene expression. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2009 Jul-Aug;44(4):143-68. Review. PubMed PMID:

19604130.

Vasudevan S, Tong Y, Steitz JA. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science. 2007 Dec 21;318(5858):1931-4. Epub 2007 Nov 29. PubMed PMID: 18048652.

Wang G, Guo X, Floras J. Differences in the translation efficiency and mRNA stability mediated by 5'-UTR splice variants of human SP-A1 and SP-A2 genes. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 Sep;289(3):L497-508. Epub 2005 May 13. PubMed PMID: 15894557.

Willis AE. Translational control of growth factor and proto-oncogene expression. Int J Biochem Cell Biol. 1999 Jan;31(l):73-86. Review. PubMed PMID: 10216945.

Yoon A, Peng G, Brandenburger Y, Zollo O, Xu W, Rego E, Ruggero D. Impaired control of IRES-mediated translation in X-linked dyskeratosis congenita. Science. 2006 May 12;312(5775):902-6. Erratum in: Science. 2006 Sep;313(5791):1238. Brandenburg, Yves [corrected to Brandenburger, Yves]. PubMed PMID: 16690864.

Claims (2)

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego, określona jako „eRNA”, obejmująca co najmniej jedną z sekwencji oligonukleotydów, polinukleotydów lub kwasów nukleinowych opisanych w Tabeli

2-A, przy czym cząsteczka ta ma cechę selektywnego wiązania się do sekwencji docelowej RNA na zasadzie komplementarności zasad i wzmacniania syntezy białek, w szczególności wzmacniania syntezy białek w komórkach lub w poza kom orkowych mieszaninach reakcyjnych in vitro.