CN116120385B - 一种三螺旋结构三文鱼核酸及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三螺旋结构三文鱼核酸及其制备方法和应用，属于生物材料工程技术领域。制备方法包括如下步骤：（1）取三文鱼核酸与超纯水制备三文鱼核酸溶液；（2）取尿囊素、谷胱甘肽、左旋肉碱、氯化钠、氨甲环酸、五水合硫酸铜，加入到超纯水中制备结构调节液；（3）将三文鱼核酸溶液与结构调节液低温混合，制备低温混合液；（4）将低温混合液置于温控设备中，进行梯度温度程序处理，得到三螺旋结构三文鱼核酸溶液；（5）取梯度温度程序处理后的溶液，加入乙醇，过滤得到三螺旋结构三文鱼核酸。本发明采用结构调节液和梯度温度程序处理制得的三螺旋结构三文鱼核酸，解决了传统单链或双链螺旋结构三文鱼核酸填充能力弱等问题。

Description

一种三螺旋结构三文鱼核酸及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料工程技术领域，特别涉及一种三螺旋结构三文鱼核酸及其制备方法和应用。
背景技术
三文鱼为一种常见海水冷水鱼类，其成年雄鱼的鱼精中含有纯度高的核酸。采用工业化手段以三文鱼鱼精为原料制取三文鱼核酸，这是一项成熟的工程技术，采用常规的提取技术制备的三文鱼核酸为双螺旋结构，或者由于提取条件的原因，造成部分双螺旋结构解体成为单链核酸结构。
核酸的天然结构为双螺旋结构。在自然条件下，会在某种尚不明确的生理条件下，在双螺旋结构中间，点缀有短片段的三螺旋结构，该种三螺旋结构的形成机制为，双螺旋结构的一条链较长，翻身折叠以参与形成为三链螺旋结构；在自然条件下，该种三螺旋结构极少见，而采取目前的工程提取技术无法得到三螺旋结构的核酸。
天然生物大分子可能有单链、双链或三链结构，不同的结构有不同的功能，在自然选择的过程中，分别发挥着不同的生物学作用。
发明人在研究过程中发现，在自然状态下得到的三螺旋结构的三文鱼核酸，其数量极少，结构不稳定且无法大量获取，然而通过现有提取技术提取到的三文鱼核酸为双螺旋或单链结构，在应用于医疗美容方面时面临着填充能力较弱、在体内维持时间短、容易被体内的酶降解、失去大分子支持作用等的问题，其美容填充应用价值有限，而三螺旋结构三文鱼核酸具有的生物学优势在医疗美容领域具有极大的价值。因此，亟需一种可以稳定大量提取三螺旋结构三文鱼核酸继而有效提高其作为填充剂的填充能力的制备方法。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种三螺旋结构三文鱼核酸及其制备方法和应用，通过采用结构调节液和梯度温度程序处理，结合乙醇沉淀，在保持三文鱼核酸的核苷酸顺序的基础上，优化其二级结构，得到大量结构稳定且填充效果优异的三螺旋结构的三文鱼核酸，以解决传统技术提取到的三文鱼核酸为单链或双链结构以及其作为填充剂填充效果差等问题。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备三文鱼核酸溶液
取三文鱼核酸，加入超纯水，搅拌至完全溶解，得到三文鱼核酸溶液，置于低温下保存备用；
（2）制备结构调节液
取尿囊素、谷胱甘肽、左旋肉碱、氯化钠、氨甲环酸、五水合硫酸铜，加入到超纯水中，搅拌至完全溶解，得到结构调节液，置于低温下保存备用；
（3）制备低温混合液
将三文鱼核酸溶液和结构调节液在低温下混合，得到低温混合液，保持低温静置；
（4）梯度温度程序处理
将低温混合液置于温控设备中，进行梯度温度程序处理，得到三螺旋结构三文鱼核酸溶液；
（5）乙醇沉淀
取（4）中梯度温度程序处理后的溶液，加入乙醇，搅拌至充分混合，过滤得到的沉淀，即为三螺旋结构三文鱼核酸。
三文鱼核酸的完整基因组序列可在基因序列数据库（GenBank）中查询。
进一步地：步骤（1）中，以质量份数计，所述三文鱼核酸为1份，超纯水为5份。
进一步地：步骤（1）中，所述低温为2-4℃。
进一步地：步骤（2）中，以质量份数计，所述尿囊素为1.5-2份，所述谷胱甘肽为2-3份，所述左旋肉碱为3-4份，所述氯化钠为7-8份，所述氨甲环酸为5-6份，所述五水合硫酸铜为0.5-1份，所述超纯水为100份。
进一步地：步骤（2）中，所述低温为2-4℃。
进一步地：步骤（3）中，所述低温为2-4℃，静置时间为22-24h。
进一步地：步骤（4）中，所述梯度温度程序处理具体步骤为：
保持（2℃-4℃）±1℃，保持时间为5min±2min；
升温至95℃±1℃，15min内完成；
保持95℃±1℃，保持时间为5min±2min；
降温至50℃±1℃，10min内完成；
保持50℃±1℃，保持时间为20min±2min；
降温至-20℃±1℃，5min内完成；
保持-20℃±1℃，保持时间为24h±1h；
放置在室温环境中，自然升温至室温，即20-25℃。
在梯度温度程序处理过程中，由于温控设备或环境等不稳定因素的存在，允许温度有±1℃左右的误差，允许保持时间上有±2min左右或±1h左右的误差。
进一步地：步骤（5）中，所述乙醇为95%浓度的乙醇；所述梯度温度程序处理后的溶液与所述乙醇的体积比为1:2。
一般情况下，我们所说的用于制药或食品工业的“乙醇（或酒精）”，指的是通过发酵方法生产的浓度为95%的乙醇，也就是所谓的“食用酒精”。
提供一种三螺旋结构三文鱼核酸，由上述任一一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法制得。
一种三螺旋结构三文鱼核酸在医疗美容填充材料中的应用，其特征在于，所述三螺旋结构三文鱼核酸应用于制备填充剂，所述填充剂适用于真皮注射填充、表皮保水水光、皮肤营养、与羟基磷灰石共同作为牙科填充；
或还可以应用于制备药物缓释基质。
本发明的基本原理：核酸作为大分子，其碱基之间靠氢键连接，聚合成为多链聚合结构，这种聚合反应，与温度有关。本发明的制备方法在温度变化过程中，加入了化合物的作用，以尚不完全清楚的机制，达成了形成三链的结果。
在自然状态下，由于某种尚不明确的生理条件而在双螺旋结构中出现的短片段的三螺旋结构，存在结构不稳定、产生几率极小等问题，而通过本发明的制备方法，可以根据原三文鱼核酸的长度获得相应完整长度的三螺旋结构三文鱼核酸，即是一条长链，其结构更加稳定，可大量制备。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
1）本发明的制备方法在保持三文鱼核酸核苷酸顺序（即其一级结构）不变的基础上，优化了其二级结构（即核酸单链的组合方式，包括组合数量），将原本的单链和双链结构转变为稳定的三链结构；
2）本发明利用常规的无毒性的有机化合物和无机化合物（五水合硫酸铜），配合梯度温度程序，将天然存在的三文鱼核酸双螺旋结构解开，转变为三螺旋结构，操作简便，工艺过程无毒无害，符合绿色化学理念；
3）与传统提取技术制备的三文鱼核酸相比，通过本发明的方法制得的三文鱼核酸具有稳定的三螺旋结构，作为填充剂使用时，具有更优异的医疗美容填充能力，其填充效果更好，维持时间更久，不易被体内的酶降解且可大量制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明提供的一种三螺旋结构三文鱼核酸的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
实施例1：
在本实施例中，一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备三文鱼核酸溶液
以质量份数计，取1份三文鱼核酸，加入5份超纯水，搅拌至完全溶解，得到三文鱼核酸溶液，置于2℃保存备用。
（2）制备结构调节液
以质量份数计，取1.5份尿囊素、3份谷胱甘肽、3份左旋肉碱、7份氯化钠、6份氨甲环酸、1份五水合硫酸铜，加入到100份超纯水中，搅拌至完全溶解，得到结构调节液，置于2℃保存备用。
（3）制备低温混合液
将三文鱼核酸溶液和结构调节液在2℃下混合，得到低温混合液，保持2℃温度，静置22小时。
（4）梯度温度程序处理
将低温混合液置于温控设备中，进行如下梯度温度程序处理：
保持1℃，保持时间为5min；
升温至95℃，15min内完成；
保持95℃，保持时间为5min；
降温至50℃，10min内完成；
保持50℃，保持时间为20min；
降温至-20℃，5min内完成；
保持-20℃，保持时间24h；
放置在室温环境中，自然升温至室温，即20℃。
（5）乙醇沉淀
取（4）中梯度温度程序处理后的溶液，加入95%乙醇，所述溶液与所述95%乙醇的体积比为1:2，搅拌至充分混合，过滤得到的沉淀，即为三螺旋结构三文鱼核酸。
由于设备和环境等不稳定因素的影响，在步骤（1）、（2）、（3）时操作人员可合理选择2-4℃范围内的操作和保存温度，及22-24h范围内的静置时间，同理，在步骤（4）中梯度温度程序处理完成后，自然升温至室温即可。
通过本实施例所述方法制备得到的三螺旋结构三文鱼核酸，其结构示意图如图1所示，所述三螺旋结构三文鱼核酸可应用于制备填充剂，所述填充剂适用于真皮注射填充、表皮保水水光、皮肤营养、与羟基磷灰石共同作为牙科填充；或还可以应用于制备药物缓释基质。
实施例2：
在本实施例中，一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备三文鱼核酸溶液
以质量份数计，取1份三文鱼核酸，加入5份超纯水，搅拌至完全溶解，得到三文鱼核酸溶液，置4℃保存备用。
（2）制备结构调节液
以质量份数计，取2份尿囊素、2份谷胱甘肽、4份左旋肉碱、8份氯化钠、5份氨甲环酸、0.5份五水合硫酸铜，加入到100份超纯水中，搅拌至完全溶解，得到结构调节液，置4℃保存备用。
（3）制备低温混合液
将三文鱼核酸溶液和结构调节液在4℃下混合，得到低温混合液，保持4℃温度，静置24小时。
（4）梯度温度程序处理
将低温混合液置于温控设备中，进行如下梯度温度程序处理：
保持5℃，保持时间为7min；
升温至96℃，15min内完成；
保持96℃，保持时间为7min；
降温至51℃，10min内完成；
保持51℃，保持时间为22min；
降温至-21℃，5min内完成；
保持-21℃，保持时间25小时；
放置在室温环境中，自然升温至室温，即25℃。
（5）乙醇沉淀
取（4）中梯度温度程序处理后的溶液，加入95%乙醇，所述溶液与所述95%乙醇的体积比为1:2，搅拌至充分混合，过滤得到的沉淀，即为三螺旋结构三文鱼核酸。
由于设备和环境等不稳定因素的影响，在步骤（1）、（2）、（3）时操作人员可合理选择2-4℃范围内的操作和保存温度及22-24h范围内的静置时间，同理，在步骤（4）中梯度温度程序处理完成后，自然升温至室温即可。
通过本实施例所述方法制备得到的三螺旋结构三文鱼核酸，其结构示意图如图1所示，所述三螺旋结构三文鱼核酸可应用于制备填充剂，所述填充剂适用于真皮注射填充、表皮保水水光、皮肤营养、与羟基磷灰石共同作为牙科填充；或还可以应用于制备药物缓释基质。
实施例3：
在本实施例中，一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备三文鱼核酸溶液
以质量份数计，取1份三文鱼核酸，加入5份超纯水，搅拌至完全溶解，得到三文鱼核酸溶液，置3℃保存备用。
（2）制备结构调节液
以质量份数计，取1.75份尿囊素、2.5份谷胱甘肽、3.5份左旋肉碱、7.5份氯化钠、5.5份氨甲环酸、0.75份五水合硫酸铜，加入到100份超纯水中，搅拌至完全溶解，得到结构调节液，置3℃保存备用。
（3）制备低温混合液
将三文鱼核酸溶液和结构调节液在3℃下混合，得到低温混合液，保持3℃温度，静置23小时。
（4）梯度温度程序处理
将低温混合液置于温控设备中，进行如下梯度温度程序处理：
保持3℃，保持时间为3min；
升温至94℃，15min内完成；
保持94℃，保持时间为3min；
降温至49℃，10min内完成；
保持49℃，保持时间为18min；
降温至-19℃，5min内完成；
保持-19℃，保持时间23小时；
放置在室温环境中，自然升温至室温，即23℃。
（5）乙醇沉淀
取（4）中梯度温度程序处理后的溶液，加入95%乙醇，所述溶液与所述95%乙醇的体积比为1:2，搅拌至充分混合，过滤得到的沉淀，即为三螺旋结构三文鱼核酸。
由于设备和环境等不稳定因素的影响，在步骤（1）、（2）、（3）时操作人员可合理选择2-4℃范围内的操作和保存温度及22-24h范围内的静置时间，同理，在步骤（4）中梯度温度程序处理完成后，自然升温至室温即可。
通过本实施例所述方法制备得到的三螺旋结构三文鱼核酸，其结构示意图如图1所示，所述三螺旋结构三文鱼核酸可应用于制备填充剂，所述填充剂适用于真皮注射填充、表皮保水水光、皮肤营养、与羟基磷灰石共同作为牙科填充；或还可以应用于制备药物缓释基质。
对以上实施例1-3所制得的三螺旋结构三文鱼核酸进行填充效果试验。
将实施例1-3制得的三螺旋结构三文鱼核酸，混悬于生理盐水溶液中，制得质量浓度为10%的三螺旋结构三文鱼核酸溶液，以质量浓度为10%的传统单链或双链螺旋结构的普通三文鱼核酸溶液作为对照组。填充效果试验采用小鼠。
（1）动物分组：将小鼠随机分成1个对照组和3个试验组，1个对照组20只小鼠，雌雄各半，每个试验组20只小鼠（3个实验组共60只），雌雄各半；
（2）动物准备：小鼠脊背中段，剃去毛发，得到面积约1平方厘米的裸露皮肤；
（3）真皮填充：在裸露皮肤下注射，试验组注射三螺旋结构三文鱼核酸溶液，注射量为1毫升，对照组注射普通三文鱼核酸溶液，注射量为1毫升；
（4）观察指标
填充新增体积指数：以填充物基础部分长度（半径，mm）的平方作为填充新增体积指数，该指数与填充物体积线性正相关，代表填充物的体积。
实施例1-3的试验结果如下表1-3所示：
表1填充新增体积指数试验结果（实施例1）
Figure SMS_1
表2填充新增体积指数试验结果（实施例2）
Figure SMS_2
表3填充新增体积指数试验结果（实施例3）
Figure SMS_3
通过以上表1-3的试验结果对比可知，在注射第5天，试验组的填充效果明显优于对照组的，有显著差异；注射15天之后，填充效果有非常显著差异。
由此可见，与传统提取技术制备得到的单链或双链的三文鱼核酸相比，利用本发明制备的三螺旋结构三文鱼核酸溶液作为填充剂，其结构稳定，医疗美容填充能力更强，填充效果更优，在体内维持的时间更久，不易被体内的酶降解，解决了传统单链或双链螺旋结构三文鱼核酸填充能力弱的问题。
除此之外，本发明在保持三文鱼核酸核苷酸顺序（即其一级结构）不变的基础上，优化了其二级结构，即核酸单链的组合方式，包括组合数量，将原本的单链和双链结构转变为稳定的三链结构，填补了三文鱼核酸的三螺旋结构的空白，并可大量制备；本发明利用常规的无毒性的有机化合物和无机化合物（五水合硫酸铜），配合温度梯度变化程序，将天然存在的三文鱼核酸双螺旋结构解开，转变为三螺旋结构，操作简便，工艺过程无毒无害，符合绿色化学理念。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备三文鱼核酸溶液
取三文鱼核酸，加入超纯水，搅拌至完全溶解，得到三文鱼核酸溶液，置于低温2-4℃下保存备用；
（2）制备结构调节液
取尿囊素、谷胱甘肽、左旋肉碱、氯化钠、氨甲环酸、五水合硫酸铜，加入到超纯水中，搅拌至完全溶解，得到结构调节液，置于低温2-4℃下保存备用；
（3）制备低温混合液
将三文鱼核酸溶液和结构调节液在低温2-4℃下混合，得到低温混合液，保持2-4℃低温静置；
（4）梯度温度程序处理
将低温混合液置于温控设备中，进行梯度温度程序处理，得到三螺旋结构三文鱼核酸溶液，所述梯度温度程序处理具体步骤为：
保持2℃-4℃±1℃，保持时间为5min±2min；
升温至95℃±1℃，15min内完成；
保持95℃±1℃，保持时间为5min±2min；
降温至50℃±1℃，10min内完成；
保持50℃±1℃，保持时间为20min±2min；
降温至-20℃±1℃，5min内完成；
保持-20℃±1℃，保持时间为24h±1h；
放置在室温环境中，自然升温至室温，即20-25℃；
（5）乙醇沉淀
取（4）中梯度温度程序处理后的溶液，加入乙醇，搅拌至充分混合，过滤得到的沉淀，即为三螺旋结构三文鱼核酸。
2.根据权利要求1所述的一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，以质量份数计，所述三文鱼核酸为1份，所述超纯水为5份。
3.根据权利要求1所述的一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，以质量份数计，所述尿囊素为1.5-2份，所述谷胱甘肽为2-3份，所述左旋肉碱为3-4份，所述氯化钠为7-8份，所述氨甲环酸为5-6份，所述五水合硫酸铜为0.5-1份，所述超纯水为100份。
4.根据权利要求1所述的一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，静置时间为22-24h。
5.根据权利要求1所述的一种三螺旋结构三文鱼核酸的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述乙醇为95%浓度的乙醇；所述梯度温度程序处理后的溶液与所述乙醇的体积比为1:2。
6.一种三螺旋结构三文鱼核酸，由权利要求1-5中任一项所述的方法制得。
7.一种三螺旋结构三文鱼核酸在制备医疗美容填充材料中的应用，其特征在于，所述填充材料适用于真皮注射填充、表皮保水水光、皮肤营养、与羟基磷灰石共同作为牙科填充。
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