CN116106441A - 高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法 - Google Patents

高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高效液相色谱‑串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，以该方法测定牛羊肌肉、肝、肾组织中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素残留量，用Mcllvaine‑Na2EDTA及0.1vt％甲酸乙腈溶液提取，正己烷去除脂肪，所得上清液经HLB固相萃取柱净化，0.1vt％甲酸甲醇及0.1vt％甲酸水洗脱，浓缩后以流动相复溶，高效液相色谱‑串联质谱法测定，用空白样品基质加标外标法定量，同时测定6种药物残留，高效且准确。

Description

高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法
技术领域
本发明涉及动物产品药物残留的检测技术领域，更具体的说是涉及一种高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法。
背景技术
畜牧养殖过程中，作为预防和治疗动物疾病用药，抗生素等药物常常在饲料添加剂中使用，由于用药不规范以及对用量没有明确的界线，从而使得药物大量地在动物身上使用并在动物机体组织中残留，对动物性食品安全及社会公共卫生造成危害。
恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素、替米考星是牛羊等牲畜饲养过程中的常用药物，由于各药物之间物理化学性质差别较大，现有肉制品中药物残留分析方法一般按照化学结构相类似的同族药物开发，检测方法专属性强、灵敏度高以满足动物性食品中药物残留限量不断降低的要求。随着人们食品安全意识的提高和国际贸易往来的增加，一批货物经常需检测许多种类的药物残留，按照传统的分析方法，需要较长的检测周期，较多的人力和物力，检测成本高，不能满足目前药物种类不断增加，分析通量不断提高的需求。
因此，如何提供一种可同时检测多种药物残留的方法是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，包括以下步骤：
步骤一：样品中待测药物的提取
称取2.5g组织样品，精确到0.01g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液10mL，涡旋振荡2min，再加入10mL 0.1vt％甲酸乙腈和10mL正己烷，涡旋振荡2min，超声辅助提取30min，4℃下6000r/min离心5min，弃去正己烷层，剩余上清液转入另一50mL聚丙烯离心管中，样品残渣重复上述提取步骤，合并两次提取的上清液；
步骤二：目标待测物的净化、富集
HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL水进行活化，取步骤一的提取液以＜1mL/min的流速通过HLB固相萃取柱，先后加入10mL0.1vt％甲酸甲醇和10mL0.1vt％甲酸水进行洗脱，收集洗脱液，在真空离心浓缩仪中35℃、2000r/min浓缩挥发至干燥，再以1mL 0.1vt％甲酸水-甲醇以体积比＝9:1的比例混合后复溶残渣，经0.22μm滤膜过滤后供HPLC-MS/MS检测；
步骤三：检测
(3.1)基质匹配标准溶液和步骤二净化富集后的样品溶液在设定的液相色谱-质谱条件下进样，判断样品中是否存在相应的目标待测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与基质匹配标准溶液中相应药物的保留时间一致，允许偏差±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质匹配标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则确定含有该药物；
(3.2)在上述相同条件下，以质量浓度X为横坐标，峰面积的值Y为纵坐标，绘制5点基质匹配标准溶液工作曲线，按外标法计算试样中药物的残留量，基质匹配标准溶液及样品溶液中目标物响应值均应在仪器检测的线性范围内。
进一步的，所述的6种药物为恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素和替米考星。
进一步的，所述的液相色谱条件为：
a)色谱柱：Agilent C18，1.8μm，2.1mm×50mm或相当者；
b)进样量：1μL；
c)流速：0.3mL/min；
d)柱温：35℃；
e)流动相：A：0.1mmol/L甲酸水溶液；B：甲醇；梯度洗脱条件为：
时间(min) A％ B％ 流速(mL/min)
0.00 90.00 10.00 0.300
0.50 80.00 20.00 0.300
3.00 65.00 35.00 0.300
5.50 50.00 50.00 0.300
6.50 25.00 75.00 0.300
7.00 90.00 10.00 0.300
9.00 90.00 10.00 0.300
所述的质谱条件为：
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：多反应监测(MRM)；
d)离子源温度：350℃；
e)定性离子对、定量离子对、碎裂电压和碰撞气能量为：
Figure BDA0004017600250000041
优选的，步骤三中所述的基质匹配标准溶液配置如下：
吸取标准贮备液，用空白样品提取液稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、300.0μg/L、500.0μg/L浓度系列基质匹配标准溶液。
优选的，步骤(3.1)中设定的相对丰度偏差如下：
相对离子丰度 ＞50 20～50 10～20 ≤10
允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50
。
进一步的，步骤(3.2)中所述的残留量计算公式如下：
Figure BDA0004017600250000042
其中，
X—试样中药物残留量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
CS—基质匹配标准溶液中药物浓度的数值，单位为微克每升(μg/L)；
Ax—试样溶液中药物的色谱峰面积；
AS—基质匹配标准溶液中药物的色谱峰面积；
V—试样最终定容体积的数值，单位为毫升(mL)；
m—供试试样质量的数值，单位为克(g)。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，具有如下有益效果：
规定了牛羊肉中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素、替米考星残留量的高效液相色谱-串联质谱测定方法，适用于牛羊的肌肉、肝、肾中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素、替米考星残留量的测定，并且可同时对6中药物残留进行测定，精度高，效率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为恩诺沙星标准品质谱图；
图2为环丙沙星标准品质谱图；
图3为氧氟沙星标准品质谱图；
图4为庆大霉素标准品质谱图；
图5为泰乐菌素标准品质谱图；
图6为替米考星标准品质谱图；
图7为恩诺沙星标准品特征离子质量色谱图；
图8为环丙沙星标准品特征离子质量色谱图；
图9为氧氟沙星标准品特征离子质量色谱图；
图10为庆大霉素标准品特征离子质量色谱图；
图11为泰乐菌素标准品特征离子质量色谱图；
图12为替米考星标准品特征离子质量色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、试剂、仪器和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；甲酸：色谱纯；正己烷：色谱纯；乙醇：色谱纯；磷酸氢二钠：分析纯；磷酸二氢钠：分析纯。
0.1％甲酸溶液：准确吸取1000μL甲酸用水稀释定容至1000mL。
Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液：取柠檬酸12.9g、磷酸氢二钠10.9g、乙二胺四乙酸二钠39.2g，加水900mL，用10mol/L的氢氧化钠溶液调pH至5.0±2，用水稀释至1000mL。
恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素、替米考星标准品：浓度≥95％。
标准储备液：1.0mg/mL。准确称取庆大霉素标准物质10.0mg，用水溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，混匀。准确称取恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、泰乐菌素、替米考星标准物质10.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL棕色容量瓶中，混匀。均放置于4℃避光保存，可有效保存3个月。
混合标准储备溶液：10.0μg/mL。分别吸取0.1mL各标准储备溶液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。现用现配。
混合标准工作溶液：1.0μg/mL。吸取1.0mL混合标准储备溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。现用现配。
基质标准工作溶液：分别取0.5μL、1.0μL、2.0μL、5.0μL、10.0μL、20.0μL、50.0μL、100μL、200μL、300μL、500μL混合标准工作溶液，用空白样品提取液定容至1.0mL，配成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、300.0μg/L、500.0μg/L浓度系列基质标准工作溶液。现用现配。
HLB固相萃取柱(200mg，6mL)或其他等效柱。
仪器：液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾离子源)、电子天平(感量0.01g，0.0001g)、高通量组织研磨器、固相萃取、冷冻台式真空离心浓缩仪、高速冷冻离心机、涡旋混合器。
试样制备与保存：
选取具有代表性样品50g，利用组织研磨器或均质器充分搅碎混匀。装入自封袋或其他洁净容器中，密封保存。做好日期、采样地点、动物种类、组织部位等信息标记，保存于-20℃或-80℃条件下。
二、测定步骤
(1)提取：准确称取2.5g(±0.01g)均质后的组织样品于50mL聚丙烯离心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液10mL，涡旋振荡2min，再加入10mL 0.1vt％甲酸乙腈和10mL正己烷，涡旋振荡2min，利用超声波清洗仪超声辅助提取30min，4℃下6000r/min离心5min，弃去正己烷层，将剩余上清液转入另一50mL聚丙烯离心管中，样品残渣重复上述提取步骤，合并两次提取的上清液。
(2)净化：HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL水进行活化，取(1)中的提取液以小于1mL/min的流速通过HLB固相萃取柱，先后加入10mL0.1vt％甲酸甲醇和10mL0.1vt％甲酸水进行洗脱，洗脱液收集于20mL聚丙烯离心管中，收集的洗脱液在冷冻台式真空离心浓缩仪中35℃、2000r/min浓缩挥发至干燥，再以1mL 0.1vt％甲酸水-甲醇(V:V＝9:1)复溶残渣，经0.22μm尼龙有机相微孔滤膜过滤后供HPLC-MS/MS检测；
(3)测定
液相色谱条件：
a)色谱柱：Agilent C18，1.8μm，2.1mm×50mm或相当者；
b)进样量：1μL；
c)流速：0.3mL/min；
d)柱温：35℃；
e)流动相：A：0.1mmol/L甲酸水溶液；B：甲醇；梯度洗脱条件见表1。
表1梯度洗脱条件
时间(min) A％ B％ 流速(mL/min)
0.00 90.00 10.00 0.300
0.50 80.00 20.00 0.300
3.00 65.00 35.00 0.300
5.50 50.00 50.00 0.300
6.50 25.00 75.00 0.300
7.00 90.00 10.00 0.300
9.00 90.00 10.00 0.300
质谱条件：
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：多反应监测(MRM)；
d)离子源温度：350℃；
e)定性离子对、定量离子对、碎裂电压和碰撞气能量：见表2。
表2定性离子对、定量离子对、碎裂电压和碰撞气能量
Figure BDA0004017600250000091
上述的测试中，基质匹配标准溶液曲线的绘制如下：
为补偿基质效应，用空白样品提取液配制标准工作液。吸取标准贮备液，用空白样品提取液稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、300.0μg/L、500.0μg/L浓度系列基质标准工作溶液。基质匹配标准溶液，按以上所述仪器条件进行测定，在上述浓度序列中至少选取5个浓度建立线性回归方程并绘制标准曲线。
定性测定：在同样测试条件下，试样溶液中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素、替米考星药物的保留时间与基质匹配标准溶液中相应药物的保留时间，偏差在±2.5％以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液相对离子丰度一致，其允许偏差应符合表3的要求。6种药物标准溶液特征离子质谱图见附图1-6。
表3定性确证时相对离子丰度的允许偏差
相对离子丰度 ＞50 20～50 10～20 ≤10
允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50
定量测定：按上述设定仪器条件，以基质匹配标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量，基质匹配标准溶液及试样溶液中的目标物响应值均应在仪器检测的线性范围内。6种药物标准品特征离子质量色谱图见附图7-12。
结果计算与表述：试样中恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、替米考星、泰乐菌素的残留量按标准曲线或公式计算，
Figure BDA0004017600250000101
其中，
X—试样中药物残留量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
CS—基质匹配标准溶液中药物浓度的数值，单位为微克每升(μg/L)；
Ax—试样溶液中药物的色谱峰面积；
AS—基质匹配标准溶液中药物的色谱峰面积；
V—试样最终定容体积的数值，单位为毫升(mL)；
m—供试试样质量的数值，单位为克(g)。
定量限、检出限、回收率：
计算空白试样的噪音与对应保留值处的峰面积的比值，以10倍信噪比(S/N>10)所对应的待测物浓度为最低定量限，以3倍信噪比(S/N>3)所对应的待测物浓度为检出限。6种抗微生物药物方法检出限0.05μg/kg～1.2μg/kg，定量限0.16μg/kg～3.8μg/kg；
选取目标待测物的牛、羊3种组织样品，进行不同浓度的目标待测物加标回收试验，添加3个浓度水平，按上述测样条件进行分析，得到添加回收率。恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素、替米考星在5μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三个加标浓度下回收率为73.3％～114.0％，相对标准偏差(n＝6)0.1％～13.1％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：样品中待测药物的提取
称取2.5g组织样品，精确到0.01g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液10mL，涡旋振荡2min，再加入10mL0.1vt％甲酸乙腈和10mL正己烷，涡旋振荡2min，超声辅助提取30min，4℃下6000r/min离心5min，弃去正己烷层，剩余上清液转入另一50mL聚丙烯离心管中，样品残渣重复上述提取步骤，合并两次提取的上清液；
步骤二：目标待测物的净化、富集
HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL水进行活化，取步骤一的提取液以＜1mL/min的流速通过HLB固相萃取柱，先后加入10mL0.1vt％甲酸甲醇和10mL0.1vt％甲酸水进行洗脱，收集洗脱液，在真空离心浓缩仪中35℃、2000r/min浓缩挥发至干燥，再以1mL0.1vt％甲酸水-甲醇以体积比＝9:1的比例混合后复溶残渣，经0.22μm滤膜过滤后供HPLC-MS/MS检测；
步骤三：检测
(3.1)基质匹配标准溶液和步骤二净化富集后的样品溶液在设定的液相色谱-质谱条件下进样，判断样品中是否存在相应的目标待测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与基质匹配标准溶液中相应药物的保留时间一致，允许偏差±2.5％，该色谱峰所对应的药物在设定质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质匹配标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则确定含有该药物；
(3.2)在上述相同条件下，以质量浓度X为横坐标，峰面积的值Y为纵坐标，绘制5点基质匹配标准溶液工作曲线，按外标法计算试样中药物的残留量，基质匹配标准溶液及样品溶液中目标物响应值均应在仪器检测的线性范围内。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，其特征在于，所述的6种药物为恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、泰乐菌素和替米考星。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，其特征在于，
所述的液相色谱条件为：
a)色谱柱：AgilentC18，1.8μm，2.1mm×50mm或相当者；
b)进样量：1μL；
c)流速：0.3mL/min；
d)柱温：35℃；
e)流动相：A：0.1mmol/L甲酸水溶液；B：甲醇；梯度洗脱条件为：
所述的质谱条件为：
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：多反应监测(MRM)；
d)离子源温度：350℃；
e)定性离子对、定量离子对、碎裂电压和碰撞气能量为：
Figure FDA0004017600240000021
Figure FDA0004017600240000031
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，其特征在于，步骤三中所述的基质匹配标准溶液配置如下：
吸取标准贮备液，用空白样品提取液稀释成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、300.0μg/L、500.0μg/L浓度系列基质匹配标准溶液。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，其特征在于，步骤(3.1)中设定的相对丰度偏差如下：
。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱-串联质谱同时测定牛羊肉中6种药物残留量的方法，其特征在于，步骤(3.2)中所述的残留量计算公式如下：
Figure FDA0004017600240000041
其中，
X—试样中药物残留量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
CS—基质匹配标准溶液中药物浓度的数值，单位为微克每升(μg/L)；
Ax—试样溶液中药物的色谱峰面积；
AS—基质匹配标准溶液中药物的色谱峰面积；
V—试样最终定容体积的数值，单位为毫升(mL)；
m—供试试样质量的数值，单位为克(g)。
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