CN116106240A - 一种尿液酪氨酸检测体系、检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种尿液酪氨酸检测体系、检测方法及检测试剂盒，所述检测体系包括缓冲溶液、4‑氨基安替比林、辣根过氧化酶和过氧化氢，且检测体系的pH为6.5～7.8；将待测样品置于所述检测体系并于室温反应后，即可通过观察反应液颜色变化或测试反应液在485nm处的吸光度值实现对酪氨酸的定量分析。相比于传统的Millon反应以及多酶反应体系，本发明所用试剂没有毒性、腐蚀性，不会对人体健康和环境安全造成隐患，而且操作简单，不需要特殊仪器且成本低，有利于实现“居家健康检测”。

Description

一种尿液酪氨酸检测体系、检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种尿液酪氨酸检测体系、检测方法及检测试剂盒。
背景技术
酪氨酸又称4-羟基-苯丙氨酸，是人体内的一种半必须氨基酸。酪氨酸是体内肾上腺素、多巴胺、黑色素合成的一种重要的前体物质。人体内缺乏酪氨酸会引起痴呆、帕金森氏症等疾病，但是过量的酪氨酸则会导致机体的甲状腺机能亢进等。目前的研究表明，包括肝癌、胃癌、宫颈癌在内的多种恶性癌症在产生的过程中会代谢产生高浓度的酪氨酸。正常人体尿液中的酪氨酸含量约为1～1.30mmol L–1，癌症发生的过程中，患者尿酪氨酸含量高达2.50mmol L–1。因此，尿液中酪氨酸可以作为肿瘤标志物应用于癌症的早期筛查和检测，该方法可为患者争取到宝贵的治疗时间，对于癌症治疗具有十分重要的作用。
Millon反应通过汞盐酪氨酸中的酚基发生螯合反应，产生砖红色产物。中国专利CN201510962013.1公开了一种用于检测人体尿液中酪氨酸类肿瘤标志物的试剂，由硝酸汞溶液、硫酸汞溶液、硝酸镍溶液、硫酸钴溶液配制而成。CN201510537446.2公开的对羟基苯丙氨酸酪氨酸尿液检测试剂，由H+、Hg+、Ni2+、NO3 –、磷钼酸等组成。Millon反应需要高浓度的汞盐参与反应，这些试剂具有剧毒性、挥发性、累积性等，不仅会对人体的消化系统、神经系统产生损伤，而且也会对环境产生严重污染。目前，多款基于Millon的酪氨酸检测试剂已经用于癌症的早期筛查。这些产品的检测试剂、以及显色反应均需在安瓿瓶中进行。但是，废弃试剂依然会对人体健康、环境保护产生潜在的危害，不利于广泛的推广。
为了降低Millon试剂产生的危害，一些基于多种生物酶的策略用于检测样品中酪氨酸含量。例如，中国专利CN202010175482.X公开了一种酪氨酸检测试剂盒，由酪氨酸羟化酶、多酚氧化酶、四氢生物喋呤、高碘酸钠、酶稳定剂等组成。这种策略存在一些问题，如多酶的级联反应产生的副产物复杂，易对显色反应产生干扰；需要保护剂稳定酶的活性；成本高等。因此，开发一种环境友好、操作简单、易于储存和运输的尿液酪氨酸检测方法具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明旨在提供一种成本低、环境友好、操作简单的适用于尿液中酪氨酸半定量和定量检测的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明首先提供了一种尿液酪氨酸检测体系，该检测体系中包括缓冲溶液、4-氨基安替比林、辣根过氧化酶(HRP)和过氧化氢，其中检测体系的pH为6.5～7.8。
作为优选地，在上述尿液酪氨酸检测体系中，缓冲溶液采用PBS缓冲液。
作为优选地，在上述尿液酪氨酸检测体系中，辣根过氧化酶的浓度为15～25U/mL，4-氨基安替比林的浓度为0.15～0.50g/L，过氧化氢的浓度为0.50～2.50mmol/L。
上述检测体系能够用于检测尿液中酪氨酸的原理为：在中性或弱碱性的条件下，HRP/H2O2催化4-氨基安替比林与酪氨酸的酚基的偶联反应，从而产生红色的醌类物质。
本发明还提供了利用上述检测体系检测尿液中酪氨酸的方法，具体为：
(1)先配置一系列酪氨酸浓度已知的标准液，将标准液分别加入所述的尿液酪氨酸检测体系中，轻摇混匀，并于室温(25-37℃)反应3～5min后，通过确定反应液颜色变化或者测试反应液在485nm处的吸光度值，制备成标准比色卡或者绘制标准工作曲线；
(2)将待测尿液样品加入步骤(1)所述的尿液酪氨酸检测体系中，在同等条件下反应后，通过观察反应液颜色或者测试反应液在485nm处的吸光度值，再根据标准比色卡或标准工作曲线计算待测尿液样品中的酪氨酸含量。
在上述检测尿液中酪氨酸的方法中，观察反应液的颜色变化时，既可以通过裸眼观察，也可以通过终端上的RGB分析软件观察。由于酪氨酸的存在会使检测体系产生红色的醌类物质，故当反应液颜色为红色时，表明待测尿液样品中含有酪氨酸。
在上述检测尿液中酪氨酸的方法中，测试反应液在485nm处的吸光度值可采用紫外分光光度计或酶标仪，该检测方法适用于批量样品的酪氨酸浓度检测。
本发明还提供了一种尿液酪氨酸检测试剂盒，该试剂盒中包括pH为6.5～7.8的缓冲溶液或缓冲液粉，4-氨基安替比林，辣根过氧化酶，以及过氧化氢。
可以理解的是，在该试剂盒中，上述各物质可以分别独立包装，或者将部分物质直接配置成能够长期稳定存在的混合体系。
在上述尿液酪氨酸检测试剂盒中，还可以包括相关的检测耗材，如滴管、反应管、比色卡、尿杯等。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1)本发明提供的尿液酪氨酸检测体系安全性高，不涉及毒性和腐蚀性试剂，不会对人体健康和环境安全造成隐患；
2)该检测体系涉及的检测反应简单，在室温下即可完成，实现了“一步法”检测，操作简单，不需要特殊仪器，可以满足家庭中的日常尿液酪氨酸检测；同时，该检测体系还可以满足医院中多尿液样本中酪氨酸的高通量检测；
3)本发明所需的检测试剂容易获得且价格低廉，而且制备成的检测试剂盒易于储存和运输，只需要注意避光即可，不需要冷藏储存和运输，适合产业化。
附图说明
图1为本发明实施例1中含有不同氨基酸的待测样品在本发明提供的检测体系中的反应结果对照图；
图2为本发明实施例2中含有不同酪氨酸浓度的待测样品在本发明提供的检测体系中的反应结果对照图；
图3为本发明实施例2中含有不同酪氨酸浓度的待测样品与本发明提供的检测体系反应后的吸光度变化图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
(1)配置pH 7.20的PBS缓冲液粉末；称取100U的HRP干粉，溶解于1mL的去离子水溶液中，称为A液；称取0.034g H2O2，溶解于100mL的去离子水溶液中，称为B液；称取0.050g 4-氨基安替比林，溶解于25mL的去离子水溶液中，称为C液。
(2)称取0.010g PBS缓冲液粉末，加入到离心管中；再将所述酪氨酸检测试剂A、B、C按每离心管0.020mL进行分装；然后向上述离心管中分别加入0.020mL 50mmol L–1酪氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、羟脯氨酸、鸟氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、组氨酸；置于室温(25-37℃)反应3～5min，观察颜色变化。
在上述反应体系中，HRP的终浓度为25U/mL，H2O2的终浓度为2.5mmol/L、4-氨基安替比林的终浓度为0.50g/L。
上述含有不同氨基酸的待测样品与检测体系反应后的照片如图1所示：仅有含酪氨酸的待测样品使检测体系的颜色变为了红色，而其他离心管仍保持为淡黄色。说明该检测体系对酪氨酸具有选择性，特异性好。
实施例2
(1)同实施例1一致。
(2)称取0.010g PBS缓冲液粉末，加入到离心管中；再将所述酪氨酸检测试剂A、B、C按每离心管0.020mL进行分装；然后向上述离心管中分别加入0.020mL 0、0.050、0.10、0.25、0.50、1、2、2.50、3、5、10、12mmol L–1酪氨酸。置于室温(25-37℃)反应3～5min，观察颜色变化，并使用紫外分光光度计检测待测溶液485nm处的吸光度值。
上述各待测样品与检测体系反应后的照片如图2所示：随着待测样品中酪氨酸的浓度增加，离心管中液体颜色变化明显，并逐渐变为红色。故在日常居家检测中，可以直接通过裸眼观察颜色变化或使用比色卡实现对尿液中酪氨酸的半定量分析。
上述各待测样品与检测体系反应后所得混合液在不同波长下的吸光值如图3中A所示：随着待测样品中酪氨酸浓度的升高，在480nm处的吸光度值逐渐升高。进一步分析480nm处的吸光值与待测样品浓度，绘制如图3中B所示的工作曲线，标准方程为：Y＝0.25X+0.21，R2＝0.97。计算其检测限为0.25mmol/L(S/N＝3)，远低于酪氨酸代谢异常患者尿液中的酪氨酸水平(2.50mmol/L)。
综上所述，本发明提供的尿液酪氨酸检测方法对酪氨酸具有很好的选择性，且检出限远低于酪氨酸代谢异常患者尿液中的酪氨酸水平，更重要的是，本发明通过裸眼即可清楚分辨出酪氨酸含量是否异常，适用于居家检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种尿液酪氨酸检测体系，其特征在于，包括：缓冲溶液、4-氨基安替比林、辣根过氧化酶和过氧化氢，所述检测体系的pH为6.5～7.8。
2.根据权利要求1所述的尿液酪氨酸检测体系，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的尿液酪氨酸检测体系，其特征在于，所述辣根过氧化酶的浓度为15～25U/mL。
4.根据权利要求1所述的尿液酪氨酸检测体系，其特征在于，所述4-氨基安替比林的浓度为0.15～0.50g/L。
5.根据权利要求1所述的尿液酪氨酸检测体系，其特征在于，所述过氧化氢的浓度为0.50～2.50mmol/L。
6.一种尿液酪氨酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配置一系列酪氨酸浓度已知的标准液，将标准液分别加入如权利要求1～5任一项所述的尿液酪氨酸检测体系中，轻摇混匀，并于室温反应3～5min后，通过确定反应液颜色变化或者测试反应液在485nm处的吸光度，制备成标准比色卡或者绘制标准工作曲线；
(2)将待测尿液样品加入步骤(1)所述的尿液酪氨酸检测体系中反应，通过观察反应液颜色或者测试反应液在485nm处的吸光度，再根据标准比色卡或标准工作曲线计算待测尿液样品中的酪氨酸含量。
7.一种尿液酪氨酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的缓冲溶液，4-氨基安替比林，辣根过氧化酶以及过氧化氢储备液。
8.根据权利要求7所述的尿液酪氨酸检测试剂盒，其特征在于，还包括检测耗材。
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CN117110256A (zh) * 2023-05-29 2023-11-24 兰州大学第一医院 一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂及检测方法

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CN117110256A (zh) * 2023-05-29 2023-11-24 兰州大学第一医院 一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂及检测方法
CN117110256B (zh) * 2023-05-29 2024-04-19 兰州大学第一医院 一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂及检测方法

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