CN117110256A - 一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于N‑GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂，所述的试剂包括PH缓冲液，4‑氨基安替比林溶液、氧化剂和N‑GQDs分散液，所述的试剂可以制备为试剂盒，所述的与传统的化学显色法检测尿液酪氨酸试剂盒相比，该试剂盒具有不易受尿液本底颜色干扰，不易受检测人员主观判断影响，且检测敏感性高、特异性强、选择性好、检测范围宽、可实现定量分析的优点；所需试剂构成简单，N‑GQDs光化学稳定性高，荧光寿命长，生物相容性好，成分稳定，便于储存，无污染且相对安全无毒；不需昂贵检测仪器，实验检测操作且检测成本较低，可实现快速高效批量检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂及检测方法。
背景技术
开发高敏感性的肿瘤早期筛查方法是提高肿瘤的早期诊断能力实现有效治疗肿瘤的关键。对羟基苯丙氨酸(又称酪氨酸，可简称Tyr)作为一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，其在恶性肿瘤患者尿液中的水平相较于健康人尿液中的水平增高50％-150％。研究发现检测尿液中Tyr水平在早期肿瘤普查、疗效评估、高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。目前，临床广泛使用的检测尿液Tyr的方法主要是滴定法，其检测原理为试剂与尿液中的Tyr发生特征显色反应，通过沉淀物颜色不同即可判定被测试者体内是否有相关细胞内代谢异常。然而，该方法存在诸多局限性：①无法实现定量检测：该方法通过判断沉淀物颜色变化，进而给出阴性、弱阳性、阳性的检测结果，无法实现定量分析；②检测结果判断不客观：检测人员裸眼观察沉淀物颜色并与标准比色卡进行对比，最终判定结果阴阳性，存在因检测人员主观判断影响检测结果的客观性；③不安全和不环保：试剂成份含有强酸和汞，检测过程中存在强酸腐蚀和汞危害检测人员健康，同时反应生成的汞盐可污染环境；④抗干扰能力弱：易受到尿液本身颜色，服用氨基酸类、激素类、保健药、中枢神经系统药物，尿液本身所含还原性物质、PH值以及无机盐的干扰，影响检测结果的准确性。此外，毛细管电泳紫外检测法、高效液相色谱法及液质联用法也可用于检测尿液中Tyr。然而这些方法因价格昂贵的专用检测仪器、技术操作复杂、分析时间较长且成本高、需要特定检测试剂和专业技术人员，最终这些限制其广泛使用，更不适合用于肿瘤疾病的筛查。
针对尿液Tyr的研究，发明人所在的课题组进行了诸多的研究，并在前期申请了发明专利一种尿液Tyr定量检测试剂盒及其检测方法(CN114813557A)，但是，所述的试剂盒存在着①利用分光光度法检测吸光度，容易受到尿液本底颜色的干扰；②试剂组成中有铁氰化钾溶液，在检测反应过程中可能产生剧毒氰化物质，对操作人员和实验环境产生危害，并且铁氰化钾溶液见光容易分解，使得检测试剂盒不稳定；③检查灵敏度有待进一步优化的技术问题。因此，开发一种新的灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强、安全环保且可定量检测尿液中Tyr的新检测方法对肿瘤筛查及早期诊断具有重要价值和临床意义。
为了解决上述技术问题，发明人所在的课题组进行了持续的研究，研制出了一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂盒，所述的试剂盒有效的解决了上述技术问题，具有①使用荧光而非吸光度来反应Tyr浓度，不易受尿液本底颜色干扰以及检测人员的主观判断影响，并且其检测敏感性高、特异性强、抗干扰性强、选择性好、检测范围宽；②所需试剂构成简单，N-GQDs的稳定性高，荧光寿命长，生物相容性好，成分稳定，便于储存，无污染且相对安全无毒；③检测灵敏度高等有益效果。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂，所述的试剂包括PH缓冲液，4-氨基安替比林溶液、氧化剂和氮掺杂石墨烯量子点分散液。
优选的，所述的氧化剂为弱氧化剂、较强氧化剂、很强氧化剂或极强氧化剂中的一种或几种。
优选的，所述的氧化剂包括三价钴盐、过硫酸盐、过氧化物、重铬酸钾、高锰酸钾、氧酸盐、浓硫酸、高碘酸钾、高氯酸或次碘酸中的一种或几种。
优选的，所述的氧化剂在检测体系中浓度为80～140μL/L。
优选的，所述的氮掺杂石墨烯量子点分散液的制备方法如下：以柠檬酸为碳源、氨水为氮源，混合后置于有聚四氟乙烯的反应釜中高温加热反应，自然冷却，取反应釜中液体，加入纯水稀释，加热蒸发混合液体中未完全反应的氨水，用纯水定量稀释混合液体，得氮掺杂石墨烯量子点分散液。
优选的，所述的pH缓冲液的pH范围为：9-10。
优选的，所述的试剂中4-氨基安替比林的浓度范围在检测体系中为150～210μL/L。
本发明的第二目的是提供一种尿液中酪氨酸的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有所述的检测试剂。
本发明的第三目的是提供所述的检测试剂所述的检测试剂盒在检测尿液酪氨酸中的应用。
本发明的第四目的是提供一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测方法，包括如下步骤：
(1)取样品，加入PH缓冲液；
(2)向上述溶液中加入4-氨基安替比林试剂，加盖充分混匀；
(3)步骤(2)得到的溶液中加入氧化剂试剂，加盖充分混匀，避光反应；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入氮掺杂石墨烯量子点分散液，室温下反应，使用多功能酶标仪检测其荧光强度值。
本发明的有益效果是：①本发明基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂，所述的试剂构成简单，N-GQDs光化学稳定性高，荧光寿命长，生物相容性好，成分稳定，便于储存，无污染且相对安全无毒；②本发明所述的尿液酪氨酸检测试剂中，所述的氧化剂对所述的检测试剂检测结果具有显著的影响；③将本发明所述的检测试剂制备成检测试剂盒，与传统的化学显色法检测尿液酪氨酸试剂盒相比，该试剂盒具有不易受尿液本底颜色干扰，不易受检测人员主观判断影响，且检测敏感性高、特异性强、抗干扰性强、选择性好、检测范围宽、可实现定量分析的优点。④所述的试剂盒不需昂贵检测仪器，实验检测操作便捷且检测成本较低，可实现快速高效批量检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的保护范围进行详细的说明。
图1不同PH缓冲液的全波长紫外-可见吸收光谱
图2PH缓冲液为PH＝10时的全波长紫外-可见吸收光谱
图3氧化剂高碘酸钾的全波长紫外-可见吸收光谱
图4不同浓度Tyr的全波长紫外-可见吸收光谱
图5尿液Tyr的标准曲线
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一、一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂1的制备
1.4-氨基安替比林溶液配制：
采用直接法配制标准溶液在电子分析天平上准确称量1.0000g 4-氨基安替比林粉末，充分搅拌使其溶解于PH缓冲液中，溶解后定量转移至已校准的50mL容量瓶中，然后用PH缓冲液稀释至刻度线，充分摇匀，配制成高浓度20g/L的4-氨基安比林溶液，将该溶液用棕色试剂瓶避光保存，临用时配制。
2.N-GQDs水相分散液的配制：
以2.0g柠檬酸为碳源前驱体、20mL的氨水为为氮源前驱体，混合后置于衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中高温加热，200℃条件下反应10小时。反应完成后待其自然冷却，取反应釜中棕色液体至烧杯中，加入50mL纯水稀释后，加热烧杯内液体至100℃，时间1小时，蒸发掉混合液体中未完全反应的氨。最后将烧杯中剩余溶液用纯水定量稀释至250mL，得N-GQDs储备液，将其避光低温保存。
3.检测试剂的制备
(1)取样品，加入PH缓冲液；
(2)向上述溶液中加入4-氨基安替比林溶液，加盖充分混匀；
(3)步骤(2)得到的溶液中加入氧化剂溶液，加盖充分混匀，避光反应；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入氮掺杂石墨烯量子点分散液，室温下反应，使用多功能酶标仪检测其荧光强度值。
4.PH缓冲液对检测结果的影响
在其他条件不变的情况下，使用PH分别为7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲液按照上述配制试剂，按照步骤与4-AAP和氧化剂进行反应，检测全波长紫外-可见吸收光谱。
检测结果如图1所示，当PH为7.0、8.0和9.0时，4-AAP会和高碘酸钾发生非特异性反应，生成某种在524nm处有紫外吸收的物质，而当PH＝10时，溶液中的4-AAP不会和高碘酸钾发生反应，在524nm处不产生特征性吸收峰，其吸光度小于0.1，如表1所示。
表1不同PH缓冲液的在波长524nm处的吸光度
与此同时，当反应环境PH＝10时，在4-AAP和高碘酸钾的混合溶液中加入Tyr，混合溶液在478nm处产生了一特征性的紫外吸收峰(如图2所示)。这表明必须使反应环境的PH控制在10.0及以上范围，才能抑制反应体系中4-AAP与高碘酸钾发生非特异性反应。结合临床实际应用中安全问题，最终选择本实验的反应环境PH为10.0。
5.氧化剂对检测结果的影响
(1)不同氧化剂对检测结果的影响
在其他条件不变的情况下，确定PH缓冲液的PH为10.0，使用铁氰化钾、高锰酸钾、次氯酸钠配制试剂，按照步骤与4-AAP和氧化剂铁氰化钾、高锰酸钾、次氯酸钠进行反应，检测全波长紫外-可见吸收光谱。
相同条件下，选取氧化剂铁氰化钾、高锰酸钾、次氯酸钠进行实验，当N-GQDs分别与4-AAP、Tyr混合后，N-GQDs的荧光强度没有明显的变化；而当N-GQD与上述氧化剂混合后，其荧光被显著猝灭。表明上述氧化剂的强荧光猝灭作用会掩盖醌类物质对N-GQDs的猝灭作用，均无法催化反应，使得实验无法判断生成醌的量。
(2)氧化剂高碘酸钾对检测结果的影响
在其他条件不变的情况下，确定PH缓冲液的PH为10.0，使用高碘酸钾为氧化剂，配制饱和溶液，用量分别为80、100、120和140μL，在体系中浓度分别为80、100、120和140μL/L，按照步骤与4-AAP和酪氨酸进行反应，检测全波长紫外-可见吸收光谱。
检测结果如图3A所示，随着氧化剂高碘酸钾用量的增加，其反应强度不断增加，至高碘酸钾用量为120μL/L后，反应强度达到最高；图3B展示了当固定高碘酸钾用量后，4-AAP用量对反应的影响，可见混合溶液吸光度在4-AAP用量为190μL/L时达到最高。
为了综合考察两试剂对反应的影响，实验取高碘酸钾浓度分别为80、100、120和140μL/L，4-AAP浓度分别为150、170、190和210μL/L进行交叉反应。
结果如图3C所示，当高碘酸钾浓度为120μL/L，4-AAP浓度为190μL/L时，反应后混合溶液吸光度值最高。因此本实验选择高碘酸钾的最佳浓度为120μL/L，4-AAP最佳浓度为190μL/L。
实施例2、Tyr浓度测定可行性试验
(1)准备洁净、容量大于2mL的带盖离心管、洁净96孔板备用；
(2)向一系列的离心管中加入200μL的Tyr标准溶液，再加入490μL的PH＝10±0.2的缓冲液，以调节PH至PH＝10±0.2；
(3)向上述溶液中加入190μL的4-AAP试剂，加盖充分混匀；
(4)而后加入120μL高碘酸钾试剂，加盖充分混匀。25℃、避光反应10分钟。
(5)向混合液体中加入400μLN-GQDs，室温下反应16分钟。
(6)取反应后的混合溶液200μL至不透光得96孔板中，使用多功能酶标仪检测其在347nm发波长激发下，427nm处的荧光强度值并记录。
如图4所示，检测混合溶液的荧光发射光谱后发现，随着浓度升高，混合溶液荧光强度逐渐下降，且其荧光发射图谱的峰值始终在427nm处。表明所提出的基于荧光纳米生物传感器实现Tyr的浓度检测策略具有可行性。
实施例3标准曲线的制作
1.Tyr标准溶液配制：
采用直接法配制标准溶液，在电子分析天平上准确称量0.1200g已干燥的Tyr基准物质，充分搅拌使其溶解于超纯水中，溶解后定量转移至已校准的200mL容量瓶中，然后用超纯水稀释至刻度线，充分摇匀，配制成600mg/L的Tyr标准溶液储备液。Tyr储备液按实验所需，依次稀释为浓度分别为500、400、300、200、100、50mg/L的系列标准梯度溶液，室温密闭保存，避免细菌污染、现配现用。
2.标准曲线的制作
使用纯水配制Tyr系列梯度标准溶液，按照实施例2步骤进行重复实验，检测并记录混合溶液在347nm激发光激发下，在427nm处的荧光强度。最后横坐标取Tyr标准品的浓度，纵坐标取荧光值，建立标准曲线。
表2Tyr标准曲线的测定
根据表中数据，绘制基于N-GQDs的荧光纳米生物传感器定量检测溶液中Tyr标准曲线，下图显示荧光强度的改变与Tyr浓度间相关性良好。回归方程为Y＝-0.0104X2+2.196X-0.6056，相关系数R2＝0.999。
实施例4试剂盒检测线确定
通过实验对空白样品进行20次重复实验，根据检测数据计算出荧光纳米传感器的检出限和测定下限，结果见下表。
该传感器检测Tyr的检出限为0.495mg/L，测定下限为1.982mg/L。
表3试剂盒的检出限和测定下限
实施例5临床尿液样品中Tyr测定
为了进行尿液标本的分析检测，从兰州大学第一医院收集患者的尿液标本，首先，将尿液标本以10000rpmm的转速在离心机中离心10分钟，取上层清液。其次，按照实施例2进行尿液标本中的Tyr浓度检测。最后，在尿液标本中分别加入200mg/L的Tyr标准溶液，制备出Tyr加标样本，按照实施例2对加标后尿液标本进行Tyr浓度检测。
表4不同样品中的Tyr测定
从上表检测的临床样品可以看出，加标回收率在96.02％以上，表明本试剂盒检测Tyr的分析准确度高，重复性良好，且能定量尿液中Tyr浓度，适用于大规模分析尿液中Tyr浓度监测。
同时，将本发明制备得到的试剂盒用于分析临床尿液样本，对可能患有恶性肿瘤的人群进行筛查(筛查依据是尿液中的对羟基苯丙氨酸在恶性肿瘤患者尿液中的水平相较于健康人尿液中的水平显著增高)，将筛查得到的有患癌风险的患者进一步检查诊断，证实该发明检测试剂和检测方法具有无创、快速、简单、高度灵敏的特点，有广阔的临床应用前景。
综上所述，本发明基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂，所述的试剂构成简单，N-GQDs光化学稳定性高，荧光寿命长，生物相容性好，成分稳定，便于储存，无污染且相对安全无毒；本发明所述的尿液酪氨酸检测试剂中，所述的氧化剂对所述的检测试剂检测结果具有显著的影响；将本发明所述的检测试剂制备成检测试剂盒，与传统的化学显色法检测尿液酪氨酸试剂盒相比，该试剂盒具有不易受尿液本底颜色干扰，不易受检测人员主观判断影响，且检测敏感性高、特异性强、抗干扰性强、选择性好、检测范围宽、可实现定量分析的优点。所述的试剂盒不需昂贵检测仪器，实验检测操作便捷且检测成本较低，可实现快速高效批量检测。
Claims (10)
1.一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括PH缓冲液，4-氨基安替比林溶液、氧化剂和氮掺杂石墨烯量子点分散液。
2.如权利要求1所述的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的氧化剂为弱氧化剂、较强氧化剂、很强氧化剂或极强氧化剂中的一种或几种。
3.如权利要求2所述的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的氧化剂包括三价钴盐、过硫酸盐、过氧化物、重铬酸钾、高锰酸钾、氧酸盐、浓硫酸、高碘酸钾、高氯酸或次碘酸中的一种或几种。
4.如权利要求3所述的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的氧化剂在检测体系中的浓度为80～140μL/L。
5.如权利要求1所述的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的氮掺杂石墨烯量子点分散液的制备方法如下：以柠檬酸为碳源、氨水为氮源，混合后置于有聚四氟乙烯的反应釜中高温加热反应，自然冷却，取反应釜中液体，加入纯水稀释，加热蒸发混合液体中未完全反应的氨水，用纯水定量稀释混合液体，得氮掺杂石墨烯量子点分散液。
6.如权利要求1所述的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的pH缓冲液的pH范围为：9-10。
7.如权利要求1所述的尿液酪氨酸检测试剂，其特征在于，所述的试剂中4-氨基安替比林的浓度范围在检测体系中为150～210μL/L。
8.一种尿液中酪氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有权利要求1-7任一项所述的检测试剂。
9.如权利要求1-7任一项所述的检测试剂或权利要求8所述的检测试剂盒在检测尿液酪氨酸中的应用。
10.一种基于N-GQDs荧光淬灭原理的尿液酪氨酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取样品，加入PH缓冲液；
(2)向上述溶液中加入4-氨基安替比林试剂，加盖充分混匀；
(3)步骤(2)得到的溶液中加入氧化剂试剂，加盖充分混匀，避光反应；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入氮掺杂石墨烯量子点分散液，室温下反应，使用多功能酶标仪检测其荧光强度值。
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