CN108844933A - 一种测定青蒿素含量的荧光分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于光谱分析检测技术领域，特别是涉及一种运用新型纳米材料石墨烯量子点的荧光分析法，具体涉及一种测定青蒿素含量的荧光分析方法。本发明利用青蒿素的过氧桥结构，同对氨基苯硼酸反应，在氧气存在时，进一步进行催化氧化反应生成对亚氨基苯醌，并猝灭石墨烯量子点的荧光。本发明提供的荧光检测方法成本低，易操作，检出限低，选择性好，灵敏度高。本发明拓展了石墨烯量子点在药物分析检测领域中的应用，同时对于青蒿素药品质量的评价和监督提供了便捷、精确的技术手段。

Description

一种测定青蒿素含量的荧光分析方法
技术领域
本发明属于光谱分析检测技术领域，特别是涉及一种运用新型纳米材料石墨烯量子点的荧光分析法，具体涉及一种测定青蒿素含量的荧光分析方法。
背景技术
青蒿素是一种含过氧基团的倍半萜内酯类化合物，是继乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后的最安全有效的抗疟特效药，具有速效和低毒的特点。同时，青蒿素在抗血吸虫、调解或抑制体液的免疫功能、提高淋巴细胞的转化率的治疗中也显示出优良的前景。随着青蒿素在生化医药领域的广泛应用，青蒿素的市场需求迅速扩大，给不法商贩提供可乘之机，兜售假冒或劣质的青蒿素产品，给患者带来恶劣的影响，同时也侵犯了青蒿素提取厂商的利益。因此，建立一种有效、便捷、高灵敏的定量检测青蒿素的方法尤为重要。
目前，青蒿素的检测方法包括色谱分析法、光谱分析法、电化学法、生物学方法等。色谱法如高效液相色谱法，虽然准确度高，但操作复杂，中国专利 (CN 103353498 A) 公布了一种测定青蒿素浸膏中青蒿素含量的高效液相色谱法，该方法中反相色谱柱的填充物为十八烷基硅烷键合硅胶，较其他液相色谱法相比灵敏度和准确度更高，但该方法成本昂贵，仪器设备要求高，操作繁琐；生物学方法如光度酶联免疫分析法、放射免疫分析法，成本高，反应条件苛刻；电化学法检测青蒿素极易受组织中杂质的干扰，重复性很差；而光谱法由于所用仪器设备简单，灵敏度高，实用性及可操作性强，满足现代社会对分析的需求而倍受青睐。中国专利 (CN 105784620 A) 公开了一种紫外光谱法检测青蒿素的分析方法，该方法以单链 DNA 稳定的纳米金胶体为探针，通过青蒿素与亚铁离子反应生成的自由基来破坏DNA 单链，从而使纳米金胶体的紫外吸收发生变化来构建青蒿素的传感平台，显著提高了检测方法的灵敏度，但该方法中所用 DNA 价格昂贵，而且该方法检出限较高。
近年来，石墨烯量子点成为新型纳米材料家族中不可或缺的一员。石墨烯量子点具有优良的热化学稳定性、良好的生物兼容性及低细胞毒性，因而在生物成像、传感器和光学分析检测中备受关注。现有技术中，将石墨烯量子点应用到青蒿素检测中的研究尚未有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服当下青蒿素检测过程中存在的操作复杂、成本昂贵等问题，提供了一种基于新型纳米材料石墨烯量子点建立的测定青蒿素含量的荧光分析方法，该方法利用石墨烯量子点独特的性质以及青蒿素特殊的过氧桥结构构建了一个简便灵敏的检测体系，实现了对青蒿素的定量检测。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种测定青蒿素含量的荧光分析方法，包括以下步骤：
(1) 向A离心管中加入待检测青蒿素溶液，然后依次加入对氨基苯硼酸溶液、氢氧化钠的乙醇水溶液，混合均匀，室温下反应后得溶液A；
(2) 向步骤 (1) 中得到的溶液A加入酪氨酸酶溶液，反应得溶液B；
(3) 向步骤 (2) 中得到的溶液B加入荧光石墨烯量子点，混合均匀，反应得溶液C；
(4) 向B离心管中加入与步骤 (3) 中等量的石墨烯量子点；
(5) 向A、B两离心管中加入缓冲溶液使两试管溶液体积一致；
(6) 通过荧光分光光度计测定溶液A、B的荧光强度值 ：F A、F B；
(7) 配制浓度梯度的青蒿素标准溶液，经过上述 (1)～(5) 步骤后，依次测定荧光强度值F X，以青蒿素溶液与B离心管溶液荧光强度的比值 (1- F X/F B) 对浓度绘制标准曲线，利用该曲线实现对青蒿素含量的测定。
进一步的，所述待检测青蒿素溶液同对氨基苯硼酸溶液的浓度比为1:1～1:2；所述对氨基苯硼酸溶液10 mM；所述待检测青蒿素溶液同氢氧化钠的乙醇水溶液的体积比为：1:3~1:6；所述氢氧化钠的乙醇水溶液的浓度为50 mM；所述的氢氧化钠的乙醇水溶液中，乙醇与水的体积比是9:1。
进一步的，步骤 (1) 中，所述的反应时间为1～7 分钟。
进一步的，步骤 (2) 中，所述酪氨酸酶溶液同待检测青蒿素溶液的体积比为4：1；所述酪氨酸酶溶液的浓度为1 mg/mL；步骤 (2) 中，所述反应的温度为20～50 ℃，反应的时间为1～20 min。
进一步的，步骤 (3) 中，所述荧光石墨烯量子点在溶液B中的浓度为0.25～1.0mg/mL；步骤(3)中，所述反应的时间为1～40分钟。
进一步的，步骤 (4) 中，所述缓冲溶液为：磷酸缓冲盐溶液，浓度为5 mM～100mM；所述磷酸盐缓冲溶液的 pH=4～9。
本发明所提供的荧光分析方法，所述方法对青蒿素的检测范围为0.1 µM～55 µM。
本发明首次利用石墨烯量子点作为荧光探针，构建了青蒿素的荧光传感平台。在激发波长为 375 nm 时，石墨烯量子点在 455 nm 处的荧光猝灭效率与青蒿素的浓度在0.1-55 μM范围内呈现良好的线性关系，该传感平台对青蒿素的线性检测范围为 0.1 µM~55 µM，检出限低至 33 nM, 实现了青蒿素的微量检测。
本发明的有益效果为：
(1) 本发明提供的荧光检测青蒿素的分析方法操作简便、成本低、准确度和灵敏度高，为今后黄花蒿采收日期的确定和青蒿材料的筛选以及青蒿素定量检测等方面提供了便捷的手段，具有较优的农业生产应用和临床应用潜力。
(2) 本发明首次提供了一种以石墨烯量子点为探针的新型光谱分析法---荧光光谱分析法来定量检测青蒿素，拓展了荧光光谱分析法在分析检测领域的应用。
(3) 本发明拓展了石墨烯量子点在药物分析检测领域中的应用，同时对于青蒿素药品质量的评价和监督提供了便捷、精确的技术手段。
附图说明
图1是本发明荧光检测青蒿素的示意图。
图2是本发明荧光检测青蒿素分析方法中石墨烯量子点的激发光谱图以及对亚氨基苯醌的紫外吸收光谱图。
图3是本发明荧光检测青蒿素分析方法的浓度曲线图。
图4是本发明荧光检测青蒿素分析方法的标准曲线图。
图5是本发明荧光检测青蒿素分析方法的特异性检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明进行具体阐述。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的范围。此外，在阅读本发明讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附属权利要求书所限定的范围。
实施例1 一种测定青蒿素含量的荧光分析方法，具体如图1所示，步骤如下：
(1) 向14 支离心管中加入浓度分别为0 µM、4 µM、10 µM、40 µM、60 µM、100 µM、140 µM、180 µM、200 µM、600 µM、1000 µM、1400 µM、1800 µM 和2200 µM的青蒿素乙醇溶液5 µL；青蒿素的化学结构如式 (1) 所示；
(2) 向步骤 (1) 中得到的离心管溶液中加入10 mM对氨基苯硼酸溶液9 µL和50 mM氢氧化钠的乙醇水溶液25 µL，混合均匀，室温下反应10 min；
(3) 向步骤 (2) 中得到的离心管溶液中加入1 mg/mL酪氨酸酶溶液20 µL， 40℃ 水浴条件下反应10 min；
(4) 向步骤 (3) 中得到的离心管溶液中加入石墨烯量子点，使其浓度为0.5 mg/mL，混合均匀，室温下反应25 min；石墨烯量子点的激发光谱图以及对亚氨基苯醌的紫外吸收光谱图如图2所示；
(5) 向步骤 (4) 中得到的离心管中加入缓冲溶液，使各试管中溶液体积为200 µL，通过荧光分光光度计分别测定离心管溶液的荧光强度值(F 0、F X1、F X2、F X3、、、F X13), 如图3所示。以标准品的1- F x/F 0 为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图4。根据样品的1-F x/F 0 值在标准曲线上计算出样品浓度，实现定量分析。
实施例2 青蒿素的选择性分析检测方法
(1) 向10支离心管中分别加入5 µL 2000 µM的青蒿素、抗坏血酸、尿酸、半胱氨酸、乳酸、麦芽糖、蔗糖、天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸；
(2) 向步骤 (1) 中得到的离心管溶液中加入10 mM对氨基苯硼酸溶液9 µL和50 mM氢氧化钠的乙醇水溶液25 µL，混合均匀，反应10 min；
(3) 向步骤 (2) 中得到的离心管溶液中加入1 mg/mL酪氨酸酶溶液， 40℃ 水浴条件下反应10 min；
(4) 向步骤 (3) 中得到的离心管溶液中加入石墨烯量子点，使其浓度为0.5 mg/mL，混合均匀，反应25 min；
(5) 向步骤 (4) 中得到的离心管中加入缓冲溶液，使各试管中溶液体积为200 µL，通过荧光分光光度计分别测定离心管溶液的荧光强度值。如图5所示，本荧光检测方法仅对青蒿素具有高灵敏反应。
对比例1
该对比例采用电化学法检测青蒿素，主要特征是利用青蒿素的过氧桥结构将对氨基苯硼酸氧化成对可被电化学信号检测出的对氨基苯酚，灵敏度高，但该方法检出限高，重复性差。
对比例2
该对比例采用紫外法检测青蒿素，通过青蒿素内过氧基团被亚铁离子催化产生的活性自由基可以破坏以单链DNA为模板稳定的金纳米溶胶，使金纳米胶体团聚，颜色由酒红色变成蓝紫色，在610 nm处与540 nm处吸光度比值发生变化来测定青蒿素含量。但该方法检测范围较窄，检出限高，且所用试剂昂贵，操作成本高。
效果实施例
将实施例1及对比例1-2采用的方法进行检测范围及检出限测定，具体结果见表1。
表1
表1结果表明，本发明以石墨烯量子点为荧光探针检测青蒿素，具有灵敏度高，检测范围宽，准确度高等特点。与对比例相比，本发明的检出限低27倍左右，且本发明采用新型纳米材料石墨烯量子点为探针具有低毒性，绿色无污染的特点，更符合现代社会及生态环境对分析检测的要求。

Claims (9)

1.一种测定青蒿素含量的荧光分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 向A离心管中加入待检测青蒿素溶液，然后依次加入对氨基苯硼酸溶液、氢氧化钠的乙醇水溶液，混合均匀，室温下反应后得溶液A；
(2) 向步骤 (1) 中得到的溶液A加入酪氨酸酶溶液，反应得溶液B；
(3) 向步骤 (2) 中得到的溶液B加入荧光石墨烯量子点，混合均匀，反应得溶液C；
(4) 向B离心管中加入与步骤 (3) 中等量的石墨烯量子点；
(5) 向A、B两离心管中加入缓冲溶液使两试管溶液体积一致；
(6) 通过荧光分光光度计测定溶液A、B的荧光强度值 ：F A、F B；
(7) 配制浓度梯度的青蒿素标准溶液，经过上述 (1)～(5) 步骤后，依次测定荧光强度值F X，以青蒿素溶液与B离心管溶液荧光强度的比值 (1- F X/F B) 对浓度绘制标准曲线，利用该曲线实现对青蒿素含量的测定。
2.根据权利要求1所述的荧光分析方法，其特征在于，所述待检测青蒿素溶液同对氨基苯硼酸溶液的浓度比为1:1～1:2；所述对氨基苯硼酸溶液10 mM；所述待检测青蒿素溶液同氢氧化钠的乙醇水溶液的体积比为：1:3~1:6；所述氢氧化钠的乙醇水溶液的浓度为50 mM；所述的氢氧化钠的乙醇水溶液中，乙醇与水的体积比是9:1。
3.根据权利要求1 或2所述的荧光分析方法，其特征在于，步骤 (1) 中，所述的反应时间为1～7 分钟。
4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，步骤 (2) 中，所述酪氨酸酶溶液同待检测青蒿素溶液的体积比为4：1；所述酪氨酸酶溶液的浓度为1 mg/mL。
5.根据权利要求4所述的荧光分析方法，其特征在于，步骤 (2) 中，所述反应的温度为20～50 ℃，反应的时间为1～20 min。
6. 根据权利要求1所述的荧光分析方法，其特征在于，步骤 (3) 中，所述荧光石墨烯量子点在溶液B中的浓度为0.25～1.0 mg/mL。
7.根据权利要求6所述的荧光分析方法，其特征在于，步骤 (3) 中，所述反应的时间为1～40分钟。
8. 根据权利要求1所述的荧光分析方法，其特征在于，步骤 (4) 中，所述缓冲溶液为：磷酸缓冲盐溶液，浓度为5 mM～100 mM；所述磷酸盐缓冲溶液的 pH=4～9。
9.根据权利要求1-8任一项所述的荧光分析方法，其特征在于，所述方法对青蒿素的检测范围为0.1 µM～55 µM。
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