CN102614150A - 含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊及其制备方法。胶囊是以量子点为核心，以半胱氨酸为过渡层，周围负载青蒿琥酯，以明胶做壁材的三层包装四层结构的纳米胶囊，囊形为椭球形，囊径200±20nm，有可观察的荧光发射。制备的具体作法是先制备明胶溶液，在2％明胶溶液中加入吸附半胱氨酸的CdTe量子点溶液，以超纯水稀释10倍，滴加青蒿琥酯无水乙醇溶液，加无水硫酸钠水溶液、氢氧化钠溶液，调pH，加入10μl甲醛溶液，透析，冷冻干燥得含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊产品。本发明将药物与荧光标记物结合，共同包埋于纳米胶囊内部，操作简单。制备的胶囊能较好保持荧光特性，可应用于实时监测纳米药物在体内的传输和分布以及破囊释放规律。

Description

含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊及其制备方法。

背景技术

纳米胶囊作为新型给药系统已经引起广泛关注，将具有荧光特性的物质与药物分子共同包埋于纳米胶囊内部，结合光学活体成像技术，可能成为实时监视纳米胶囊在体内传输和分布以及破囊释放行为的有效工具。目前，光学活体成像技术主要分为生物发光成像和荧光成像两种方式。在荧光成像的方式中，有机染料是传统意义上的荧光标记物，由于其没有长期的荧光稳定性，这些荧光物质的应用受到一定局限。因此，寻找一种全新的荧光材料成为必然。

近年来，量子点以其特殊的荧光性能在生物发光成像方面表现出极大优越性。量子点是由II-VI或III-V族的元素组成的半导体纳米材料，其直径一般在1～10纳米之间。与传统荧光染料相比，量子点荧光激发波长范围广，发射光谱窄且分布对称；可以通过控制量子点的尺寸和组成得到从可见光到红外光之间的荧光发射峰谱；另外，量子点荧光强度大，光学稳定性好，在生物体内不易降解且毒性小，有潜力成为生物及医药研究的一种新型荧光探针。其中，在水相合成的CdTe量子点随尺寸变化发射光谱可以覆盖整个可见光区，成为研究的热点。

青蒿琥酯是一种新型抗疟药，被WHO称为“治疗疟疾的最大希望”，兼有抗弓形虫和抗肿瘤的作用。青蒿琥酯是倍半萜内酯化合物青蒿素的衍生物，在乙醇中易溶，在水中几乎不溶，其生物利用度低，代谢快，给临床应用带来诸多不便。为了增强水溶性，提高生物利用度，本申请人利用初生态微晶法以明胶为壁材将其制成纳米胶囊，囊心物为青蒿琥酯，囊膜为明胶，囊形球形或椭球形，囊径为30nm，见《纳米青蒿琥酯胶囊的制备工艺》(中国专利号200910062882.3)，随之而来的，研究药物在体内的传输、分布与破囊释放特性成为一个新课题。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种操作简单，制备的胶囊理化性能与纳米青蒿琥酯胶囊相近，能较好保持荧光特性，以便于实时监测药物在体内的运输、分布及破囊释放规律的含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊及其制备方法。

本发明目的的实现方式为，含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊，是以CdTe量子点为核心，以半胱氨酸为过渡层，周围负载青蒿琥酯，以明胶做壁材三层包装四层结构的纳米胶囊，囊形为椭球形，囊径200±20nm，有可观察的荧光发射。

含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊的制备方法，具体步骤如下：

1)称取一定量明胶，置于定量超纯水中，于45℃恒温水浴中搅拌直到澄清，抽滤，得2％的明胶溶液，

2)取8ml2％明胶溶液，45℃恒温水浴中，600rpm转速下搅拌，向其中滴加吸附有半胱氨酸的CdTe量子点溶液1ml，

3)以超纯水稀释10倍，继续向溶液中滴加0.1ml、浓度为10mg/ml的青蒿琥酯无水乙醇溶液，

4)向溶液中缓慢而均匀地加入20％无水硫酸钠水溶液11ml，并降温至15℃，滴加适量1％氢氧化钠溶液，调pH8.0，

5)加入10μl甲醛溶液，继续搅拌30min，经4℃透析，冷冻干燥得含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊。

本发明的产品与单独的载药纳米胶囊和只包含荧光标记物的纳米胶囊不同，本产品将两种物质结合起来，共同包埋于纳米胶囊内部，并较好保持了荧光特性，为实时监测药物在体内的运输、分布及破囊释放规律提供了新的前景。本发明的制备方法操作简单，产品理化性能接近纳米青蒿琥酯胶囊。

附图说明

图1是吸附L-Cys的CdTe量子点示意图，

图2a CdTe量子点用超纯水稀释10倍，在紫外灯(365nm)照射下的荧光图，

图2b是CdTe量子点的荧光发射光谱

图2c是量子点的透射电子显微镜(TEM)图，

图3是纳米胶囊制备过程示意图，

图4a、b是含量子点的纳米青蒿琥酯胶囊扫描电镜(SEM)相片，

图5a、b、c和d是含量子点的单个纳米青蒿琥酯胶囊、多个纳米青蒿琥酯胶囊的分散情况和纳米青蒿琥酯胶囊中粘连现象的透射电子显微镜(TEM)相片，

图6是纳米胶囊的荧光特性图，

图7是不同影响因素的荧光扫描图，

图8是青蒿琥酯对量子点荧光的影响图，

图9是甲醛对量子点荧光的影响图。

具体实施方式

量子点是具有纳米尺寸的半导体晶体，由于粒径非常微小，大部分原子位于量子点的表面，这种表面原子数的增多，导致了表面原子的配位不足、不饱和键和悬空键增多，使表面原子具有高的活性，极不稳定，很容易与其它原子结合。为了提高其稳定性，增加与青蒿琥酯的相容性，本申请人在合成CdTe量子点时加入L-半胱氨酸，得到半胱氨酸吸附CdTe量子点(见图1)，其粒径在2.5～5.0nm之间，具有强烈荧光的水溶性CdTe量子点(如图2)。

本发明采用初生态微晶法，利用自组织方式实现三层纳米包装，制备含量子点的纳米青蒿琥酯胶囊。参照图3，制备的具体作法是先制备明胶溶液，在2％明胶溶液中加入经过吸附有半胱氨酸的CdTe量子点溶液，以超纯水稀释10倍，滴加青蒿琥酯无水乙醇溶液，加无水硫酸钠水溶液、氢氧化钠溶液，调pH，加入10μl甲醛溶液，透析，冷冻干燥得纳米青蒿琥酯胶囊产品。

参照图4a、b，使用日本日立SEMX-650型扫描电子显微镜(SEM)，在30kv条件下检测可知，制得的纳米胶囊为粒径在200nm左右、分散均匀、尺寸均一的球形或椭球型纳米颗粒。

使用捷克TECNAI G2 20 S-Twin型透射电子显微镜(TEM)，在200kv电压下测定，结果与上述扫描电镜扫描图基本一致，粒径在200nm左右，分散较为均匀，可观察到明显的明暗不同的三层结构(图5a、b)，证实本发明的含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊，是以量子点为核心，以半胱氨酸为过渡层，周围负载青蒿琥酯，以明胶做壁材三层包装四层结构的纳米胶囊，囊形为椭球形，囊径200±20nm。通过图5c、d也可看到胶囊会出现一定程度的粘连现象。

使用美国Perkin Elmer公司的LS55型荧光分光光度计，在激发波长(λEx)380nm，激发狭缝10nm，发射狭缝7nm条件下检测荧光，证实本发明的含量子点的纳米青蒿琥酯胶囊有可观察的荧光发射(图6)。图中蓝线是纳米胶囊的荧光特性，在590nm左右有明显的荧光发射，说明包囊后CdTe量子点的荧光得到较好的保持。此外，在450～550nm之间有强的发射峰，是由明胶的散射引起的。图中红线为明胶水溶液的荧光发射光谱，黄绿色曲线为CdTe量子点的荧光光谱。

为研制出科学合理的制备过程，本申请人作了如下实验。

一、制备过程的试验

1、量子点形貌及荧光表征与表面修饰

作了CdTe量子点形貌及荧光表征实验，在合成CdTe量子点时加入L-Cys进行稳定与表面修饰。实验结果见图2a、b、c。图2a为CdTe量子点合成后用超纯水稀释10倍拍摄而成。图2b为荧光分光光度计检测的荧光发射光谱特性，CdTe量子点的最大发射波长在590nm左右。图2c为透射电子显微镜拍摄的形貌图。

2、包装过程

在2％明胶溶液中加入经过吸附有L-Cys的CdTe量子点溶液，虽然经过修饰，量子点粒径仍属于纳米尺寸的范畴，比表面积大，表面自由能高，仍然容易结合其他物质。当把接近饱和的青蒿琥酯无水乙醇溶液滴加到含CdTe量子点的明胶水溶液中时，由于溶解度的迅速减小而析出微晶。初生态的微晶可以自成晶核，但更倾向于围绕现有晶核——量子点形成较大尺寸的晶体，以量子点为晶核生长的关键是青蒿琥酯与量子点外围的半胱氨酸具有足够的相容性。

3、盐析与交联

作为成膜材料的明胶是由大量氨基酸经肽键连接而成的线性大分子。在结构中存在大量氨基和羧基等极性基团，容易与水形成氢键而溶解，溶解产生的水化膜是明胶稳定分散于水中的主要原因。本发明在溶液中加入一定量的硫酸钠产生盐析作用，破坏了明胶外层水化膜而促使其聚凝。最后，在晶体周围聚凝的明胶与交联剂(甲醛)反应形成网状结构的囊壁，标志着纳米胶囊制备完成。

4、pH的影响试验

本申请人曾通过调节溶液pH到明胶等电点(4.8)，使明胶聚凝实现相分离，但H+的加入使荧光淬灭。故采用加入适量的无水硫酸钠使明胶团聚形成囊壁。交联前将体系pH调整到8，可减少了交联剂的用量，减少囊间交联，降低后处理负担，有利于交联成功。

二、影响含量子点的纳米青蒿琥酯胶囊质量试验

影响含量子点的纳米青蒿琥酯胶囊质量的因素很多，比如：明胶的用量、量子点的用量、青蒿琥酯无水乙醇溶液的用量、硫酸钠溶液的用量、甲醛的用量以及交联固化前体系的pH，搅拌速度、交联时的温度、药液的滴加速度等等。

1、硫酸钠溶液用量的试验

20％硫酸钠溶液作为胶囊制备的聚凝剂，使体系中明胶溶解度降低而相互靠近最终完成相分离形成囊壁，相分离的过程需要一定量的硫酸钠。如果硫酸钠的加入量过小，则无法相分离形成囊壁；但过多则使明胶分子之间聚凝过度，促使纳米胶囊之间粘连，甚至生成大量凝胶沉淀。同时过量的硫酸钠还会加重后处理负担。在15℃下，加入不同量的硫酸钠溶液的实验结果见表1。

表1：不同量的硫酸钠的明胶聚凝

-表示溶液澄清  +表示溶液浑浊

由表1可知，当加入10ml硫酸钠溶液时试管中开始产生浑浊，随着时间的延长浊度增大，在10分钟以后浊度不再改变。故在制备纳米青蒿琥酯胶囊时所使用的硫酸钠溶液用量范围应在9～11ml之间。在制备纳米胶囊的过程中，从明胶聚凝产生沉淀的现象，确定硫酸钠溶液的用量应为11ml。

2、pH对胶囊制备的影响

为了得到不可逆的胶囊壁层，成囊的最后阶段需加入甲醛使明胶分子交联产生网状结构。在pH较低的情况下，交联反应速度慢，交联不彻底，可能在后期处理过程中造成部分囊的破裂；pH过高则导致交联太快，容易造成囊间交联，多个的纳米胶囊被甲醛分子桥接形成葡萄串样的胶囊群，更严重的可产生肉眼可见的团块样白色沉淀。pH为7.0、8.0、9.0的结果见表2。从表2可见，最佳pH为8.0。

表2 不同pH下甲醛对明胶的交联

3、交联温度的影响

当规定量的甲醛被加入到溶液中时，缩合反应开始，并随着温度的升高加快，以至于过度交联形成沉淀。降低温度能使反应有序进行。然而，作为聚凝剂的硫酸钠在温度低于32.4℃时会转变为十水硫酸钠，这种物质在15℃时溶解度不大(19.63g/100ml)，如果温度继续降低，将会引起大量十水硫酸钠结晶。当温度降至0～5摄氏度范围时，体系还会形成乳白色的混浊物。故选择交联温度为15℃。

三、影响纳米胶囊荧光强度的因素

保持一定的荧光强度是本发明的关键。试验发现影响量子点荧光的因素较多，本申请人设计如表3所示的试验以考察影响荧光强度的因素。

表3 考察荧光影响因素的试验设计

除所加物料以外，均以超纯水补齐18.0ml；所用量子点浓度和体积与制备纳米胶囊时相同。图7是荧光扫描结果。从图可知青蒿琥酯对量子点荧光影响最大。

1、青蒿琥酯的影响

青蒿琥酯使量子点荧光减弱的程度与它们的相对浓度有关，本申请人试图通过下面的试验推测荧光强度降低的原因。试验方法和结果见表4。

试验的所有样品最终都以无水乙醇补足3.5ml，用于弥补因体积不同而造成的荧光强度降低。荧光强度取波长在580～600nm的平均值，用于减少曲线本身不平滑而产生的误差。图8是由试验结果绘制的曲线。从图中可见，随着青蒿琥酯量的增加量子点的荧光强度呈显著的递减趋势。

表4 青蒿琥酯对量子点荧光强度的影响

表中V_Art代表青蒿琥酯无水乙醇溶液的体积、V_CdTe代表CdTe量子点水溶液的体积、I_580～600代表580～600nm波段的平均荧光强度。

荧光的这种淬灭可能因为青蒿琥酯在量子点表面的物理覆盖，也可能与青蒿琥酯覆盖后青蒿琥酯分子中活性羧基相关。图8荧光的减弱是在极短的时间内完成的。但是在固体状态下，青蒿琥酯要和量子点发生化学反应或者分子中羧基解离出的H⁺与量子点反应都需要较长时间，应该存在较明显的时间相关。其次，青蒿琥酯层的出现可能会导致照射到量子点的激发光部分被屏蔽，青蒿琥酯的量越大，包覆层越厚，荧光损失越严重；药物的沉积还增大了量子点的体积，当体积太大不能有强烈的布朗运动时，这些具有包覆结构的物质就会聚集沉淀。因此，可以判断荧光淬灭的主要原因是青蒿琥酯的直接覆盖。

在量子点上包覆青蒿琥酯是本发明的要求，但这种包覆必然造成量子点荧光损失，因此确定适合的青蒿琥酯与量子点的比例是保持可观察的荧光信号的关键。本发明选择使量子点荧光损失20％的青蒿琥酯的滴加量，其体积为0.1ml、浓度为10mg/ml的无水乙醇溶液。

2、甲醛的影响

与青蒿琥酯不同，甲醛使荧光淬灭很可能是发生了某种化学反应，甲醛羰基氧上的孤电子对很可能和具有表面缺陷的量子点中的原子络合，量子点粒径小，表面积大，虽然经过修饰，表面仍然存在着不饱和键和悬空键，像甲醛这类小分子还是容易透过表面修饰层达到量子点表面的。表3中8号甲醛用量少，影响力度没有充分显现。表5的试验设计可用于考察甲醛的影响。图9是对数据的处理。

表5 甲醛对量子点荧光强度的影响

所有样品用超纯水稀释到18.0ml  下标cw和lc分别指代常温和冷藏

在图9中两条曲线都呈明显的下降趋势，但是常温下的曲线更陡，也就是说下降速率更快。常温曲线中的每一个点都落在冷藏曲线下方，说明反应中温度起了至关重要的作用。温度越高，甲醛分子扩散越快，越容易穿过量子点的修饰层，荧光减弱越快。但是，在甲醛量增大到500μl时，温度的影响已经不太明显，浓度的增加同样促使甲醛分子扩散加快，有更多的甲醛分子穿透修饰层使量子点荧光减弱。故本发明确定加10μl甲醛溶液。

3、其它因素的影响

加酸对荧光损失影响较大。取制备纳米胶囊时所用浓度的量子点水溶液3ml，滴加约20滴10％醋酸溶液，试管中出现红黑色沉淀，大量H⁺的存在使量子点的半胱氨酸络合体系不稳定，导致量子点聚集而沉淀。基于此，我们放弃了调等电点相分离工艺，改用盐析方法。

明胶、硫酸钠在冷藏条件下对荧光的影响不明显。

Claims (2)

1.含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊，其特征在于是以量子点为核心，以半胱氨酸为过渡层，周围负载青蒿琥酯，以明胶做壁材的三层包装四层结构的纳米胶囊，囊形为椭球形，囊径200±20nm，有可观察的荧光发射。

2.一种权利要求1所述的含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

1)称取一定量明胶，置于定量超纯水中，于45℃恒温水浴中搅拌直到澄清，抽滤，得2％的明胶溶液，

2)取8ml2％明胶溶液，45℃恒温水浴中，600rpm转速下搅拌，向其中滴加吸附有半胱氨酸的CdTe量子点溶液1ml，

3)以超纯水稀释10倍，继续向溶液中滴加0.1ml、浓度为10mg/ml的青蒿琥酯无水乙醇溶液，

4)向溶液中缓慢而均匀地加入20％无水硫酸钠水溶液11ml，并降温至15℃，滴加适量1％氢氧化钠溶液，调pH8.0；

5)加入10μl甲醛溶液，继续搅拌30min，经4℃透析，冷冻干燥得含CdTe量子点的纳米青蒿琥酯胶囊。

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