CN115372290A - 一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法 - Google Patents

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杨金茹
黄遵锡
李俊俊
吴倩
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Abstract

本发明提供一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，包括以下步骤：步骤一：利用脯氨酸消旋酶对L‑脯氨酸进行消旋反应；步骤二：将消旋反应产物与显色剂混合，在水浴锅中反应一定时间，吸取反应液来测定脯氨酸消旋酶酶活。本发明提供的方法操作简便，能有效减少反应时间，通过颜色变化直接观察酶的催化活性，使用简单的仪器测定吸光值后就可计算酶活，操作简便快捷。

Description

一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法
技术领域
本发明涉及及酶活性检测技术领域，尤其涉及一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法。
背景技术
脯氨酸是人体的非必需氨基酸，可以由L-谷氨酸生物合成。脯氨酸也是唯一具有仲胺和环状侧链的蛋白质源性氨基酸，脯氨酸代谢在多种生物过程中具有复杂的作用。如研究发现，细胞壁中基于脯氨酸的信号蛋白有助于植物在不利环境条件下继续生长。脯氨酸残基在淀粉样蛋白形成中提供调节开关，羟脯氨酸代谢异常在不同疾病的病理生理学和发病机制中起关键作用。这些研究显示了脯氨酸在生物体中的重要性，而立体结构的改变将进一步影响其功能。
脯氨酸消旋酶(PRAC，EC 5.1.1.4)是异构酶家族中的一类，可催化L-脯氨酸可逆地转化为D-脯氨酸。最初在梭菌属(Clostridium)细菌中发现，PRAC通过Stickland途径对梭菌属细菌的能量代谢进行调控，是梭菌属的主要能量来源，因此，PRAC调控的能量代谢抑制剂最近作为潜在的抗微生物剂引起了人们的兴趣。另一种研究较多的PRAC是一种真核生物来源的氨基酸外消旋酶，分离自人类致病性寄生虫原生动物锥虫。研究发现在寄生虫生命周期的所有阶段均检测到PRAC，该酶的分泌形式是一种有效的宿主B细胞有丝分裂原，可使寄生虫逃避特异性免疫反应，因此该酶也被作为治疗南美锥虫病的靶标。
对于脯氨酸消旋酶活性的检测可通过在波长365nm的旋光仪中测量旋光或通过高效液相色谱进行检测。然而该方法进行检测时，存在无法直接观察颜色变化，并且反应时间长，对仪器要求较高等问题。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法。
一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，包括以下步骤：
步骤一：利用脯氨酸消旋酶对L-脯氨酸进行消旋反应；
步骤二：将消旋反应产物与显色剂混合进行氧化反应，在水浴锅中反应一定时间，吸取反应液来测定脯氨酸消旋酶酶活。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述显色剂为Tris-Hcl、4-氨基安替比林、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、D-氨基酸氧化酶、辣根过氧化物酶中的一种。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述步骤一包括：
将L-脯氨酸和伯瑞坦-罗宾森缓冲液混合置于水浴锅中预热5min，加入脯氨酸消旋酶进行消旋反应10min，产生其对映体D-脯氨酸，加入HCl终止反应。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述L-脯氨酸的浓度为50mmol/L。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述Tris-HCl的pH＝8.0，浓度为200mmol/L；所述4-氨基安替比林的浓度为0.1mg/mL；所述N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的浓度为0.1mg/mL；所述的浓度为D-氨基酸氧化酶0.1U；所述辣根过氧化物酶的浓度为2U。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述HCl的浓度为2mol/L；伯瑞坦-罗宾森缓冲液的pH为3.0-13.0。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述脯氨酸消旋酶：L-脯氨酸：伯瑞坦-罗宾森缓冲液体积比为1:4.5:5。
进一步地，如上所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，所述消旋反应产物与显色剂的体积比为1:1。
有益效果：
本发明方法操作简便，通过消旋反应获得D-脯氨酸，之后经D-氨基酸氧化酶进行氧化反应生成H2O2，随后与显色剂反应生成紫红色物质，通过颜色变化直接观察酶的催化活性，能有效减少反应时间，使用简单的仪器测定吸光值后就可计算酶活，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明实施例测试脯氨酸消旋酶酶活的反应图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，包括：
第一步：将50mmol/LL-脯氨酸和宽范围的伯瑞坦-罗宾森缓冲液(pH＝3.0)混合置于水浴锅中预热5min，加入脯氨酸消旋酶液进行消旋反应10min，产生对映体D-脯氨酸，加入HCl终止反应；其中，所述脯氨酸消旋酶：L-脯氨酸：伯瑞坦-罗宾森缓冲液体积比为1:4.5:5；
第二步：将消旋反应产物与Tris-Hcl(pH＝8.0，浓度为200mmol/L)混合，在水浴锅中反应20min，吸取反应液，在酶标仪中，检测550nm吸光值，进而测算出酶的活性大小；所述消旋反应产物与显色剂的体积比为1:1。
图1为本发明实施例测试脯氨酸消旋酶酶活的反应图；该图显示：当脯氨酸消旋酶催化底物产生D-脯氨酸，消旋产物中的D-脯氨酸与显色剂混合后，会产生紫红色。且将消旋产物与显色剂置于水浴锅中1-5min内就能快速看到颜色出现变化，可以在短时间内直观的通过颜色变化判断酶是否有活性。
实施例2：
一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，包括：
第一步：将50mmol/LL-脯氨酸和宽范围的伯瑞坦-罗宾森缓冲液(pH＝13)混合置于水浴锅中预热5min，加入脯氨酸消旋酶液进行消旋反应10min，产生D-脯氨酸，加入HCl终止反应；其中，所述脯氨酸消旋酶：L-脯氨酸：伯瑞坦-罗宾森缓冲液体积比为1:4.5:5；
第二步：将消旋反应产物与Tris-Hcl(pH＝8.0，浓度为200mmol/L)混合，在水浴锅中反应20min，吸取反应液，在酶标仪中，检测550nm吸光值，进而测算出酶的活性大小；所述消旋反应产物与显色剂的体积比为1:1。
实施例3：
一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，包括：
第一步：将50mmol/LL-脯氨酸和宽范围的伯瑞坦-罗宾森缓冲液(pH＝8)混合置于水浴锅中预热5min，加入脯氨酸消旋酶液进行消旋反应10min，产生D-脯氨酸，加入HCl终止反应；其中，所述脯氨酸消旋酶：L-脯氨酸：伯瑞坦-罗宾森缓冲液体积比为1:4.5:5；
第二步：将消旋反应产物与Tris-Hcl(pH＝8.0，浓度为200mmol/L)混合，在水浴锅中反应20min，吸取反应液，在酶标仪中，检测550nm吸光值，进而测算出酶的活性大小；所述消旋反应产物与显色剂的体积比为1:1。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：利用脯氨酸消旋酶对L-脯氨酸进行消旋反应；
步骤二：将消旋反应产物与显色剂混合，在水浴锅中反应一定时间，吸取反应液来测定脯氨酸消旋酶酶活。
2.根据权利要求1所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述显色剂为Tris-Hcl、4-氨基安替比林、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、D-氨基酸氧化酶、辣根过氧化物酶中的一种。
3.根据权利要求1所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述步骤一包括：
将L-脯氨酸和伯瑞坦-罗宾森缓冲液混合置于水浴锅中预热5min，加入脯氨酸消旋酶进行消旋反应10min，产生对映体D-脯氨酸，加入HCl终止反应。
4.根据权利要求1所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述L-脯氨酸的浓度为50mmol/L。
5.根据权利要求3所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述Tris-HCl的pH＝8.0，浓度为200mmol/L；所述4-氨基安替比林的浓度为0.1mg/mL；所述N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐的浓度为0.1mg/mL；所述的浓度为D-氨基酸氧化酶0.1U；所述辣根过氧化物酶的浓度为2U。
6.根据权利要求3所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述HCl的浓度为2mol/L；伯瑞坦-罗宾森缓冲液的pH为3.0-13.0。
7.根据权利要求5所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述脯氨酸消旋酶：L-脯氨酸：伯瑞坦-罗宾森缓冲液体积比为1:4.5:5。
8.根据权利要求5所述的快速测定脯氨酸消旋酶酶活的方法，其特征在于，所述消旋反应产物与显色剂的体积比为1:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114854728A (zh) * 2022-05-12 2022-08-05 云南师范大学 一种脯氨酸消旋酶及其制备和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114854728A (zh) * 2022-05-12 2022-08-05 云南师范大学 一种脯氨酸消旋酶及其制备和应用
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