CN116098937A - 牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于功能植物油领域，提供了牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用，本发明发现服用牡丹籽油，后期若发生脑缺血再灌注损伤，牡丹籽油对脑缺血再灌注的损伤起到神经保护作用。具体的是牡丹籽油能够减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤，降低脑梗死面积并减轻脑水肿程度，同时降低缺脑缺血再灌注导致的神经细胞破坏程度，其保护作用可能与其抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及一氧化氮含量有关。

Description

牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用

技术领域

本发明属于功能植物油领域，特别涉及牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脑动脉闭塞引起的缺血性卒中(IS)是脑卒中最主要的发病类型。随着人口的增长和老龄化，IS的患病率持续上升。现阶段临床上，治疗IS的药物种类虽多，但不良反应也相对较多。寻找具有预防或治疗IS作用、不良反应较少、安全指数高的新物质迫在眉睫。

牡丹籽油(PSO)是以油用牡丹籽为原料，经提取精炼得到的金黄色液体油脂。牡丹籽油富含α-亚麻酸、亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸(UFA)，此外还含有维生素E、角鲨烯、植物甾醇、牡丹皂甙等多种药理活性成分。目前有研究表明，在脑缺血再灌注前给予丹皮酚预处理能通过调节蛋白表达、抑制脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡改善脑组织损伤。然而尚未有研究发现PSO对IS的保护效果作用的相关研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用，本发明发现服用牡丹籽油，后期若发生脑缺血再灌注损伤，牡丹籽油对脑缺血再灌注的损伤起到神经保护作用。具体的是牡丹籽油能够减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤，降低脑梗死面积并减轻脑水肿程度，同时降低缺脑缺血再灌注导致的神经细胞破坏程度，其保护作用可能与其抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及一氧化氮含量有关。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用。

本发明探究PSO对在体大鼠中脑缺血再灌注的神经保护效果及其潜在的作用机制。结果表明，牡丹籽油对大鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用，能够减轻神经功能损伤，降低脑梗死率并减少缺血大鼠脑含水量，这可能与其抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及一氧化氮含量有关。PSO可能是一种很有应用前景的预防和治疗缺血性中风的功能植物油。

本发明的第二个方面，提供了牡丹籽油在预防和治疗缺血性脑卒中的应用。

需要说明的是，本发明研究发现，服用牡丹籽油，后期若发生脑缺血再灌注损伤，牡丹籽油对脑缺血再灌注的损伤起到神经保护作用，是一种很好的预防和辅助治疗的手段。

本发明的第三个方面，提供了一种预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油，包括：牡丹籽油。

本发明的有益效果

(1)使用牡丹籽油可以缓解缺血性脑卒中造成的损伤。

(2)牡丹籽油对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，能够有效减轻神经功能损伤，降低脑梗死率并减少缺血大鼠脑含水量。

(3)牡丹籽油降低脑缺血再灌注损伤引起的脑神经细胞凋亡。

(4)牡丹籽油降低脑缺血再灌注损伤引发的炎症因子、NO含量，增强抗氧化作用。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为牡丹籽油对MCAO大鼠脑组织梗死面积TTC染色结果。

图2为各组大鼠血清中的COX-2、NO、TNF-α、IL-1β、MDA、SOD水平比较，A：各组大鼠血清中的COX-2水平比较；B：各组大鼠血清中的NO水平比较；C：各组大鼠血清中的TNF-α水平比较；D.各组大鼠血清中的IL-1β水平比较；E.各组大鼠血清中的MDA水平比较F.各组大鼠血清中的SOD水平比较，注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

图3为各组大鼠脑组织中的SOD、TNF-α、iNOS、IL-1β水平比较，A.各组大鼠脑组织中的SOD水平比较；B.各组大鼠脑组织中的TNF-α水平比较；C.各组大鼠脑组织中的iNOS水平比较；D.各组大鼠脑组织中的IL-1β水平比较，注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

图4为各组大鼠神经细胞HE染色结果图。

图5为各组大鼠脑细胞凋亡情况图。

图6为各组大鼠CD44因子免疫组化染色结果图。

图7为各组大鼠NEEL因子免疫组化染色结果图。

图8为各组大鼠NeuN因子免疫组化染色结果图。

图9为各组大鼠TUNEL、CD44、NEEL、NeuN计数结果。A.各组大鼠TUNEL阳性表达率；B.各组大鼠CD44阳性表达率；C.各组大鼠NEEL阳性表达率；D.各组大鼠NeuN阳性表达率。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明探究牡丹籽油对脑缺血再灌注损伤保护作用。实验期间除正常饮食饮水外，连续七日灌胃一定剂量的牡丹籽油，后通过线栓法构建大脑中动脉缺血模型，缺血2h后再灌注，再灌注24h后，进行神经功能缺失评分，脑组织梗死率，脑组织含水量等指标检测。结果表明，牡丹籽油对大鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用，能够减轻神经功能损伤，降低脑梗死率并减少缺血大鼠脑含水量，这可能与其抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及一氧化氮含量有关。

在一些实施例中，牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用。

在一些实施例中，所述应用包括：减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤。

在一些实施例中，所述应用包括：降低脑梗死面积并减轻脑水肿程度。

在一些实施例中，所述应用包括：降低缺脑缺血再灌注导致的神经细胞破坏程度。

在一些实施例中，所述应用包括：降低脑缺血再灌注损伤引发的炎症因子、NO含量，增强抗氧化作用。

在一些实施例中，牡丹籽油在预防和治疗缺血性脑卒中的应用。

本发明还公开了一种预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油，包括：牡丹籽油。

在一些实施例中，所述功能植物油为以下制剂形式中的一种：固体制剂形式的粉剂、胶囊剂、片剂、膜剂；液体制剂形式的溶液剂、合剂、糖浆剂、酊剂、注射剂；半固体制剂的膏剂和栓剂。

在一些实施例中，所述牡丹籽油的剂量为1～4mg/kg/d。

在一些实施例中，所述牡丹籽油的剂量为1、2或4mg/kg/d。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1实验材料

1)牡丹籽油，购于菏泽谷雨牡丹生物科技有限公司。

2)实验动物

SD大鼠，雄性60只，体重280-300g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，饲养于山东省科学院菏泽分院SPF级动物房。室温20-26℃，日温差≤4℃，相对湿度40-70％，明暗交替时间为12/12h。动物饲养于标准大鼠笼中。所有实验程序均经山东省科学院菏泽分院动物伦理委员会批准，并符合山东省科学院菏泽分院制定的《动物实验指南》。

实施例2实验方法

1)动物分组

SD大鼠适应性喂养一周后，使用数字表法随机分为6组，假手术组(sham group)、模型组(model group)、尼莫地平组(NMDP group)、牡丹籽油低剂量组(PSO-low-dose(PL)组)、牡丹籽油中剂量组(PSO-middle-dose(PM)组)、牡丹籽油高剂量组(PSO-high-dose(PH)组)，各组大鼠连续灌胃给药1周，NMDP灌胃给药20mg/kg/d，牡丹籽油低、中、高剂量分别灌胃给药1mL/kg/d，2mL/kg/d，4mL/kg/d，假手术组和模型组灌胃给予同体积生理盐水。

2)MCAO动物模型制备(MCAO/R)

各组大鼠末次给药1h后腹腔给予1.5％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于37℃手术台上，剃去颈部正中毛发，碘伏消毒颈部皮肤，经颈正中切口暴露、分离颈总动脉、颈内及颈外动脉，随后结扎颈外动脉远端，于颈外动脉远心端剪一小口，将尼龙线栓(头端直径0.38mm)由颈外动脉残端插入，缓慢向颈内动脉伸入，保证线栓插入深度18-20mm之间，固定线栓阻断鼠大脑中动脉血流。术中检测大鼠肛温、监测心率及平均动脉压，保证各项生理参数在正常范围，线栓2h后抽提线栓至颈外动脉残端进行再灌注，再灌注24h后观测相应指标。假手术组分离血管后不插入线栓即缝合。整个过程注意观察，如若死亡补充模型动物数量。术后单笼饲养，注意保温。

3)神经功能障碍评估

MCAO模型制备24h后，根据Zea-Longa的五级四分法进行评分：神经功能良好，未见损伤症状，0分；提大鼠尾部，可见左前肢屈曲，伸直状况不佳，无法完全达到要求，1分；行走时无法维持平衡状态，偏向左侧，转圈行走，静息时尚可，2分；行走时无法维持平衡，向左侧倾倒，站立时也无法维持平衡，呈现不稳状态，3分；无法自发行走，并且意识完全丧失，4分。

4)TTC法脑梗死面积测定

再灌注处理24小时后，取出完整脑组织。迅速置于冰箱中-20冷冻保存30min。取出后自视交叉前4mm冠状面起，向后连续5次切片，层厚2mm。取居中切片置1％TTC染色液中，避光孵育，4％多聚甲酯固定，见图1；Image-Pro Plus图像分析处理软件对脑梗死体积进行量化。根据以下公式计算脑梗死面积百分比：

脑梗死面积百分比＝(梗死面积×切片厚度)/(全脑面积×切片厚度)×100％≈梗死面积/全脑面积×100％。

5)失质量法检测脑组织含水量

再灌注处理24小时后，取脑组织，迅速测量，计为脑组织湿重。将脑组织置于干燥箱110℃干至恒重，记录所测得的重量，计为脑组织干重。根据以下公式计算脑缺血区脑组织含水量：

脑含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％。

6)血清生化指标测定

再灌注处理24小时后，腹主动脉采血，在4℃下3500rpm离心10min分离血清，采用试剂盒检测血清中环氧化酶2(COX-2)、NO、TNF-α、IL-1β、MDA、SOD的水平，具体操作严格按照试剂盒说明书操作步骤进行，结果见图2。

7)脑组织指标测定

再灌注处理24小时后，取缺血侧脑组织匀浆，4℃、3500r/min离心10min取上清液，用酶联免疫吸附法测定脑组织SOD、TNF-α、iNOS、IL-1β含量，具体操作严格按照试剂盒说明书操作步骤进行，结果见图3。

8)脑组织指标测定

(8.1)HE染色观察脑组织形态学变化

再灌注处理24小时后，取出脑组织，将其制备成石蜡切片，进行常规脱蜡至水，用苏木素液染色5-10min；用蒸馏水洗1min，清洗去苏木素液；1％盐酸乙醇溶液进行分色10s；用蒸馏水冲洗，用温水或1％氨水返蓝5-10s；再次用蒸馏水冲洗；0.5％伊红染色1-3min；蒸馏水稍洗；然后依次进行以下处理：用70％乙醇处理1-2s、80％乙醇处理1-2s、95％乙醇处理2-3min、无水乙醇3-5min，脱水；透明2次(二甲苯)；封固(中性树胶)。制作好后光学显微镜下观察大鼠缺血侧大脑皮层组织的形态学变化。

(8.2)Tunel法检测脑组织细胞凋亡情况

进行再灌注处理后计时，24小时后处死实验动物，取出脑组织，将其制备成石蜡切片。取TUNEL细胞凋亡试剂盒，对上述组织进行检测，确定凋亡情况。将石蜡切片取出，进行脱蜡处理。准备PBS，用其洗涤处理完的切片。取TDT和DIG-D-UTP混合液，滴加在上述切片上，共需要50pu。4℃下贴标签2h，这一过程要注意避免挥发，在湿盒内进行。完成后再用清洗液进行清洗。准备封闭液，加在切片上对其进行封闭，共需要40uL，室温下进行即可，共用时30min。取生物素标记抗体(1:100)，滴加在切片之上，对其进行孵育，37℃下进行，共用时40min。取清洗液对切片进行清洗。取抗荧光猝灭封闭剂，用于切片封闭。准备共聚焦荧光显微镜，将切片置于其下观察，并且拍照记录。根据绿色荧光的情况确定TUNEL阳性细胞数，并计算阳性细胞表达率的平均值，进行统计并作图。

(8.3)免疫组化测定脑组织中CD44、NEEL、NeuN的表达

再灌注处理24小时后，处死实验动物，取出完整脑组织，将其制备成石蜡切片，将切片脱蜡至水，并进行染色，先用荧光显微镜低亮度初步观察，确定有荧光后，200倍镜下随机取大脑缺血侧皮层5个不同部位进行拍摄用于统计。利用Image J软件计算各组每张切片中5个不用部位的阳性细胞表达率的平均值，进行统计并作图。

9)统计学分析应用

数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

实施例3实验结果

1)牡丹籽油对MCAO大鼠神经功能缺损的影响

表1PSO对MACO大鼠神经功能缺损评分、脑梗死率、脑含水量的影响

与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

(注：sham组：假手术组；model组：模型组；NMDP组：尼莫地平组；PL组：牡丹籽油低剂量组；PM组：牡丹籽油中剂量组；PH组：牡丹籽油高剂量组。)

结果如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠均表现出严重的神经功能损伤情况；与模型组相比较，NMDP、PM和PH组大鼠的神经功能评分显著降低(P＜0.01)。PL、PM、PH组相比较可知，随着牡丹籽油剂量的增大，大鼠脑神经功能改善也更为明显。

2)牡丹籽油对MCAO大鼠脑组织梗死率的影响

TTC染色结果如图1所示，白色部分表示梗死区域，红色部分表示非梗死区域。统计结果见1，与假手术组相比较，模型组大鼠脑梗死体积显著增加，与模型组相比较，NMDP、PL、PM和PH组大鼠的脑梗死面积显著降低(P＜0.01)；牡丹籽油各剂量组相比较可知，随着牡丹籽油剂量的增加大鼠脑梗死体积减小(p＜0.01)。

3)牡丹籽油对MCAO大鼠脑组织含水量的影响

结果见表1，与假手术组相比，模型组脑组织含水量显著升高；与模型组相比，NMDP、PL、PM和PH组神经功脑含水量显著降低(P＜0.01)；PL、PM、PH组相比较可知，大鼠脑组织含水量随着牡丹籽油剂量的增加而下降。

4)牡丹籽油对MCAO大鼠血清中COX-2、NO、MDA、TNF-α、IL-1β含量及SOD活性的影响。

结果如图2所示，与假手术组相比，模型组血清中COX-2、NO、MDA、TNF-α、IL-1β含量显著升高，SOD活性显著降低。与模型组相比，NMDP组、PL组、PM组和PH组血清中COX-2、NO、MDA、TNF-α、IL-1β含量均有所降低。

5)牡丹籽油对MCAO大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α的含量及SOD、iNOS的活性影响。

结果如图3所示，与假手术组相比，模型组脑组织SOD活性下降、iNOS的活性显著上升，此外，模型组脑组织中TNF-α、IL-1β含量显著升高。与模型组相比，NMDP、PL、PM和PH组的脑组织SOD活性显著升高；NMDP、PM和PH组脑组织iNOS活性显著降低；NMDP、PL、PM和PH组脑组织TNF-α、IL-1β含量有所降低。

6)脑组织指标测定结果

(6.1)HE染色实验结果

结果如图4所示，镜下观察可见假手术组神经细胞形态正常，排列整齐紧密，细胞核和细胞质结构完整，未见明显肿胀，核仁清晰，细胞周围无水肿；模型组可见缺血侧大脑皮质区神经元、胶质细胞坏死，神经元数量减少，小胶质细胞增生，细胞排列紊乱，细胞空泡化明显，细胞核染色深，核仁不明显；NMDP组缺血侧大脑皮质神经细胞形态较模型组破坏程度明显减弱，神经细胞可见少许空泡样改变，排列尚整齐，残存神经元数量较多，周围损伤较轻，皮质神经元和神经胶质细胞的分布大致正常；PSO组缺血侧大脑皮质神经细胞形态较模型组破坏程度明显减弱但强于NMDP组，且缺血侧大脑皮质神经细胞破坏程度为PL组＞PM组＞PH组。

(6.2)Tunel法检测脑组织细胞凋亡情况

结果如图5、图9中A所示，对于Tunel因子。镜下观察可见阳性表达主要在神经元核中表达，呈黄色颗粒状，各组中，假手术组阳性表达最弱，基本没有阳性表达；模型组在各组中呈现出最强的阳性表达；NMDP组阳性表达较模型组明显减弱；PSO组阳性表达强于NMDP组而弱于模型组，且三组阳性表达PL组＞PM组＞PH组。

(6.3)免疫组化染色实验结果

对于CD44因子，结果如图6、图9中B所示。镜下观察可见阳性表达主要在神经元中表达，呈黄色颗粒状，各组中，假手术组阳性表达最弱，只在少部分神经元中表达；模型组阳性表达最强，阳性表达在大部分神经元表达可见；NMDP组阳性表达较模型组明显减弱但强于假手术组，阳性表达在部分神经元中；PSO组阳性表达强于NMDP组而弱于模型组，且三组阳性表达PL组＞PM组＞PH组。

对于NEEL因子，结果如图7、图9中C所示。镜下观察可见阳性表达主要在神经元胞质中表达，呈黄色颗粒状，各组中，假手术组阳性表达最强，阳性表达在大部分神经元胞质中均可见；模型组阳性表达最弱；NMDP组阳性表达较模型组明显增强但强于模型组，阳性表达表现在部分神经元胞质中；PSO组阳性表达强于模型组而弱于NMDP组，且三组阳性表达PH组＞PM组＞PL组。

对于NeuN因子，结果如图8、图9中D所示。镜下观察可见阳性表达主要在神经元核和胞质中表达，呈黄色颗粒状，各组中，假手术组阳性表达最强，阳性表达在神经元胞质中均可见；模型组阳性表达最弱；NMDP组阳性表达较模型组明显增强但强于模型组；PSO组阳性表达强于模型组而弱于NMDP组，且三组阳性表达PH组＞PM组＞PL组。

本研究中得到牡丹籽油对大鼠脑缺血再灌注损伤起保护作用，能够减轻神经功能损伤，降低脑梗死率并减少缺血大鼠脑含水量，这可能与其抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及一氧化氮含量有关。PSO可能是一种很有应用前景的预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.牡丹籽油在脑缺血再灌注损伤保护中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：减轻缺血再灌注导致的神经功能损伤。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：降低脑梗死面积并减轻脑水肿程度。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：降低缺脑缺血再灌注导致的神经细胞破坏程度。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：降低脑缺血再灌注损伤引发的炎症因子、NO含量，增强抗氧化作用。

6.牡丹籽油在预防和治疗缺血性脑卒中的应用。

7.一种预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油，其特征在于，包括：牡丹籽油。

8.如权利要求7所述的预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油，其特征在于，所述功能植物油为以下制剂形式中的一种：固体制剂形式的粉剂、胶囊剂、片剂、膜剂；液体制剂形式的溶液剂、合剂、糖浆剂、酊剂、注射剂；半固体制剂的膏剂和栓剂。

9.如权利要求7所述的预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油，其特征在于，所述牡丹籽油的剂量为1～4mg/kg/d。

10.如权利要求7所述的预防和治疗缺血性脑卒中的功能植物油，其特征在于，所述牡丹籽油的剂量为1、2或4mg/kg/d。

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