CN109528742B - 松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了松果菊苷Echinacoside，ECH)作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途。本发明的实验结果表明在安全剂量范围内使用时，剂量为160mg/kg的松果菊苷可以显著改善新生大鼠缺氧缺血模型脑梗死体积和神经元损伤、凋亡，证明松果菊苷具有促进神经元缺血缺氧损伤恢复和预防新生儿缺氧缺血性脑病后致残致死的作用。

Description

松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途

技术领域

本发明涉及松果菊苷的应用，特别涉及松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途。

背景技术

在全世界范围内，新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是胎儿以及新生儿最常见的中枢神经系统疾病之一，也是其死亡率和发病率的主要因素，会导致患儿的急性死亡和慢性的神经功能障碍，如脑瘫、躁动、癫痫、学龄期智力以及记忆力低下等，严重影响着患儿，家庭和社会。在发达国家，新生儿缺氧缺血性脑病的发病率为1-8‰，而在发展中国家高达26‰，虽然目前医务工作者对新生儿缺氧缺血性脑病有各种干预和治疗方法，但其发病率和死亡率依旧很高，仍然是胎儿和新生儿的一种严重疾病。

随着现代医学技术的发展，研究者对新生儿缺氧缺血性脑病的病理有了更深入的认识。虽然其确切生化机制尚未完全阐明，但大量证据表明，氧化应激和凋亡是缺氧缺血性脑病过程中重要的发病机制。在生理条件下，内源性抗氧化系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(GAT)对活性氧(ROS)的产生和消除处于平衡状态，它们负责防御对抗氧化应激从而对减轻HIBD损伤。缺氧和缺血导致脑组织ROS过度产生，脑组织由于抗氧化能力低，耗氧量高，脂质和多不饱和脂肪酸含量高更易受到ROS的攻击。ROS具有氧化脂质、蛋白质和DNA的能力，导致细胞结构和功能的改变，最终导致神经元的氧化损伤。

氧化应激可强烈地触发细胞凋亡，导致缺氧缺血神经元死亡。细胞凋亡是缺氧缺血性脑病神经元病理损伤的重要机制。在缺氧缺血病理条件下，神经元凋亡被激活，从而导致脑功能的损害。许多研究表明，缺氧缺血性脑病后会发生细胞凋亡。caspase家族中成员caspase-3是主动执行凋亡的，它参与细胞凋亡的最后执行阶段。此外，抗凋亡和促凋亡蛋白(Bcl-2，Bax)的平衡对细胞死亡有显著的调节作用。因此，通过抑制caspase-3的表达，，调节Bax/Bcl-2的平衡，从而对减少缺氧缺血性脑病损伤具有重要的理论意义及积极的临床应用前景。

松果菊苷(Echinacoside,ECH)是肉苁蓉的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神经保护作用。松果菊苷已被证明在各种体外和体内脑损伤模型中发挥神经保护作用。据报道，松果菊苷可降低MCAO诱导的缺血性脑损伤中MDA含量，提高SOD和GSH活性从而改善脑损伤。此外，Du Juan等研究表明松果菊苷通过减少神经细胞凋亡来保护大脑免受缺血损伤。然而，体内研究松果菊苷对缺氧缺血性脑病的作用却未见文献报道，因此将其发展为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的治疗药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明的目的是通过对松果菊苷的药理作用研究，提供松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物的用途。

本发明提供松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途，所述松果菊苷的结构式如式(1)所示：

本发明所用的松果菊苷均可经商购获得。

具体地，所述新生儿缺氧缺血性脑损伤为急性期或修复期的新生儿缺氧缺血性脑损伤。

具体地，所述松果菊苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。

具体地，所述松果菊苷单次应用剂量为40-160mg/kg。

优选地，所述松果菊苷单次应用剂量为80-160mg/kg。

优选地，所述松果菊苷单次应用剂量为160mg/kg。

具体地，所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

优选地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型或注射液剂型。

具体地，所述的松果菊苷作为唯一活性成分在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的用途。

本发明提供的松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途具有以下有益效果：

(1)松果菊苷在不降低血糖的剂量下能显著减少脑梗死体积和神经元凋亡率；

(2)松果菊苷能减少氧化应激引起的氧化损伤，显著抑制缺氧缺血后脑组织Caspase3，Bax蛋白的表达以及促进Bcl-2蛋白的表达。

本发明人发现松果菊苷具有改善新生儿缺氧缺血性脑损伤的作用，可用于制备新生儿缺氧缺血性脑损伤的治疗药物。

附图说明

图1为松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的TTC染色图(与假手术组比较：##P<0.01，与模型组比较：＊＊P<0.01(x±s，n＝6))。

图2为松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血后脑组织病理变化影响的大脑海马CA3区和大脑皮层病理变化HE染色图。

图3为松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血后脑组织病理变化影响大脑海马CA3区和大脑皮层病理变化Nissl染色图。

图4为松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血后脑组织皮层神经元凋亡影响的TUNEL染色图(与假手术组比较：##P<0.01，与模型组比较：＊＊P<0.01(x±s，n＝6))。

图5为松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血后脑组织氧化应激指标影响(与假手术组比较：##P<0.01，与模型组比较：＊＊P<0.01，*P<0.05(x±s，n＝6))。

图6为松果菊苷对新生大鼠缺血侧脑组织Caspase3蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：##P<0.01，与模型组比较：＊＊P<0.01(x±s，n＝6))。

图7为松果菊苷对新生大鼠缺血侧脑组织Bcl-2蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：##P<0.01，与模型组比较：＊＊P<0.01，*P<0.05(x±s，n＝6))。

图8为松果菊苷对新生大鼠缺血侧脑组织Bax蛋白表达水平的影响(与假手术组比较：##P<0.01，与模型组比较：＊＊P<0.01(x±s，n＝6))。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例中使用的松果菊苷均为式(1)所示的结构。松果菊苷(纯度＞99.43％，分子量786.73)

实施例1

松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途，其中，新生儿缺氧缺血为急性期缺血缺氧性脑损伤，松果菊苷单次应用剂量为新生大鼠40mg/Kg，药物的剂型为注射液剂型。

实施例2

松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途，其中，新生儿缺氧缺血为修复期缺血缺氧性脑损伤，松果菊苷单次应用剂量为新生大鼠80mg/Kg，药物的剂型为粉针剂型。

实施例3

松果菊苷作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的制药用途，其中，新生儿缺氧缺血为修复期缺血缺氧性脑损伤，松果菊苷单次应用剂量为新生大鼠160mg/Kg，药物的剂型为粉针剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

120只7日龄SD大鼠(12-17g)，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(宁)2015-0001。在12h/12h的明/暗循环下，动物置于温度(22-24℃)和湿度(40-70％)可控的环境中，食物和水可以自由获得。实验前，将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

松果菊苷(北京中科质检生物技术有限公司)，以生理盐水配制，母液浓度160mg/Kg，-4℃贮存。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，购自sigma公司)，苏木精-尹红(美国Sigma公司)，Nissl染液(北京索莱宝科技有限公司)，TUNEL试剂盒(德国，Roche公司)，氧化试剂盒(SOD，GSH-Px，CAT，T-AOC和MDA，南京建成生物工程研究所)，兔抗Caspase3、Bax和Bcl-2(购自protein、Abcam公司)，酶标仪(1510，ThermoFisher公司)，激光共聚焦显微镜(TCS-SP，德国公司)，电泳仪、电转仪(Powerpac basic，美国Bio-Rad公司)，凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3实验动物分组及给药

7日龄新生大鼠随机分为假手术组，缺氧缺血(HIBD)模型组，松果菊苷不同剂量组(40/80/160mg/Kg)。手术造模后按0.1ml/10g体重12h/次腹腔给药。假手术组用相同的方法给予等量的生理盐水。缺氧缺血48h后进行脑梗死体积、组织病理与形态学改变、氧化应激指标，分子生物学表达变化等药效学评价。

1.4新生大鼠缺氧缺血(HIBD)模型建立

参照Rice法，将7日龄SD大鼠放入含乙醚的密闭玻璃缸内进行吸入麻醉，60-90s麻醉后固定于操作台上。在颈部自甲状软骨下缘正中作一长约1.0cm皮肤切口，钝性分离皮下组织和肌肉，分离左侧颈总动脉，穿过4.0号丝线，双线结扎血管，中间剪断，用无损伤线缝合伤口后放回鼠笼，每只动物手术时间不超过5分钟，放回母鼠笼恢复2小时。而后放入恒温缺氧箱(92％氮气和8％氧气混合气体)缺氧2.5h，同时用测氧仪监测箱内氧浓度，使氧浓度保持在8％。术后，幸存的新生大鼠取出后恢复正常氧供，之后放回母鼠笼里继续喂养，48h后进行以下检测。假手术组仅切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉，不结扎，直接缝合，不缺氧。在整个实验过程中，房间温度应保持在26℃，湿度60-70％。

二、实验过程

(一)脑梗死体积测定

1.1实验方法：

乙醚麻醉新生大鼠后，在冰上迅速断头取脑，去除嗅球、小脑及低位脑干，滴加适量的组织包埋液-20℃冷冻15min。自前极(anterior pole)冠状面连续切取5片厚度的2mm脑切片置于2％TTC染液中37℃避光孵育15min，而后在10％甲醛中性缓冲液(pH7.4)固定过夜。自动微距相机拍摄，Image pro plus5.1图像分析软件计算并统计脑梗死体积。

表1.松果菊苷对缺氧缺血脑缺血损伤新生大鼠梗死体积的影响(x±s,n＝6)

(与假手术组比较：##p<0.01；与模型组比较：**p<0.01)

1.2实验结果：

由表1和图1可以看出，单次腹腔注射松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血所致脑梗死体积的增加呈双向反应，随剂量增加脑梗死体积降低，至160mg/kg时保护作用最强(与模型组相比：**P﹤0.01)。提示松果菊苷(160mg/kg、80mg/kg)具有减少新生大鼠缺氧缺血后脑梗死体积的作用。

(二)HE染色观察组织结构病理变化

2.1实验方法：

苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE staining)，组织石蜡切片于80℃烘箱中烘烤30min，切片依次浸泡于二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(5min)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)进行常规梯度的脱蜡复水，水洗3次，之后于苏木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的盐酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，伊红溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蜡切片继续依次浸泡于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，无水乙醇Ⅰ(1min)，无水乙醇Ⅱ(3min)，二甲苯Ⅰ(2min)和二甲苯Ⅱ(2min)，最后用中性树胶封片，置于显微镜下观察，每张切片分别取200×和400×两个视野，每个视野分别取3-6个区域进行拍照记录。

2.2实验结果：

如图2所示，单次腹腔注射松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血所致的脑组织结构病理变化影响呈现双向反应，与缺氧缺血模型组相比，松果菊苷剂量增加，脑缺血区域的海马CA3区和皮层病理损伤变化减轻，神经元密度增加，水肿、空泡样改变减弱，核固缩边集减弱。提示松果菊苷(160mg/kg)具有减轻新生大鼠缺氧缺血后脑组织结构病理性损伤的作用。

(三)尼氏染色观察组织结构坏死变化

3.1实验方法：

尼式染色(Nissl staining)，石蜡切片进行梯度脱蜡复水，步骤同2.1，用水洗去石蜡切片表面的酒精。滴加Nissl染液后于56℃烤箱孵育1h，水洗3次，用Nissl分化液分化30s-120s，直至在显微镜下观察背景接近于无色为止，最后用中性树胶封片，置于显微镜下观察。每张切片分别取200×和400×两个视野，每个视野分别取3-6个区域进行拍照记录。

3.2实验结果：

如图3所示，单次腹腔注射松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血所致的脑组织结构坏死变化影响呈现双向反应，与缺氧缺血模型组相比，松果菊苷剂量增加缺血侧海马CA3区和皮质损伤性病理变化逐渐减弱，神经元逐渐增多，排列趋于整齐，尼氏小体数量逐渐增加。给予松果菊苷160mg/kg时，神经元组织病理损伤最轻，提示松果菊苷对新生大鼠缺氧缺血损伤后脑组织坏死的神经元具有保护作用。

(四)TUNEL染色法测定新生大鼠缺氧缺血损伤侧皮层坏死细胞

4.1实验方法：

石蜡切片于80℃烘箱烘30min，常规脱蜡复水，步骤同2.1。切片浸入蛋白酶K(20μg/ml in 10mM Tris/Hcl,PH 7.4-8)工作液中30-37℃孵育20min，PBS洗三次后(5min/次)，加入TUNEL染液，暗盒37℃孵育60min，PBS洗后，滴加荧光染料DAPI处理15min封片，每张切片在皮层各取6个区域，400×视野下激光共聚焦观察、拍照，并用IPP软件统计各组新生大鼠缺血侧大脑皮层中TUNEL免疫阳性细胞的数量。

4.2实验结果：

如图4所示，用TUNEL染色法检测组织坏死细胞的表达的强度。激光共聚焦显微镜下，各组新生大鼠脑缺血侧皮层组织切片均可见阳性信号表达。与假手术组相比，缺氧缺血(HI)模型组中TUNEL免疫阳性细胞表达数量及其信号强度显著增强(**P﹤0.01)。给予松果菊苷(160mg/kg)处理后，可以显著减少缺血皮层TUNEL免疫阳性细胞数量及其阳性信号强度(**P﹤0.01)。提示松果菊苷可以减少坏死神经元而对新生大鼠缺血缺氧脑损伤发挥一定的保护作用。

(五)新生大鼠缺氧缺血损伤侧脑组织氧化应激水平的检测

5.1实验方法：

缺血侧组织置于干净的玻璃匀浆器中，用生理盐水制成10％(w/v)的组织匀浆，4℃，2500rpm离心10min。取上清液，用BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度。然后依次按照氧化试剂盒的步骤进行检测。

5.2实验结果：

如图5所示，与假手术组比较，经历缺氧缺血损伤后，脑组织内的SOD，GSH-Px，CAT和T-AOC抗氧化酶活性显著降低，氧化产物MDA的含量显著升高(*P﹤0.05,**P﹤0.01)。给予松果菊苷(80/160mg/kg)处理之后，抗氧化酶活性增加，MDA水平降低(*P﹤0.05,**P﹤0.01)。提示松果菊苷可以通过减少氧化应激对缺氧缺血脑损伤发挥一定的保护作用。

(六)Western blot检测新生大鼠脑缺血损伤侧脑组织Caspase3蛋白的表达

6.1实验方法：

使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白含量检测试剂盒测定样本总蛋白质浓度并标定蛋白统一浓度。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，用将PVDF膜在200mA条件下湿法转膜2h。转膜结束后取出PVDF膜，将其置入5％脱脂奶粉封闭液中封闭2h。封闭后孵育用5％脱脂奶粉稀释的一抗，4℃过夜，次日室温复温1h，PBST洗膜后孵育二抗。洗膜后滴加蛋白化学发光剂(ECL)进行曝光。凝胶图像分析成像系统对胶片上每个目的条带进行拍照，用Quantity One软件进行灰度分析。

6.2实验结果：

如图6所示，与假手术组比较，缺氧缺血(HI)模型组，Caspase3蛋白表达显著增多。与模型组比较，松果菊苷(160mg/kg)组新生大鼠脑缺血侧脑组织Caspase3蛋白表达明显减少(**P﹤0.01)。提示松果菊苷的保护作用可能通过减少Caspase3的表达，减少缺氧缺血损伤后凋亡的产生，从而促进脑缺血后神经元的存活，对新生儿缺氧缺血性脑损伤起到一定的保护作用。

(七)Western blot检测新生大鼠脑缺血损伤侧脑组织Bcl-2蛋白的表达

7.1实验方法：

同6.1

7.2实验结果：

如图7所示，与假手术组比较，缺氧缺血(HI)模型组，Bcl-2蛋白表达显著减少。与模型组比较，松果菊苷(160mg/kg)组新生大鼠脑缺血侧脑组织Bcl-2蛋白表达明显增加(*P﹤0.05)。提示松果菊苷的保护作用可能通过增加Bcl-2的表达，减少缺氧缺血损伤后凋亡的产生，从而促进脑缺血后神经元的存活，对新生儿缺氧缺血性脑损伤起到一定的保护作用。

(八)Western blot检测新生大鼠脑缺血损伤侧脑组织Bax蛋白的表达

8.1实验方法：

同6.1

8.2实验结果：

如图8所示，与假手术组比较，缺氧缺血(HI)模型组，Bax蛋白表达显著增加。与模型组比较，松果菊苷(160mg/kg)组新生大鼠脑缺血侧脑组织Bax蛋白表达明显降低(**P﹤0.01)。提示松果菊苷的保护作用可能通过减少Bax的表达，减少缺氧缺血损伤后凋亡的产生，从而促进脑缺血后神经元的存活，对新生儿缺氧缺血性脑损伤起到一定的保护作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.松果菊苷在制备治疗新生儿缺氧缺血性脑病的药物中的用途，其特征在于，所述松果菊苷的结构式如式(1)所示：

所述缺氧缺血性脑损伤为急性期新生儿缺氧缺血性脑损伤。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，松果菊苷单次应用剂量为40－160mg/kg。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，松果菊苷单次应用剂量为80－160mg/kg。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，松果菊苷单次应用剂量为160mg/kg。

5.根据权利要求1－4任一项所述的用途，其特征在于，所述药物被配制为通过胃肠道或肠胃外给予的剂型。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型、注射液剂型或粉针剂。

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