CN116083563A - 一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测技术及方法。具体地，本发明提供检测DNA甲基化的试剂，所述试剂包含检测对象样品中的DNA序列或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一种或多种。本方法利用检测粪便肠癌相关基因甲基化水平，实现更高准确率更低成本的肠癌无创筛查目的。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测技术及方法。
背景技术
结直肠癌(CRC，大肠癌)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，对男性和女性均有影响。随着人们生活习惯的改变，其发病率和死亡率明显上升。由于大部分患者在早期未能及时发现并得到治疗，肠癌死亡率居高不下。
肠癌是高发癌症中最适合筛查的癌症之一。肠癌发生缓慢，需要十年及以上的时间，通常是从结肠或直肠小的非癌性息肉开始的，如果通过筛查，肠癌可以早期被发现。早发现早治疗最有可能成功，因此肠癌又是最容易治愈的癌症之一。早期肠癌患者手术5年生存率达90％以上，而中晚期患者5年生存率仅10％左右。在美国，通过肠癌早期筛查，肠癌发病率降低了近40％，死亡率下降了51％。因此，早筛，早诊，早治疗对肠癌显得尤为重要。
目前，传统的肠癌检测方法有多种，但均存在不足。其中，粪便隐血检测(FOBT/FIT)常用于临床，检测简便，成本低，受检者可自行取样，但是灵敏度和特异性较低；CT检查对早期以及小直径病灶检出率有限，且存在辐射；肠镜检查是肠癌诊断的金标准，但是侵入性，患者依从性低，有肠穿孔和麻醉风险。
粪便DNA检测作为一种新兴的肠癌无创筛查，其灵敏性和特异性均优于粪便隐血检测，是一种无创、无痛，用户依从性好的筛查方式。但是国内市场上肠癌筛查产品的检测基因比较单一，所以本领域仍需一种灵敏度更高的检测方法。
发明内容
本发明提供了一种对样品中多个基因甲基化水平进行检测，利用检测粪便肠癌相关基因甲基化水平，实现更高准确率更低成本的肠癌无创筛查目的。
本发明第一方面提供检测DNA甲基化的试剂，所述试剂包含检测对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列中的一种或多种或全部：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列至少包含TFPI2和ITGA4；进一步地，所述DNA序列还包含SDC2和VIM中的一个或两个；更进一步地，所述DNA序列还包含：NDRG4和BMP3中的一个或两个，例如NDRG4和任选的BMP3。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含TFPI2和ITGA4。进一步地，所述DNA序列还包含以下任一组：(1)SDC2，(2)NDRG4、BMP3、SDC2，(3)NDRG4、SDC2、VIM，(4)NDRG4、SDC2，(5)VIM，(6)NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。
在一个或多个实施方案中，所述试剂用于检测肠癌或肠癌前病变。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含至少3个CpG二核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述的片段长度为1-1000bp，优选1-700bp。
在一个或多个实施方案中，所述片段是基因序列的启动子区域。
在一个或多个实施方案中，所述片段包含至少1个，优选至少3个CpG二核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述DNA序列或其片段或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。所述引物分子至少9bp。
在一个或多个实施方案中，所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
在一个或多个实施方案中，所述引物至少包含SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:18和19；进一步地，所述引物还包含组(1)SEQ ID NO:12和13与(2)SEQ ID NO:16和17中的任一组或两组；更进一步地，所述引物还包含：组(3)SEQ ID NO:8和9与(4)SEQ ID NO:10和11中的任一组或两组。
在一个或多个实施方案中，所述引物包含SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:18和19。进一步地，所述引物还包含以下任一组：(1)SEQ ID NO:12和13，(2)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:10和11、SEQ ID NO:12和13，(3)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:12和13、SEQ IDNO:16和17，(4)NDRG4、SEQ ID NO:12和13，(5)SEQ ID NO:16和17，(6)SEQ ID NO:8和9、SEQID NO:10和11、SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:16和17。
在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。
在一个或多个实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针，所述检测探针具有SEQ ID NO:22-27中任一项或多项或全部所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述探针至少包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；进一步地，所述DNA序列还包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26中的一个或两个；更进一步地，所述DNA序列还包含：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中的一个或两个。
在一个或多个实施方案中，所述探针包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。进一步地，所述DNA序列还包含以下任一组：(1)SEQ ID NO:24，(2)SEQ ID NO:22、EQ ID NO:23、SEQ ID NO:24，(3)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26，(4)SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24，(5)SEQ ID NO:26，(6)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:22所示的探针具有可检测物FAM，SEQ IDNO:23所示的探针具有可检测物HEX，SEQ ID NO:24所示的探针具有可检测物ROX，SEQ IDNO:25所示的探针具有可检测物FAM，SEQ ID NO:26所示的探针具有可检测物HEX，SEQ IDNO:27所示的探针具有可检测物ROX。
在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物，优选人。优选地，所述样品来自哺乳动物的粪便。
本发明另一方面还提供物质在制备用于诊断对象肠癌或肠癌前病变或筛查肠癌高危人群的试剂盒中的用途，所述物质包含：
(a)用于确定对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂或装置，和
任选的(b)所述DNA序列或其片段经处理的核酸分子，所述处理使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，任选的(c)用于捕获所述DNA序列或其片段的捕获试剂，
任选的(d)，处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，例如将能够未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
其中，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含至少3个CpG二核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述片段长度为1-1000bp，优选1-700bp。
在一个或多个实施方案中，所述片段是基因序列的启动子区域。
在一个或多个实施方案中，所述片段包含至少1个，优选至少3个CpG二核苷酸。
在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含引物分子和/或探针分子。
在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述DNA序列或其片段或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。所述引物分子至少9bp。
在一个或多个实施方案中，所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。
在一个或多个实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针，所述检测探针具有SEQ ID NO:22-27中任一项或多项或全部所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:22所示的探针具有可检测物FAM，SEQ IDNO:23所示的探针具有可检测物HEX，SEQ ID NO:24所示的探针具有可检测物ROX，SEQ IDNO:25所示的探针具有可检测物FAM，SEQ ID NO:26所示的探针具有可检测物HEX，SEQ IDNO:27所示的探针具有可检测物ROX。
在一个或多个实施方案中，(c)所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂。优选地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针。
在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂至少包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的捕获探针；进一步地，所述捕获试剂还包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5中的一个或两个所示的捕获探针；更进一步地，所述捕获试剂还包含：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一个或两个所示的捕获探针。
在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的捕获探针。进一步地，所述捕获试剂还包含以下任一组所示的捕获探针：(1)SEQ ID NO:3，(2)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，(3)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5，(4)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3，(5)SEQ ID NO:5，(6)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5。
在一个或多个实施方案中，(d)所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂。更优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。
在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。
在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物的粪便样品。
在一个或多个实施方案中，所述样品包括基因组DNA。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列经转化，其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所述转化使用亚硫酸氢盐试剂进行，优选用亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合处理。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。优选地，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、Mg2+。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法中的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，所述其他试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其衍生物，荧光染料，荧光淬灭剂，荧光报告剂，内标，对照物。
在一个或多个实施方案中，PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、KCl、MgCl2和(NH4)2SO4。优选地，Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括粪便处理试剂，所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及抗生素。
本发明另外一方面还提供一种诊断肠癌或肠癌前病变或筛查肠癌高危人群的方法，包括：(1)检测对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸的甲基化水平，(2)将所述甲基化水平与对照比较，从而筛查肠癌或肠癌前病变，所述DNA序列包括以下基因序列中的一种或多种或全部：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4。其中，若以下任一组所示的基因的甲基化水平提高，则表明所述个体患有肠癌或肠癌前病变，或者所述个体有形成肠癌或肠癌前病变的风险，或者所述个体有肠癌或肠癌前病变的可能性增加，或者所述个体有肠癌或肠癌前病变预后不良的风险：(1)TFPI2、ITGA4、SDC2，(2)TFPI2、ITGA4、NDRG4、BMP3、SDC2，(3)TFPI2、ITGA4、NDRG4、SDC2、VIM，(4)TFPI2、ITGA4、NDRG4、SDC2，(5)TFPI2、ITGA4、VIM，(6)TFPI2、ITGA4、NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列至少包含TFPI2和ITGA4；进一步地，所述DNA序列还包含SDC2和VIM中的一个或两个；更进一步地，所述DNA序列还包含：NDRG4和BMP3中的一个或两个，例如NDRG4和任选的BMP3。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含TFPI2和ITGA4。进一步地，所述DNA序列还包含以下任一组：(1)SDC2，(2)NDRG4、BMP3、SDC2，(3)NDRG4、SDC2、VIM，(4)NDRG4、SDC2，(5)VIM，(6)NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。
在一个或多个实施方案中，所述对照是健康对象的所述肠癌相关序列的甲基化水平。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含至少3个CpG二核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述片段长度为1-1000bp，优选1-700bp。
在一个或多个实施方案中，所述片段是基因的启动子区域。
在一个或多个实施方案中，所述片段包含至少1个，优选至少3个CpG二核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包含DNA抽提和/或质检。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括使用本文所述的引物分子、检测探针进行所述检测。
在一个或多个实施方案中，所述检测包括但不限于：基于重亚硫酸盐转化的PCR、DNA测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱。
在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物的粪便样品。所述哺乳动物优选为人。
在一个或多个实施方案中，所述样品包括基因组DNA。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列经转化，其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所述转化使用亚硫酸氢盐试剂进行，优选用亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合处理。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：用转化试剂处理样品中的DNA的步骤，使未甲基化的胞嘧啶转化为与鸟嘌呤结合能力低于胞嘧啶的碱基(尿嘧啶)，然后使用引物进行PCR扩增，所述引物适用于扩增所述DNA序列或其片段。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括用粪便处理试剂处理粪便样品的步骤。所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及抗生素。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括将经裂解的粪便样品与PVPP孵育以去除会影响后续反应的抑制剂的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括用基因捕获试剂从样品中提取靶基因DNA的步骤。基因捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针。所述孵育优选在异硫氰酸胍的存在下进行。在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂至少包含SEQID NO:4和SEQ ID NO:6所示的捕获探针；进一步地，所述捕获试剂还包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5中的一个或两个所示的捕获探针；更进一步地，所述捕获试剂还包含：SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2中的一个或两个所示的捕获探针。
在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的捕获探针。进一步地，所述捕获试剂还包含以下任一组所示的捕获探针：(1)SEQ ID NO:3，(2)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，(3)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5，(4)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3，(5)SEQ ID NO:5，(6)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括：
(a)从个体粪便获取含有DNA的生物样品，
(b)采用相应基因的特异性捕获试剂，从所述生物样品中富集特异性待检基因DNA；优选地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针；所述试剂盒还可包含用于捕获ACTB的捕获探针包含SEQ ID NO:7，
(c)用转化试剂处理步骤(b)中获取的所述生物样品中的DNA，所述试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，从而获得经转化试剂处理的DNA；优选地，用转化试剂处理所述DNA，使未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶；所述转化试剂包括亚硫酸氢盐试剂，优选包括亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合，
(d)用荧光定量PCR扩增从步骤(c)获取的所述经处理的DNA中的至少一个目标标志物的至少一部分，并且所述至少一个目标标志物包含选自下组中的一种或多种标记物：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM、ITGA4；优选地，使用SEQ ID NO:8-19所述的引物和SEQ IDNO:22-27所述的探针进行所述荧光定量PCR扩增；更优选地，使用SEQ ID NO:8-21所述的引物和SEQ ID NO:22-28所述的探针进行所述荧光定量PCR扩增；
(e)从步骤(d)获取的DNA来分别定量分析至少一个目标标志物的甲基化水平；优选地，步骤(e)包括：通过扩增产物的有或无、或者序列鉴定(例如基于探针的PCR检测鉴定或DNA测序鉴定)确定至少一个CpG的甲基化水平，
(f)分别比较步骤(d)中的所述至少一个目标标志物的甲基化水平和相应的参考水平，确定待检个体是否为肠癌高危人群，指导临床肠镜检查确诊；优选地，分别定量比较步骤(d)中的所述至少一个目标标志物的甲基化水平和相应的参考水平，其中一个或多个目标标志物相对于其相应的参考水平具有相同或更高的甲基化水平表明所述个体患有肠癌或肠癌前病变，或者所述个体有形成肠癌或肠癌前病变的风险，或者所述个体有肠癌或肠癌前病变的可能性增加，或者所述个体有肠癌或肠癌前病变预后不良的风险。
在一个或多个实施方案中，使用SEQ ID NO:8-19所示的引物和SEQ ID NO:22-27所示的探针通过荧光定量PCR检测靶基因DNA，若检测到扩增信号则诊断对象患有肠癌或肠癌前病变。
本发明另一方面还提供检测肠癌或肠癌前病变或筛查肠癌高危人群的试剂盒，包含：
(a)用于确定对象的样品中DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂或装置，和
任选的(b)所述DNA序列或其片段经处理的核酸分子，所述处理使未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，
任选的(c)用于捕获所述DNA序列或其片段的捕获试剂，
其中，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一个或多个。
在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂。优选地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针。在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂至少包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的捕获探针；进一步地，所述捕获试剂还包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5中的一个或两个所示的捕获探针；更进一步地，所述捕获试剂还包含：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的一个或两个所示的捕获探针。
在一个或多个实施方案中，所述捕获试剂包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示的捕获探针。进一步地，所述捕获试剂还包含以下任一组所示的捕获探针：(1)SEQ ID NO:3，(2)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，(3)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5，(4)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3，(5)SEQ ID NO:5，(6)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5。
优选地，所述试剂盒还包含用于捕获ACTB的捕获探针，例如SEQ ID NO:7所示的探针。
在一个或多个实施方案中，(b)用作阳性对照。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒适用于本文任一实施方案所述的用途。
在一个或多个实施方案中，所述试剂包含引物分子和/或检测探针。
在一个或多个实施方案中，所述试剂包含与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述DNA序列或其片段或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。在一个或多个实施方案中，所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。在一个或多个实施方案中，所述引物至少包含SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:18和19；进一步地，所述引物还包含组(1)SEQ ID NO:12和13与(2)SEQ ID NO:16和17中的任一组或两组；更进一步地，所述引物还包含：组(3)SEQ ID NO:8和9与(4)SEQ ID NO:10和11中的任一组或两组。
在一个或多个实施方案中，所述引物包含SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:18和19。进一步地，所述引物还包含以下任一组：(1)SEQ ID NO:12和13，(2)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:10和11、SEQ ID NO:12和13，(3)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:12和13、SEQ IDNO:16和17，(4)NDRG4、SEQ ID NO:12和13，(5)SEQ ID NO:16和17，(6)SEQ ID NO:8和9、SEQID NO:10和11、SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:16和17。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含扩增ATCB的引物，例如SEQ ID NO:20和21所示。
在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。
在一个或多个实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针。所述检测探针具有SEQ ID NO:22-27中任一项或多项或全部所示的序列。在一个或多个实施方案中，所述探针至少包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；进一步地，所述DNA序列还包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26中的一个或两个；更进一步地，所述DNA序列还包含：SEQ ID NO:22和SEQID NO:23中的一个或两个。
在一个或多个实施方案中，所述探针包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。进一步地，所述DNA序列还包含以下任一组：(1)SEQ ID NO:24，(2)SEQ ID NO:22、EQ ID NO:23、SEQ ID NO:24，(3)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26，(4)SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24，(5)SEQ ID NO:26，(6)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含与ATCB杂交的检测探针，例如SEQID NO:28所示。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:22所示的探针具有可检测物FAM，SEQ IDNO:23所示的探针具有可检测物HEX，SEQ ID NO:24所示的探针具有可检测物ROX，SEQ IDNO:25所示的探针具有可检测物FAM，SEQ ID NO:26所示的探针具有可检测物HEX，SEQ IDNO:27所示的探针具有可检测物ROX，SEQ ID NO:28所示的探针具有可检测物CY5。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含第一容器和第二容器，其中第一容器含有针对基因NDRG4、BMP3、SDC2和任选的ACTB的引物和检测探针，第二容器含有针对基因TFPI2、VIM、ITGA4和任选的ACTB的引物和检测探针。优选地，第一容器含有SEQ ID NO:8-13所示的引物和22-24所示的检测探针，第二容器含有SEQ ID NO:14-19所示的引物和25-27所示的检测探针；更优选地，第一容器和第二容器还分别含有SEQ ID NO:20和21所示的引物和28所示的检测探针。
在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。
在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物的细胞。在一个或多个实施方案中，所述样品是人的粪便样品。
在一个或多个实施方案中，所述样品包括基因组DNA。
在一个或多个实施方案中，所述DNA序列经转化，其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所述转化使用非酶促方法进行，优选用亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其组合处理。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点。在一个或多个实施方案中，所述转化试剂使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。优选地，所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂。更优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。优选地，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、Mg2+。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的试剂，所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，所述试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐及其衍生物、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、内标、对照物。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含转化DNA序列的试剂，所述转化使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。优选地，所述试剂盒包含亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括粪便处理试剂，所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及抗生素。
本发明具有以下有益效益：
本发明公开了一种粪便多靶点甲基化基因筛查肠癌技术方法。本发明采用多靶点(6个靶点基因)甲基化基因检测粪便中的癌源性DNA标记物，这些特定的DNA标记物包括BMP3、NDRG4、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4基因中CpG岛胞嘧啶甲基化。同时选择ACTB作为检测内参基因，评估粪便人源DNA质量是否合格。多靶点甲基化基因检测以达到增加肠癌筛查检测的敏感性。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明针对目前肠癌检测方法灵敏度和特异性较低或侵入性强且有潜在损伤等问题，提供一种用甲基化基因组合诊断肠癌或筛查肠癌高危人群的分子检测方法。具体地，本发明采用多靶点甲基化基因检测粪便中与肠癌以及肠癌前病变相关的DNA标记物，这些特定DNA标记物包括N-Myc下游调节基因4(NDRG4)、骨形态发生蛋白3(BMP3)、Syndecan-2(SDC2)、组织因子途径抑制物2(TFPI2)、vimentin(VIM)和整合素α4(ITGA4)基因中CpG岛胞嘧啶甲基化。同时选择ACTB作为检测内参基因，评估粪便人源DNA的质量。
本文中，“诊断”和“筛查”肠癌或肠癌前病变包括：鉴定个体是否患有肠癌或肠癌前病变，或者个体是否有形成肠癌或肠癌前病变的风险，或者个体的肠癌或肠癌前病变的可能性是否增加，或者个体是否有肠癌或肠癌前病变预后不良的风险。
如本文所用，术语“甲基化标志物”或“目标标志物”是指这样的目的核酸、基因区域或甲基化位点：其甲基化水平指示着肠癌或肠癌前病变。因此，“甲基化标志物”或“目标标志物”包括作为标记物的相应基因，其DNA序列或片段或它们经转化的序列，这些序列具有能指示肠癌的甲基化修饰。甲基化标志物应被认为包括其所有转录变体及其所有启动子和调控元件。另外，应当理解，甲基化标志物应既包括标志物或基因的正义链序列，也包括标志物或基因的反义链序列。本文所用的术语“甲基化标志物”被广泛地解释为既包括1)在生物样品或基因组DNA中发现的原始标志物(处于特定的甲基化)，也包括2)其经过处理的序列(例如亚硫酸氢盐转化后的对应区域)。亚硫酸氢盐转化后的对应区域与基因组序列中的目标标志物不同之处在于，一个或多个未甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基或在杂交行为上与胞嘧啶不同的其他碱基。
发明人发现，肠癌的性质与以下基因(例如启动子区域)的甲基化有关：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一个或多个或全部。本发明提供了对样本的上述基因进行甲基化检测，实现肠癌筛查目的。
发明人的研究表明，肠癌的性质至少与TFPI2和ITGA4的甲基化有关；进一步地，肠癌的性质还与SDC2和VIM中的一个或两个的甲基化有关；更进一步地，肠癌的性质至少还与NDRG4和BMP3中的一个或两个的甲基化有关。具体地，肠癌的性质与TFPI2、ITGA4以及以下任一组基因的甲基化有关：(1)SDC2，(2)NDRG4、BMP3、SDC2，(3)NDRG4、SDC2、VIM，(4)NDRG4、SDC2，(5)VIM，(6)NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。
其中，N-Myc下游调节基因4(NDRG4)基因位于16号染色体，属于α/β水解酶超家族的N-Myc下调基因家族，增强生长因子诱导的ERK1和ERK2磷酸化，在细胞生长和分化中发挥作用，是一种肿瘤抑制因子，在肠癌中表达下调。NDRG4的甲基化对粪便中的大肠癌有76％的敏感性，特异性为93％-100％，79％-86％的结直肠癌组织中检测到甲基化，而非癌结肠粘膜中检测到4％的甲基化。
骨形态发生蛋白3(BMP3)基因位于4号染色体，是细胞因子转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员，与细胞表面受体结合，激活细胞信号通路，调节SMAD4靶基因的转录以实现生长抑制。在肠癌的早期，BMP3抑癌基因常见下调，BMP3甲基化在肠癌组织中的敏感性和特异性分别是57％和93％，在肠癌粪便标本中，DNA的甲基化率为40％-100％。
Syndecan-2(SDC2)基因位于8号染色体，编码的Syndecan-2蛋白参与细胞增殖、细胞迁移和细胞-基质相互作用，在多种肿瘤中检测到其表达的改变。SDC2的CpG位点在肠癌肿瘤组织常发生异常甲基化，粪便DNA中SDC2甲基化检测肠癌敏感性为90.2％，与肿瘤分期、部位、性别或年龄无关，特异性为90.2％。其中，检测早期肠癌(0-II)的敏感性为89.1％。
组织因子途径抑制物2(TFPI2)基因位于7号染色体，已被鉴定为多种癌症的抑癌基因，编码一种丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白。TFPI2基因异常甲基化在I期至IV期肠癌组织检测率99％，在I期至III期肠癌的粪便DNA中检测到甲基化TFPI2的敏感性为76％-89％，特异性为79％-93％。
Vimentin(VIM)基因位于10号染色体，编码细胞骨架的一种蛋白质。VIM被认为是间充质来源细胞和癌细胞在侵袭和转移过程中经历上皮-间充质转化的生物标记物，VIM的启动子甲基化见于肠癌。83％的大肠癌患者在组织样本中检出有甲基化VIM，55％的患者在粪便中检出有甲基化VIM。
ITGA4基因位于2号染色体，编码一种膜蛋白整合素α4，被认为是炎症相关结肠癌的风险标志物。ITGA4基因甲基化对粪便中的大肠癌具有80％的敏感性和100％的特异性，并且在89％的大肠癌组织样本和88％的腺瘤组织样本中检测到甲基化ITGA4。
本文中，术语“基因”包括所涉基因在其基因组上的编码序列和非编码序列。其中非编码序列包括内含子、启动子和调节元件或序列等。
在一个或多个实施方案中，肠癌与上述基因片段的甲基化有关。所述片段的长度为1bp-1kb，优选1bp-700bp；所述片段包含相应基因染色体区域中的一个或多个甲基化位点。所述片段例如是上述基因的启动子区域。通常，转录起始位点(Transcription StartSites，TSS)上游1k bp、下游200bp的DNA序列界定为启动子区。如果一个基因有多个转录本(即有多个启动子区)，则可选择其中任意启动子区。在一些实施方案中，检测的片段含有至少3个CpG二核苷酸。在示例性方法中，使用基于重亚硫酸盐转化的PCR检测上述基因或其片段的甲基化水平。
因此，本发明涉及检测DNA甲基化的试剂。本领域周知检测DNA甲基化方法中所用的试剂。在涉及DNA扩增(例如PCR)的检测方法中，检测DNA甲基化的试剂包括引物。本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物通常至少9bp。引物序列可为甲基化特异的或非特异的。。通常，引物被设计为扩增的产物长度为1-2000bp、10-1000bp、30-900bp、40-800bp、50-700bp、或至少150bp、至少140bp、至少130bp、至少120bp。在示例性实施方案中，所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
检测DNA甲基化的试剂还可包括与待测序列杂交的检测探针。通常，检测探针的序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。本文所述“杂交”主要指在严谨条件下的核酸序列配对。示例性严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。在示例性实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针(例如TaqMan探针)，所述探针具有SEQ ID NO:22-27中任一项或多项或全部所示的序列。
如本文所述，DNA或RNA的碱基之间可发生转化。本文所述“转化”、“胞嘧啶转化”或“CT转化”是利用非酶促方法处理DNA，将未修饰的胞嘧啶碱基(cytosine,C)转化为与鸟嘌呤结合能力低于胞嘧啶的碱基(例如尿嘧啶碱基(uracil,U))的过程。本领域周知进行胞嘧啶转化的非酶促方法。非酶促方法主要是指重亚硫酸盐转化。示例性地，非酶促方法包括使用转化试剂例如亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐处理，例如亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵等。经转化的DNA任选经纯化。适用于本文的DNA纯化方法本领域周知。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的引物和/或探针，用于检测粪便标本脱落细胞DNA中肠癌相关基因或序列的甲基化水平，进而鉴定肠癌或筛查肠癌高危人群。所述试剂盒还可包含本文所述，特别是发明内容第一方面所述的核酸分子作为内标或阳性对照。
此外，使用捕获试剂从从样品中提取靶基因DNA可以提高检测效率。因此，所述试剂盒还包含捕获试剂。通常，所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂，例如，SEQ IDNO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针。
因此，在优选实施方案中，所述试剂盒包括本文所述的SEQ ID NO:1-6所示的捕获探针、SEQ ID NO:8-19所示的引物和SEQ ID NO:22-27所示的检测探针。此外，所示试剂盒还包括本文所述的SEQ ID NO:7所示的ACTB捕获探针、SEQ ID NO:20和21所示的ACTB引物和SEQ ID NO:28所示的ACTB检测探针。
除了所述引物、探针、核酸分子之外，试剂盒还包含检测DNA甲基化所需的其他试剂。示例性地，检测DNA甲基化的其他试剂可包含以下的一种或多种：重亚硫酸盐及其衍生物、PCR缓冲液、聚合酶、dNTP、引物、探针、Mg2+、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、内标、对照物。所述试剂盒还可包括经转化的阳性标准品，其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述阳性标准品可以是完全甲基化的。
为了从粪便样品中获取DNA，所述试剂盒还可包括粪便处理试剂，所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及抗生素(例如氨苄青霉素和链霉素)。
基于发明人的发现，本发明提供一种用于肠癌或肠癌前病变的筛查方法，包括：(1)检测对象样品中的本文所述肠癌相关序列的甲基化水平，(2)将所述甲基化水平与健康对象的所述肠癌相关序列的甲基化水平比较，从而筛查肠癌或肠癌前病变。通常，所述方法之前还包括：样品DNA的抽提、质检、和/或将DNA上未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所述样品包括来自哺乳动物的细胞，特别是粪便样品。
在具体实施方案中，步骤(1)包括：用DNA捕获探针提取检测的靶基因DNA，用转化试剂处理基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶；使用引物进行PCR扩增，所述引物适用于扩增本文所述肠癌相关序列的经转化的序列；通过扩增产物的有或无、或者序列鉴定(例如基于探针的PCR检测鉴定或DNA测序鉴定)确定至少一个CpG的甲基化水平。
为了从粪便样品中获取DNA，所述方法还可包括用粪便处理试剂处理粪便样品的步骤。所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及氨苄青霉素和链霉素。经裂解的粪便样品优选与PVPP孵育以去除会影响后续PCR反应的抑制剂。
为了提高检测效率，所述肠癌或肠癌前病变的筛查方法还可包括用基因捕获试剂从样品中提取靶基因DNA的步骤。通常，所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂。示例性地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针。通过用捕获试剂孵育经处理的粪便样品，可以富集待检测的基因或其片段。所述孵育优选在异硫氰酸胍的存在下进行。
在一个实施方案中，所述肠癌或肠癌前病变的筛查方法包括步骤：
(a)以1g粪便:5mL粪便裂解液的比例使用粪便裂解液裂解粪便，获得含有DNA的上清液；所述粪便裂解液含有EDTA、Tris、NaCl和抗生素(例如0.1M EDTA，0.5M Tris，10mMNaCl(pH7)以及氨苄青霉素和链霉素)，
(b)使用PVPP以1g PVPP:20mL上清液的比例孵育所述上清液，除去PVPP，
(c)使用SEQ ID NO:1-6的捕获探针捕获靶基因DNA，
(d)使用亚硫酸盐转化靶基因DNA，
(e)使用SEQ ID NO:8-19所示的引物和SEQ ID NO:22-27所示的探针通过荧光定量PCR检测靶基因DNA，若检测到扩增信号则诊断对象患有肠癌或肠癌前病变。
本文所述“甲基化水平”指所涉CpG位点的甲基化水平或所涉序列中多个或所有CpG位点的平均甲基化水平。本发明的示例性实施方案中，位点的甲基化水平通常是指该位点甲基化C的百分比，如果该CpG位点所有C都是未甲基化的，其甲基化水平就为零。甲基化水平还可以是其他类型的计算结果，这在本领域技术人员的知识范围内。本领域知晓将检测DNA甲基化的方法(例如简化甲基化测序)所得结果转化为甲基化水平的过程。例如，根据每个基因启动子区检测到的CpG位点的甲基化水平，计算平均甲基化，将其作为该基因启动子区DNA甲基化水平。
实施例
实施例1：DNA提取
粪便标本采集：收集10例确诊肠癌病人粪便约8g置于40mL粪便样品裂解液保存，另收集10例正常人粪便做对照；
所述粪便裂解液有0.1M EDTA，0.5M Tris，10mM NaCl(pH7)以及氨苄青霉素和链霉素配制而成。
粪便标本匀浆制备：收到标本后，将容器在振荡器上充分混匀标本，将45mL匀浆样品转移至50mL离心管中，置于-20℃冷冻过夜，将冷冻好的样品室温解冻，振荡器上充分混匀，4500g离心30-45min；
取12mL上清液，加入0.6g抑制剂去除剂PVPP充分混匀，室温400rpm搅拌15min，混匀后4500×g离心10-20min，去除PVPP；
取10mL上清液，加入2.83g/10mL异硫氰酸胍，加入5pmol BMP3、NDRG4、SDC2、TFPI2、VIM、ITGA4及ACTB捕获Oligo DNA；
所述目的基因Biotin-寡核苷酸捕获探针特异片段序列：
SEQ ID NO.1(NDRG4)：Biotin–GGACACCCCGGTCGATCCGCGCCCCCGCCGACTTC
SEQ ID NO.2(BMP3)：Biotin–TCTGTACCTTCCCTCCTCGCTTTATTTTTGGG
SEQ ID NO.3(SDC2)：Biotin–CCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCGCAGCG
SEQ ID NO.4(TFPI2)：Biotin–CGACCCCCTGCACCATGGACCCCGCTCGCCCCCTG
SEQ ID NO.5(VIM)：Biotin–CGCGGTGCCCGGGCCGCCGAACATCCTGCGGTAGG
SEQ ID NO.6(ITGA4)：Biotin–GTGGCTGTGCAGCACGACCGAGTAGCCGAACAGCG
SEQ ID NO.7(ACTB)：Biotin–CCCTTGAAGGTTGCAGAGGCCACAGCCTGGTGGG
90℃变性10min，室温杂交60min，摇床轻度摇晃；
加100μL Avidin-磁珠，室温60min，用磁力架吸附珠子，去上清液，750μL 80％乙醇洗磁珠3次；
DNA洗脱：40μL TE，70-80℃，10min震荡混匀，收集上清；
测OD值定量：DNA浓度为100-200g/μL，OD260/280值1.6-2.0。
实施例2：亚硫酸盐转化处理粪便提取的DNA
在0.5mL PCR管中配制亚硫酸盐转化反应体系，具体配制体系如下：
| DNA样品 | 20μL |
| DNA保护液 | 10μL |
| 10M亚硫酸盐转化溶液 | 130μL |
反应体系配置好后，在PCR仪设置温度变化程序进行亚硫酸盐转化：
[95℃5min，60℃20min]×2，循环，保持4℃；
DNA亚硫酸盐处理后纯化：
经简短离心，将管中反应体系转移至干净的1.5mL离心管中；
加入1mL 6M盐酸胍和40μL磁珠，涡旋混匀10s，室温静置5min；
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；
加入600μL漂洗液(80％ETOH/50mM Tris Buffer)，涡旋混匀10s；
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；
加入600μL脱硫液(0.3N NaOH/90％EtOH)，涡旋混匀10s，室温放置15min；
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；
加入600μL漂洗液(80％ETOH/50mM Tris Buffer，涡旋混匀10s；
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；
重复漂洗液漂洗一次；
短暂离心将残余液体收集至管底，尽量去尽液体；
室温晾干3-5min至无液体残余；
加入20-40μL预热1×TE缓冲液(50℃)并混匀磁珠，室温放置3min；
将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后收集洗脱产物(即为转化DNA)。
实施例3：荧光定量PCR检测6个基因甲基化
PCR检测甲基化基因引物如下：
SEQ ID NO.8:NDRG4_MF：ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTC
SEQ ID NO.9:NDRG4_MR：GCCTTCTACGCGACTAAAATACCCGAT
SEQ ID NO.10:BMP3 MF：AATATTCGGGTTATATACGTCGC
SEQ ID NO.11:BMP3 MR：CCTCACCCGCGCAAAACG
SEQ ID NO.12:SDC2_MF：TTAATAAGTGAGAGGGCGTCGC
SEQ ID NO.13:SDC2_MR：CGACTCAAACTCGAAAACTC
SEQ ID NO.14:TFPI2_MF：GTTCGTTGGGTAAGGCGTTC
SEQ ID NO.15:TFPI2_MR：CATAAAACGAACACCCGAACCG
SEQ ID NO.16:VIM_MF：GGCGGTTCGGGTATCG
SEQ ID NO.17:VIM_MR：CGTAATCACGTAACTCCGACT
SEQ ID NO.18:ITGA4_MF:CGAATTCGGTTTTCGAAGGGTCGTCGTTCG
SEQ ID NO.19:ITGA4_MR:AAAACAACGCGCTCTCAATATCCACGTTAT
SEQ ID NO.20:ACTB_MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT
SEQ ID NO.21:ACTB_MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
所述荧光标记TaqMan探针如下：
SEQ ID NO.22(NDRG4):FAM–TCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCG-BHQ1
SEQ ID NO.23(BMP3):HEX–TAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCG-BHQ1
SEQ ID NO.24(SDC2):ROX–CGTAGTTGCGGGCGGCGGGAGTAGGC-BHQ2
SEQ ID NO.25(TFPI2):FAM–ATTTTTTAGGTTTCGTTTCGGC-BHQ1
SEQ ID NO.26(VIM):HEX–GACGCGGAGGCGAGTCGGTCG-BHQ1
SEQ ID NO.27(ITGA4):ROX–TGTTGTTGTGTTTGGGGGTTTCGA-BHQ2
SEQ ID NO.28(ACTB):CY5–TGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGTGGT-BHQ3
经亚硫酸盐转化的DNA用于荧光定量PCR：
6个靶点基因检测分2组PCR反应，各取0.25μL 10μM引物，0.125μL 10μM荧光探针；
引物+荧光探针混合液-1：(NDRG4,BMP3,SDC2,ACTB)；
引物+荧光探针混合液-2：(TFPI2,VIM,ITGA4,ACTB)；
PCR反应体系(25μL)：
| 亚硫酸盐转化DNA | 5μL |
| 4×HU MP Buffer | 6μL |
| 引物+荧光探针混合液-1/或混合液-2 | 2.5μL |
| <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | 9.5μL |
| Enzyme Mix | 2μL |
同时取未转化DNA设置为对照；
设置基因甲基化PCR反应条件：
95℃5min；45cycles(95℃15s，61℃30s)；72℃30s；
PCR反应结束，检测荧光信号：
针对甲基化ACTB及6个靶基因甲基化的PCR在未转化肠癌病人及正常人粪便标本DNA中均未检测到扩增信号(Ct值≥38或无数值)；
甲基化ACTB在转化肠癌病人及正常人粪便标本DNA均检测到扩增信号Ct值在25～32之间。ACTB的Ct值≤35提示待检DNA样品有效，Ct值>35提示待检样品无效，需重新制备DNA。
6个靶基因甲基化在正常人转化的DNA中未见有扩增信号(Ct值≥38或无数值)；检测基因Ct值≤36为扩增,Ct值≥38为无扩增，36<Ct值<38为临界值。
结果判断：样品中有2个及2个以上基因甲基化扩增提示该病例为阳性,1个为可疑供临床参考。表1为10例确诊肠癌病人粪便以及10例正常人粪便标本检测结果。
表1.
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.诊断肠癌或肠癌前病变、筛查肠癌形成或形成的风险或评估肠癌进展或预后的试剂，所述试剂包含检测对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列中的一种或多种或全部：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述DNA序列至少包含TFPI2和ITGA4；
优选地，所述DNA序列还包含SDC2和VIM中的一个或两个；
更优选地，所述DNA序列还包含：NDRG4和BMP3中的一个或两个；
进一步优选地，所述DNA序列包含TFPI2、ITGA4和以下任一组：(1)SDC2，(2)NDRG4、BMP3、SDC2，(3)NDRG4、SDC2、VIM，(4)NDRG4、SDC2，(5)VIM，(6)NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。
3.如权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，
所述片段是基因序列的启动子区域，和/或
所述片段包含至少1个CpG二核苷酸，和/或
所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的引物分子，和/或
所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的检测探针，
优选地，
所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19，
所述检测探针具有SEQ ID NO:22-27中任一项或多项或全部所示的序列，
所述对象是哺乳动物；优选地，所述样品来自哺乳动物的粪便。
4.物质在制备用于诊断对象肠癌或肠癌前病变或筛查肠癌高危人群的试剂盒中的用途，所述物质包含：
(a)用于确定对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂或装置，和
任选的(b)所述DNA序列或其片段经处理的核酸分子，所述处理使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，
任选的(c)用于捕获所述DNA序列或其片段的捕获试剂，
任选的(d)处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，例如将能够未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，
其中，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，
所述片段是基因序列的启动子区域，和/或
所述片段包含至少1个CpG二核苷酸，和/或
所述(a)包含权利要求3所述的试剂，和/或
(c)所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂；优选地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针，和/或
(d)所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂；优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。
6.如权利要求4或5所述的用途，其特征在于，
所述对象是哺乳动物，和/或
所述样品是粪便样品，和/或
所述试剂盒还包括PCR反应试剂，和/或
所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法中的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR、DNA测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱，和/或
所述试剂盒还包括粪便处理试剂，所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及抗生素。
7.诊断肠癌或肠癌前的病变、筛查肠癌形成或形成的风险或评估肠癌的进展或预后的试剂盒，包含：
(a)用于确定对象的样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸的甲基化水平的试剂或装置，和
任选的(b)用作阳性对照的所述DNA序列或其片段的经处理的核酸分子，所述处理使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，
任选的(c)用于捕获所述DNA序列或其片段的捕获试剂，
其中，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一个或多个。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，
所述(a)包含权利要求3所述的试剂，和/或
(c)中所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂；优选地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1-6中任一项或多项所示的捕获探针，和/或
所述试剂盒还包含处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，优选地，所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂，更优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒还包含用于捕获ACTB的捕获探针、扩增ATCB的引物、和与ATCB杂交的检测探针，
优选地，所述试剂盒包含第一容器和第二容器，其中第一容器含有针对基因NDRG4、BMP3、SDC2和任选的ACTB的引物和检测探针，第二容器含有针对基因TFPI2、VIM、ITGA4和任选的ACTB的引物和检测探针。
10.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，
所述对象是哺乳动物，和/或
所述样品是粪便样品，和/或
所述试剂盒还包括PCR反应试剂，和/或
所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR、DNA测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱，和/或
所述试剂盒还包括粪便处理试剂，所述粪便处理试剂包括粪便样品裂解液，所述裂解液含有乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钠(NaCl)以及抗生素。
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-
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