CN116083444A - 转录因子a36在调控cse基因表达上的应用 - Google Patents

转录因子a36在调控cse基因表达上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116083444A
CN116083444A CN202211465060.1A CN202211465060A CN116083444A CN 116083444 A CN116083444 A CN 116083444A CN 202211465060 A CN202211465060 A CN 202211465060A CN 116083444 A CN116083444 A CN 116083444A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cse
promoter
transcription factor
vector
agaricus bisporus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211465060.1A
Other languages
English (en)
Inventor
赵龙刚
刘羽
顾宇熠
李静
江文文
李天昊
程凡升
朱丹
李文香
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Agricultural University
Original Assignee
Qingdao Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Agricultural University filed Critical Qingdao Agricultural University
Priority to CN202211465060.1A priority Critical patent/CN116083444A/zh
Publication of CN116083444A publication Critical patent/CN116083444A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及转录因子A36在调控CSE基因表达上的应用。本发明提供了转录因子A36作为CSE启动子区的转录因子的应用。明确了转录因子A36对CSE的转录调控作用，既明确了二者之间的直接靶向关系又丰富了CSE的调控网络，为CSE的表达调控运用于双孢菇硫化氢合成遗传改良分子调控机制的研究提供依据。

Description

转录因子A36在调控CSE基因表达上的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及转录因子A36在调控CSE基因表达上的应用。
背景技术
低温贮藏是目前应用最广泛且行之有效的食用菌贮藏方法。低温能够显著降低果蔬采后的呼吸作用，延迟组织衰老，抑制病原微生物的生长和繁殖。但低温同时也会造成冷敏型食用菌品种生理失调，缩短货架期和降低食用品质。探究食用菌的采后生理和调控机制，进而减少鲜菇采收后的品质损失一直是业界研究热点和难点。AbCSE 是采后双孢菇H2S 合成的关键酶。但是目前在食用菌中的低温诱导转录因子调控 H2S 合成的分子机制并不清楚。转录因子可将上游冷信号直接传递给 下游低温响应基因。转录因子通过与特定顺式作用元件的结合调控生物中相应基因的表达，在生物低温应答过程中发挥着核心作用。因此，研究H2S 合成基因的转录因子对揭示食用菌内源 H2S 的合成代谢有重要意义。WangL， etc. Genome-wide characterization and expression analyses of Pleurotusostreatus MYB transcription factors during developmental stages and underheat stress based on de novo sequenced genome. INT J MOL SCI 2018， 19(7)：2052，公开了 6 个 MYB家族转录因子参与了平菇形态发育及对温度胁迫的响应。
MYB是低温诱导双孢菇采后H2S合成的关键转录因子，程序分析发现AbCSE的启动子区域均存在MYB的转录因子结合位点。结构分析发现，他们属于典型的转录因子，但在GenBank中注释为假想蛋白，低温信号可能是通过转录因子MYB在转录水平上调控了H2S的合成。
生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，发挥着类似“开关”的作用。启动子本质是一段位于结构基因5’端上游区域的DNA序列，其本身不具备调控基因的功能，而是与众多的特定转录因子相互作用，特异的调控基因的表达。启动子功能研究使我们更深入的了解生物生长发育的调控机制，对于研究功能基因的表达调控具有重要意义。
因此，找出对CSE的启动子区具有转录调控作用的转录因子，将会为CSE的表达调控运用于双孢菇遗传改良分子调控机制的研究提供依据。
发明内容
针对现阶段对CSE的启动子区具有转录调控作用的转录因子稀缺，存在的问题，本发明提供了转录因子A36作为 CSE启动子区的转录因子的应用。明确了转录因子A36对CSE的转录调控作用，既明确了二者之间的直接靶向关系又丰富了CSE的调控网络，为CSE的表达调控运用于双孢菇硫化氢合成遗传改良分子调控机制的研究提供依据。
本发明的技术方案如下：
转录因子A36在调控CSE基因表达上的应用。
优选地，转录因子A36是通过与双孢菇的CSE的启动子上游的1037bp～1043bp的结合位点结合，来发挥对CSE基因转录的抑制作用。
优选地，所述的CSE启动子的序列如SEQ ID NO .1。
优选地，转录因子A36对CSE的转录抑制作用的鉴定步骤包括：分别获取双孢菇CSE启动子片段载体和A36表达载体后，酵母单杂测定显示实验组生长，后续进行启动子截短，将启动子截短为2个片段，分别连接至pHIS2载体上，酵母单杂验证，发现双孢菇CSE启动子片段与A36互作，结合生物信息学分析，结果显示A36结合位点为-578bp～-572bp的MYB（TAACCA）转录因子位点；
所述的MYB的核苷酸序列为TAACCA。
优选地，双孢菇CSE启动子片段包括：序列如SEQ ID NO .2所示的含有MYBrecognition site顺式作用元件的片段、序列如SEQ ID NO .3所示的含有MYB顺式作用元件的片段。
优选地，转录因子A36对CSE的转录抑制作用的鉴定步骤包括：将CSE启动子和A36分别构建入pGreen0800-luc 载体和pSuper1300载体上，共转染细胞，培养后裂解细胞，对裂解液进行双荧光素酶活性测定，共转染的A36的双孢菇CSE片段载体的荧光素酶活性降低，即表明转录因子A36抑制了CSE基因的转录。
优选地，所述结合位点的确定步骤包括：双孢菇CSE启动子为模板，进行启动子PCR扩增，对预测的结合位点分别进行启动子截短，构建启动子截短载体；进行酵母单杂验证，双荧光素酶活性测定，单杂交阳性组的截短区域对应的所述结合位点即为A36与CSE启动子区的结合位点。
本发明具有以下有益效果：
1. 鉴定了CSE基因的启动子区，为基因工程和分子育种提供了新的启动子资源，具有灵敏度高、速度快和费用低等优点；
2. 确定了A36转录因子在CSE启动子的结合位点；
3. 明确了转录因子A36对CSE的转录负调控作用，为CSE的表达调控带来了更深层次的认知，运用于双孢菇硫化氢合成遗传改良分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为酵母单杂最适抑制浓度筛选；
图2为酵母单杂交实验图；
图3为启动子截短实验电泳图；
图4为启动子截短实验结果；
图5为pSuper1300-A36和pGreen II0800-luc-CSE promoter转染烟草；
图6为A36与CSE三个启动子片段P1 P2 P3的ChIP-qPCR结果。
具体实施方式
实施例1
1.分离克隆与鉴定CSE基因启动子片段
1.1双孢菇基因组DNA提取与检测
(1)取真菌菌丝0.5g，在液氮中迅速研磨成粉；
(2)加入4mL提取液，快速振荡混匀；
(3)加入等体积的4mL的氯仿：异戊醇(24：1)，涡旋3～5min；
(4)1000rpm，4℃，5min；
(5)上清用氯仿：异戊醇(体积比24：1)再抽提一次(10，000rpm，4℃离心5min)；
(6)取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀， 混匀， 静置约30 min；
(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中；
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL)，37℃处理1h；
(9)用酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿：异戊醇(24：1)各抽提1次(10，000rpm，4℃离心5min)；
(10)取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上；
(11)沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中；
(12)取3μLDNA，加4μL上样缓冲液，混匀后点样于1％的琼脂糖凝胶，同时点5μL标准分子量DL 2000 DNA Marker作为参照。15V/cm 条件下电泳，然后在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存；
(13)使用DNA/RNA浓度测定仪，测定DNA浓度和OD值，于-20℃保存备用。
1.2 CSE基因启动子，A36转录因子生物信息学分析
根据NCBI数据库GenBank双孢菇CSE基因的序列信息(Gene ID： 18830412)，找到翻译起始位点ATG的位置，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1700bp以此获得CSE 5’UTR序列。利用MatInspector、plantCARE等在线预测软件分析5’UTR序列上顺式作用元件的情况，依据预测信息综合考虑确定引物设计的范围。利用Primer5软件设计了引物，上游引入KpnI下游引入Xho I酶切位点及保护碱基。引物序列如下：
A36转录因子则将CDS区域全长克隆，上游引入Kpn I下游引入EcoR I酶切位点及保护碱基，引物序列如下：
1.3 PCR扩增CSE启动子，A36基因全长
利用上述设计的引物，以双孢菇基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增
CSE启动子片段(产物长度分别为1612bp)，序列如SEQ ID NO .1所示。
PCR反应体系(25μL)：
反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环32次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
取25μL PCR扩增产物，加3μL Loading Buffer，混匀后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，以DNA标准分子量DL 2000 Marker作为参照，15V/cm电泳。
将琼脂糖凝胶上的目的条带采用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。
2.酵母单杂载体构建
2.1双酶切
将回收纯化的CSE启动子片段及pHIS2质粒， 分别用限制性内切酶KpnI和 Xho I进行双酶切；A36基因片段及pGADT7质粒，分别用限制性内切酶KpnI和 EcoR I进行双酶切，所用的内切酶均购自NEB公司。
双酶切反应体系如下所示：
双酶切反应体系在37℃消化2h。
之后将消化后的反应体系全部经琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段采用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒切胶回收。
2.2连接
将酶切纯化后的CSE启动子片段与pHIS2质粒连接，A36基因片段与pGADT7质粒连接，连接体系分别如下：
CSE体系：
A36体系：
将CSE体系与A36体系用T4连接酶(NEB)于16℃过夜连接。
2.3 转化、测序及质粒提取
①无菌条件下取上述10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞(TransGen)中，混匀后静置冰浴5min，42℃热激45sec，立即置于冰上2-3min，然后均匀涂布于抗性平板(pHIS2使用Kan；pGADT7使用Amp)上，平放于37℃恒温培养箱中约1h，之后倒置过夜培养。
②用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μL LB液体培养基 (含100mg/L Amp)的1.5mL离心管中，于37℃恒温摇床培养4h。取lμL 菌液作为PCR扩增的模板，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录。
③经菌液PCR检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送青岛派森诺生物科技有限公司进行测序。
将测序正确的菌液重新扩大培养，120μL菌液加入到含有30mL液体培养基（含抗生素）的50mL离心管中，于37℃恒温摇床培养12h。按照TIANGEN质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取，提取的质粒于-20℃保存备用。
2.4 共转化Y187酵母感受态细胞
酵母感受态细胞的转化按照产品说明书：
1. 取100 µl冰上融化的Y187感受态细胞，依次加入预冷的两种pHIS2，及pGADT7质粒2-5 µg，Carrier DNA (95-100度5 min，快速冰浴，重复一次）10 µl，PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀，30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
2. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
4. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
前期对其进行 3-AT 最适浓度筛选，将目的基因转化至酵母感受态中，在含有不同浓度3-AT的SD/-Trp/-His 双缺固体培养基上将pHIS2-CSE promoter的酵母涂布，培养48-72 h于30℃环境下，结果见图1，可以看出，长出酵母菌落的最大浓度为 60 mM 3-AT的双缺培养基，而不能正常生长酵母菌落的浓度为 90 mM 3-AT 浓度的SD/-Trp/-His双缺培养基，因此 90 mM 是最适抑制酵母菌生长 3-AT 浓度。
以共转化重组质粒pHIS2-CSE promoter+pGADT7-A36的酵母菌株为实验组，阴性对照为共转化重组质粒pHIS2-CSE promoter +pGADT7的酵母菌株，将其点在含3-AT浓度为120 mM的SD/-Leu/-Trp/-His三缺培养基上，30℃环境下培养48-72 h。结果见图2，可以看出，三缺固体培养基在含有90mM 3-AT中，正常生长的只有共转化重组质粒pHIS2-CSEpromoter+pGADT7-A36的酵母菌株，证明A36可以与CSE promoter相互结合，证明A36能够调控CSE基因的表达。
3.启动子截短验证结合位点
CSE基因启动子生物信息学分析
根据NCBI数据库GenBank双孢菇CSE基因的序列信息(Gene ID： 18830412)，找到翻译起始位点ATG的位置，利用NCBI数据库检索工具往前延伸2000bp以此获得CSE 5’UTR序列。利用plantCARE等在线预测软件分析5’UTR序列上顺式作用元件的情况，依据预测信息综合考虑确定引物设计的范围，将利用Primer5软件设计了引物，CSE1为MYB recognition顺式作用元件（序列如SEQ ID NO .2所示），CSE2为MYB顺式作用元件（序列如SEQ ID NO .3所示）。上游引入Kpn I下游引入Xho I酶切位点及保护碱基。引物序列如下。
 PCR反应体系(25μL)：
反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环33次。循环结束后，将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
取25μL PCR扩增产物，加3μL Loading Buffer，混匀后点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，以DNA标准分子量DL 2000 Marker作为参照进行电泳。
将琼脂糖凝胶上的目的条带采用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。结果如图3 所示。
经过上述PCR克隆，胶回收纯化，酶切，纯化连接至pHIS2载体。
将其点在含3-AT浓度为120 mM的SD/-Leu/-Trp/-His三缺培养基上，30℃环境下培养48-72 h。结果见图4，可以看出，三缺固体培养基在含有90mM 3-AT中，共转化重组质粒pHIS2-CSE MYB promoter+pGADT7-A36的酵母菌株为阳性菌落，共转化重组质粒pHIS2-CSEMYB recognition site promoter +pGADT7-A36的酵母菌株为阴性，正常生长的只有共转化重组质粒pHIS2-CSE MYB promoter+pGADT7-A36的酵母菌株，证明A36可以与CSE启动子的MYB顺式作用元件结合，找到了A36调控CSE基因的表达的结合位点。
4.双荧光素酶实验
4.1 载体构建
CSE引物pGreen0800-luc ，上游引入Kpn I下游引入Xho I酶切位点及保护碱基。
经过PCR克隆，胶回收纯化，酶切，纯化连接至pGREEN0800-luc载体。
A36无缝克隆引物pSuper1300，采用无缝克隆方法构建，设计同源臂，载体使用XbaI酶切。
A36基因片段经过PCR克隆，胶回收纯化，酶切，纯化连接至pGreen0800-luc载体。
在pSuper1300载体质粒上选取XbaI位点酶切，对酶切后的载体胶回收纯化，
按照50ng载体，30ng目的基因的比例把二者混合在 HB-infusion™（无缝克隆试剂盒）的2×预混液内，50℃反应 20min 后直接转化DH5α。
4.1 双荧光素酶检测
农杆菌转化
1. 取上述两种重组质粒各1µl加入50µl刚冻解的GV3101农杆菌感受态中，空载体做对照。
2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal至1.6-1.7）。
3. 电击完立即加入1mlLB培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4. 28℃，摇2h。
5. 涂板，（使用kan+rif双抗性平板）28℃培养36h。
6. 做菌落PCR检测是否转化成功，同时做菌种保藏。
农杆菌侵染
1）挑取转化成功的农杆菌单菌落。
2）接种到2 mL LB液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃ 220 rpm培养过夜。
3）农杆菌培养至OD600为1.0，1700× g离心5 min收集菌体后，用1/2MS液体培养基清洗菌体2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将农杆菌的OD600调至1.0。
4）将待检测的含有pSuper1300-A36和pGreen II0800-luc-CSE promoter农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的OD600为0.5，为实验组。转化有空载体的农杆菌做对照。
5）选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上， 以保证相同的生长背景。
6）正常温室生长条件下，24-48 h即可取样观察。
7）取3-4片直径为6-8 mm的叶盘，放入2 mL的EP管（提前放入3-4个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在EP管中加入100 μL裂解液。
8）冰上孵育5 min左右，充分裂解叶片。
9）10000-16000 rpm离心1 min，取上清。
10）荧光检测：
①取20 μL裂解液，加至培养板中。按照实验需要，可设置3孔-5孔重复。
②配制萤火虫萤光素酶反应工作液和海肾萤光素酶反应液，即萤火虫萤光素酶底物（50 ×）和海肾萤光素酶底物（50×）。分别用对应的缓冲液稀释至1×工作液。并孵育至室温。
③加入100 μL萤火虫萤光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
④加入100 μL海肾萤光素酶反应液，震板混匀，检测海肾萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。
使用 Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（RG027，Beyotime）试剂盒的方法加入发光底物，用 SpectraMax i3X（Molecular Devices）仪器检测，结果见图5。
24h后相对荧光素酶活性检测结果
通过双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC），pSuper1300-A36和GreenⅡ0800-luc-CSE promoter共转烟草三天后进行实验，可知pSuper1300-A36+GreenⅡ0800-luc-CSEpromoter共转的比值高于对照，表明A36能够激活CSE promoter。发现双孢菇中，A36可以调控CSE的表达从而促进硫化氢的产生。
5. ChIP-qPCR验证
1. 交联
幼嫩双孢菇样品2g；甲醛：新鲜配制；交联后的样本可经液氮速冻，-80℃保存2个月；
a. 胰酶消化，10ml 1×PBS洗涤两次；每次1000rpm，离心5min；
b.加入10ml 1×PBS(含270ul 37%甲醛，终浓度1%)重悬；颠倒混匀，室温静置10min；
c. 加入 1 mL 1.375 M Glycine(或 0.1 g Glycine)，颠倒混匀器室温中和 5min;结束后置于冰上；
d. 4 ℃，1000g，离心5分钟收集沉淀，弃上层 PBS溶液；
e. 加10 mL预冷的 1×PBS，洗涤两次，每次4℃，1000rpm离心 5分钟收集沉淀。
2. 样品裂解及打断
f. 加入 0.6mL ChIP 裂解液（6 µL Protease Inhibitor，6 µL DTT及6 µLPMSF），重悬；于4℃垂直旋转10min，充分裂解；
g. 进行超声打断；不同样品所需的超声处理时间不同，因此这一步骤需要优化，确定DNA 片段破碎条件：90%功率，超声 5 sec，停10sec，循环 15 次；
h. 取25ul样本补水至60ul，加入2.4 µL 5 M NaCl ，65°C孵育过夜；加入1 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 下孵育 1 小时。提取DNA，并电泳确保条带是在200~600bp之间；
h. 超声后溶液8000 g，4℃离心 10分钟，将上清转移到新的离心管中。
3. 染色质免疫沉淀
a. 将上清样品按1：10 的比例用 RIPA 缓冲液稀释每个样本；并按照500ul（IP）、500ul（IGG）、50ul（Input）分成三份；
b. Input组于-20℃保存；
c. IP及IGG组分别加入 anti-GFP抗体及IGG抗体，4℃垂直混匀器缓慢孵育 1 h；
d. IP及IGG组分别加入准备好的 50 µL protein A/G-beads，垂直混匀器上颠倒混匀，4℃孵育过夜。
4. 洗涤
a. 4℃静置 10min 后，4000rpm 离心 1min。除去上清；
b. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物；
清洗的步骤：加入溶液，轻轻颠倒， 4000rpm 离心 3min，去除上清；
1） 分别在低盐洗涤缓冲液、
2） 高盐洗涤缓冲液
3） 氯化锂洗涤缓冲液中洗涤一次。
5. 洗脱、解交联及DNA提取
a. 在蛋白 A/G 磁珠中加入 120 μL 洗脱缓冲液，室温翻转15min。
b. 4000rpm 离心 1 min，并将上清液转移至新管中。
c. 加入 4.8 µL 5 M NaCl ，65°C 孵育过夜。
d. 加入 2 µL 蛋白酶 K (20 mg/mL)，60°C 孵育 1 小时。
e. DNA提取，提取好的DNA即可用于qPCR或测序实验。
qPCR引物
以EF1-α为内参基因
qPCR体系
其程序为：94℃ 30 s，94℃ 5s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，42 个循环，每个处理组进行3个重复。
为了检测体内CSE基因是否受A36调控，通过 qRT-PCR 手段检测 RALF1；通过对双孢菇过程中进行ChIP-seq测序分析，揭示了A36协同调控CSE转录新机制（见图6）。在机制上，A36被特异性地招募至启动子下游基因位点，并结合CSE基因。

Claims (7)

1.转录因子A36在调控CSE基因表达上的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，转录因子A36是通过与双孢菇的CSE的启动子上游的1037bp～1043bp的结合位点结合，来发挥对CSE基因转录的抑制作用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的CSE启动子的序列如SEQ ID NO .1。
4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，转录因子A36对CSE的转录抑制作用的鉴定步骤包括：分别获取双孢菇CSE启动子片段载体和A36表达载体后，酵母单杂测定显示实验组生长，后续进行启动子截短，将启动子截短为2个片段，分别连接至pHIS2载体上，酵母单杂验证，发现双孢菇CSE启动子片段与A36互作，结合生物信息学分析，结果显示A36结合位点为-578bp～-572bp的MYB（TAACCA）转录因子位点；
所述的MYB的核苷酸序列为TAACCA。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，双孢菇CSE启动子片段包括：序列如SEQ IDNO .2所示的含有MYB recognition site顺式作用元件的片段、序列如SEQ ID NO .3所示的含有MYB顺式作用元件的片段。
6. 如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，转录因子A36对CSE的转录抑制作用的鉴定步骤包括：将CSE启动子和A36分别构建入pGreen0800-luc 载体和pSuper1300载体上，共转染细胞，培养后裂解细胞，对裂解液进行双荧光素酶活性测定，共转染的A36的双孢菇CSE片段载体的荧光素酶活性降低，即表明转录因子A36抑制了CSE基因的转录。
7.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述结合位点的确定步骤包括：双孢菇CSE启动子为模板，进行启动子PCR扩增，对预测的结合位点分别进行启动子截短，构建启动子截短载体；进行酵母单杂验证，双荧光素酶活性测定，单杂交阳性组的截短区域对应的所述结合位点即为A36与CSE启动子区的结合位点。
CN202211465060.1A 2022-11-22 2022-11-22 转录因子a36在调控cse基因表达上的应用 Pending CN116083444A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211465060.1A CN116083444A (zh) 2022-11-22 2022-11-22 转录因子a36在调控cse基因表达上的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211465060.1A CN116083444A (zh) 2022-11-22 2022-11-22 转录因子a36在调控cse基因表达上的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116083444A true CN116083444A (zh) 2023-05-09

Family

ID=86212689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211465060.1A Pending CN116083444A (zh) 2022-11-22 2022-11-22 转录因子a36在调控cse基因表达上的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116083444A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022884A2 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Transgenetics Incorporated Microarrayed organization of transcription factor target genes
CN110204605A (zh) * 2019-05-16 2019-09-06 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用
CN113593634A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 中国海洋大学 一种融合dna形状特征的转录因子结合位点预测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022884A2 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Transgenetics Incorporated Microarrayed organization of transcription factor target genes
CN110204605A (zh) * 2019-05-16 2019-09-06 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 转录因子C/EBPα作为ACOX1启动子区的转录因子的应用
CN113593634A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 中国海洋大学 一种融合dna形状特征的转录因子结合位点预测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6177611B1 (en) Maize promoters
AU2019276382B2 (en) Use of Yr4DS gene of Aegilops tauschii in stripe rust resistance breeding of Triticeae plants
CN103451228B (zh) 一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法
CN114106130B (zh) 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbJOX4及其应用
CN114133438B (zh) 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用
CN111690046B (zh) 梨转录因子PbHB.G7.2及其在促进果实成熟中的应用
CN109022454A (zh) 一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用
CN1411510A (zh) 植物的光周期敏感性基因及其用途
CN112899285A (zh) 水稻耐镉基因OsFWL6的应用
NIU et al. Up-regulation of a homeodomain-leucine zipper gene HD-1 contributes to trichome initiation and development in cotton
CN116083444A (zh) 转录因子a36在调控cse基因表达上的应用
CN113929759B (zh) 上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的应用
CN114085276B (zh) 上游调控因子IbERF10及其在调控紫心甘薯IbbHLH2表达中的应用
CN106434659B (zh) 大豆低温诱导型启动子、包含该启动子的重组表达载体及应用
CN109517048A (zh) 一种蓝光下调控染色质长距离相互作用的光遗传学工具
CN113121660B (zh) 玉米myb39蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用
CN116063429B (zh) 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbUR5GT及其应用
CN117511966B (zh) 巴西蕉乙烯信号转导的MaEIL4基因及其应用
CN113151273B (zh) 非生物逆境诱导型启动子及其应用
US11913002B2 (en) Modified plant endosperm specific promoter and use thereof
CN116041459B (zh) 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPPA及其应用
CN116102630B (zh) 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPDC及其应用
CN114231543B (zh) 水稻OsARP6基因在植物耐旱中的应用
CN116063430B (zh) 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbPGP19及其应用
CN116083437B (zh) 大豆GmNAC56基因及其在大豆疫霉根腐病胁迫中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Liu Yu

Inventor after: Gu Yuyi

Inventor after: Li Jing

Inventor after: Zhao Longgang

Inventor after: Jiang Wenwen

Inventor after: Li Tianhao

Inventor after: Zhu Dan

Inventor after: Cheng Fansheng

Inventor after: Li Wenxiang

Inventor before: Zhao Longgang

Inventor before: Liu Yu

Inventor before: Gu Yuyi

Inventor before: Li Jing

Inventor before: Jiang Wenwen

Inventor before: Li Tianhao

Inventor before: Cheng Fansheng

Inventor before: Zhu Dan

Inventor before: Li Wenxiang

CB03 Change of inventor or designer information