CN116077625A - 小鼠截短IL-36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于IL‑36γ蛋白制备技术领域，具体涉及小鼠截短IL‑36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用及其制备方法。本发明提供了小鼠截短IL‑36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用；所述小鼠截短IL‑36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。本发明实施例结果表明，氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示的小鼠截短IL‑36γ蛋白处理组小鼠的体重出现下降缓慢的现象，解剖小鼠取出完整的大肠，平均长度为6.4cm。与对照组相比，小鼠截短IL‑36γ蛋白处理组小鼠肠炎症状减轻。本发明小鼠截短IL‑36γ蛋白能够在免疫调节方面，特别是炎症性肠病中发挥作用。
Description
本申请是申请日为2020年11月16日、申请号为202011278371.8、发明名称为《一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法》的分案申请。
技术领域
本发明属于IL-36γ蛋白制备技术领域，具体涉及小鼠截短IL-36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用及其制备方法。
背景技术
IL-36γ作为IL-36家族成员，可由角质形成细胞和上皮细胞产生，IL-36γ在组织中少量存在时，就能发挥募集和激活免疫细胞的能力，特别是在炎症性肠病中发挥作用。
考虑到IL-36γ在临床上的潜在应用价值，获得具有免疫调节作用的截短型IL-36γ蛋白，将会免疫调节方面，尤其是炎症性肠病的防治方面具有重要意义。但是如何保证截短后的IL-36γ蛋白仍保持原有蛋白的功能，制备“高效”的截短IL-36γ蛋白，发挥其应有的生物学活性，防治炎症性肠病，为将来治疗炎症性肠病在临床上的应用提供，是本领域需要重点解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法，该小鼠截短IL-36γ蛋白的制备方法简单，产量高，采用亲和层析，能够一步得到纯度较高的蛋白，本发明制备的小鼠截短IL-36γ蛋白能够在免疫调节方面，特别是自身免疫疾病中发挥作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种小鼠截短IL-36γ蛋白，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，具体为：5’-ATGGGGCGTGAAACCCCGGATTTCGGTGAAGTTTTCGATCTGGAT CAGCAGGTTTGGATCTTCCGTAACCAGGCGCTGGTTACCGTTCCGCGTTCTCACCGTGTTACCCCGGTTTCTGTTACCATCCTGCCGTGCAAATACCCGGAATCTCTGGAACAGGATAAAGGTATCGCTATCTACCTGGGTATCCAGAACCCGGATAAATGCCTGTTCTGTAAAGAAGTTAACGGTCACCCGACCCTGCTGCTGAAAGAAGAAAAAATCCTGGATCTGTACCACCACCCGGAACCGATGAAACCGTTCCTGTTCTACCACACCCGTACCGGTGGTACCAGCACCTTCGAATCTGTGGCGTTCCCAGGTCACTACATCGCTTCTTCTAAAACCGGCAACCCGATCTTCCTGACCAGCAAAAAAGGTGAATACTATAACATCAACTTCAACCTGGATATCAAATCTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC-3’；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列，具体为：MetGl yArgGluThrProAspPheGlyGluValPheAspLeuAspGlnGlnValTrpIlePheArgAsnGlnAlaLeuValThrValProArgSerHisArgValThrProValSerValThrIleLeuProCysLysTyrProGluSerLeuGluGlnAspLysGlyIleAlaIleTyrLeuGlyIleGlnAsnProAspLysCysLeuPheCysLysGluValAsnGlyHisProThrLeuLeuLeuLysGluGluLysIleLeuAspLeuTyrHisHisProGluProMetLysProPheLeuPheTyrHisThrArgThrGlyGlyThrSerThrPheGluSerValAlaPheProGlyHisTyrIleAlaSerSerLysThrGlyAsnProIlePheLeuThrSerLysLysGlyGluTyrTyrAsnIleAsnPheAsnLeuAspIleLysSerLeuGluHisHisHisHisHisHis。
本发明还提供了一种制备上述的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h～14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液，进行诱导表达，离心后，得到菌体；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后离心，取上清液；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。
优选地，S2中所述PCR扩增的反应体系为：2×PfuMasterMix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。
优选地，S5中所述LB培养基中的卡那霉素的浓度为50mg/L。
优选地，S5中所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h。
优选地，S5中离心的转速为4000rpm～5000rpm，离心的时间为5min～10min。
优选地，S6中离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心的时间为10min～20min。
优选地，S6中超声裂解的反应条件为：在功率为150W～200W的条件下，超声3s～5s，然后停止3s～5s，循环进行，共计进行45min～50min。
优选地，S7中纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的小鼠截短IL-36γ蛋白的制备方法简单，产量高，采用亲和层析，能够一步得到纯度较高的蛋白，本发明制备的小鼠截短IL-36γ蛋白能够在免疫调节方面，特别是炎症性肠病中发挥作用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的实施例3制备的截短IL-36γ蛋白的电泳图；
图2是本发明的实施例3制备小鼠截短IL-36γ蛋白处理的DSS诱导的肠炎模型的小鼠体重变化图；
图3是本发明的实施例3制备小鼠截短IL-36γ蛋白处理的解剖小鼠大肠图；
图4是本发明的实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组小鼠上皮组织的光学显微镜图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的小鼠截短IL-36γ蛋白，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
实施例2
本实施例还提供了一种制备实施例1的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：对原始的小鼠IL-36γ核苷酸序列进行密码子优化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白基因，将合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；所述原始的小鼠IL-36γ具有序列表SEQ.ID.NO.5的核苷酸序列(5’-GGAAGAGAAACTCCTGACTTTGGGGAGGTTTTTGACTTGGACCAG CAGGTGTGGATCTTTCGTAATCAGGCCCTTGTGACAGTTCCACGAAGCCACAGAGTAACCCCAGTCAGCGTGACTATCCTCCCATGCAAGTACCCAGAGTCTCTTGAACAGGACAAAGGGATTGCCATTTATTTGGGAATTCAGAATCCAGATAAATGCCTGTTTTGTAAGGAAGTTAATGGACACCCTACTTTGCTGCTAAAGGAAGAGAAGATTTTGGATTTGTACCACCACCCTGAGCCAATGAAGCCATTCCTGTTTTACCACACCCGGACAGGTGGAACATCCACCTTTGAATCAGTGGCTTTCCCTGGCCACTATATTGCCTCCTCCAAGACTGGCAACCCCATCTTCCTCACATCAAAAAAGGGAGAATATTACAACATTAACTTCAATTTAGATATAAAGTCT-3’)；所述小鼠截短IL-36γ蛋白基因具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列(5’-AAAACCATGGGGCGTGAAACCCCG-3’)；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列(5’-CCCCTCGAGAGATTTGATATCCAG GTTG-3’)；所述PCR扩增的反应体系为：2×Pfu Master Mix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含浓度为50mg/L的卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液，进行诱导表达，再在转速为4000r/min的条件下离心10min后，得到菌体；所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后在转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液；超声裂解的反应条件为：在功率为150W的条件下，超声3s，然后停止3s，循环进行，共计进行50min；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白；纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白的电泳图见图1，图中M为蛋白内参；图中1为S4中得到的IL-36γ重组工程菌的总细菌蛋白；图中2为S5中20℃经异丙基硫代半乳糖苷诱导的菌体的细菌总蛋白；图中3为S7中200mM咪唑洗脱截短IL-36γ蛋白。由此可见，截短IL-36γ蛋白制备纯化成功。
实施例3
本实施例还提供了一种制备实施例1的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列(5’-AAAACCATGGGGCGTGAAACCCCG-3’)；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列(5’-CCCCTCGAGAGATTTGATATCCAG GTTG-3’)；所述PCR扩增的反应体系为：2×Pfu Master Mix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含浓度为50mg/L的卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液，进行诱导表达，再在转速为5000r/min的条件下离心5min后，得到菌体；所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后在转速为8000r/min的条件下离心20min，取上清液；超声裂解的反应条件为：在功率为200W的条件下，超声5s，然后停止5s，循环进行，共计进行45min；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白；纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
将实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白用于降低DSS诱导的肠炎易感性的试验：
DSS诱导的肠炎动物模型的建立与观察
(1)DSS肠炎模型建立：
SPF级C57BL/6小鼠(6-8周，18-22g，雄性)，购于华阜康生物科技有限公司。饲养于桂林医学院实验动物中心SPF级动物实验室，温度24℃，湿度50％±10％，勤换垫料，喂食SPF级小鼠饲料及清洁消毒饮水。本实验由桂林医学院动物实验伦理委员会批准。实验小鼠给予2.5％的DSS饮用水5天直至小鼠体重降至80％以下。每日观测小鼠肠炎发病进展。(2)实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白干预DSS肠炎模型：
小鼠截短IL-36γ蛋白处理组(8只)：在饮用DSS溶液的同时，腹腔注射实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白(1μg/只/天，溶于100μL的PBS中)；
PBS处理组(8只)：在饮用DSS溶液的同时，腹腔注射PBS溶液(100μL/只/天)。每天进行DSS诱导肠炎模型小鼠的疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分；于DSS肠炎诱导第5日，处死小鼠，取结肠组织0.5cm，冲洗干净，4％多聚甲醛固定于4℃避光保存不超过24h。
用C57BL/6小鼠建立了DSS诱导的肠炎模型，图2显示，与PBS处理组相比，实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组的体重逐渐出现下降缓慢的现象，图3显示，解剖小鼠取出完整的大肠，PBS处理组和小鼠截短IL-36γ蛋白处理组比，小鼠肠管明显缩短，狭窄变形，肠腔内有稀便，PBS处理组的平均长度为5.5cm，而实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组的平均长度为6.4cm。
(3)HE染色及组织病理学评分
将充分固定后的小鼠肠管用1×PBS缓冲液浸洗，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后烤干进行HE染色，步骤如下：
①、脱蜡：为防止玻片冷却，烤片后应立即将玻片放于二甲苯中：
二甲苯(I、II、III)5min×3次，即每次更换新的二甲苯；
100％乙醇(I、II、III)5min×2次，即每次更换新的100％乙醇；
95％、90％、80％、70％、50％乙醇水溶液5min/个，即每个浓度处理5min；
蒸馏水浸洗5min。
②、苏木素染细胞核：苏木素中浸泡4min，之后自来水冲洗15min。显微镜下观察染色深浅，用1％盐酸乙醇混合液分化5s，用自来水冲洗15min泛蓝。
③、伊红染液染细胞浆：将玻片架置于伊红染液中约1min，自来水换洗3次，冲去浮色，在镜下观察颜色深浅，再用蒸馏水浸洗1min，染色完成。
④、脱水透明封片：用滤纸吸干组织周围多余水分，切勿让组织干燥，放入梯度酒精中脱水：
中性树胶封片，晾干。
⑤、在光学显微镜下观察结肠组织的病理变化，根据Sun等的炎症分级标准，进行评分。评分标准如下：
上皮(E)：0，黏膜组织完整；1，杯状细胞消失；2，杯状细胞大面积消失；3，隐窝消失；4，隐窝大面积消失
炎症浸润(I)：0：无炎症浸润；1，基底部炎症浸润；2，炎症浸润到黏膜肌层；3，黏膜肌层有大量炎症浸润，黏膜层增厚并伴有水肿；4，炎症浸润到黏膜下层
病理评分＝E+I
小鼠结肠组织切片经HE染色，图4光学显微镜下观察可见，实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组(8只)小鼠上皮组织基本完整，隐窝基本完好，杯状细胞基本完好，病理评分为3.23±0.5，而PBS对照组(8只)几乎没有完整的上皮组织，隐窝大面积消失，杯状细胞大面积消失以及大量炎性细胞浸润，组织损伤评分明显增加，病理评分为6.75±1.26。上述结果说明给予实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白降低小鼠对DSS诱导的肠炎易感性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (10)
1.小鼠截短IL-36γ蛋白在制备免疫调节药物中的应用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫调节药物包括调节炎症性肠病的药物。
3.小鼠截短IL-36γ蛋白在制备降低DSS诱导的肠炎易感性的药物中的应用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白的制备方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h～14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶液，进行诱导表达，离心后，得到菌体；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后离心，取上清液；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S2中所述PCR扩增的反应体系为：2×PfuMasterMix25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S5中所述LB培养基中的卡那霉素的浓度为50mg/L。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S5中所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S5中离心的转速为4000rpm～5000rpm，离心的时间为5min～10min；
S6中离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心的时间为10min～20min。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S6中超声裂解的反应条件为：在功率为150W～200W的条件下，超声3s～5s，然后停止3s～5s，循环进行，共计进行45min～50min。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，S7中纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
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