CN112358539A - 一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种小鼠截短IL‑36γ蛋白，具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列，具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列；还提供了制备方法，构建pUC57‑mIL‑36γ质粒作为模板，以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，PCR扩增，构建重组表达载体pET28a‑mIL‑36γ，转化大肠杆菌BL21，得到IL‑36γ重组工程菌，接种于含卡那霉素的LB培养基中培养后诱导表达，离心得菌体，超声裂解后离心，取上清液，用Ni‑NAT柱纯化，得到小鼠截短IL‑36γ蛋白。本发明小鼠截短IL‑36γ蛋白的制备方法简单，产量高，采用亲和层析，能够一步得到纯度较高的蛋白，本发明制备的小鼠截短IL‑36γ蛋白能够在免疫调节方面，特别是炎症性肠病中发挥作用。

Description

一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于IL-36γ蛋白制备技术领域，具体涉及一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法。
背景技术
IL-36γ蛋白功能是在免疫调节方面，特别是在炎症性肠病中发挥作用，但目前并未IL-36γ蛋白的人工合成方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法，该小鼠截短IL-36γ蛋白的制备方法简单，产量高，采用亲和层析，能够一步得到纯度较高的蛋白，本发明制备的小鼠截短IL-36γ蛋白能够在免疫调节方面，特别是自身免疫疾病中发挥作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种小鼠截短IL-36γ蛋白，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
本发明还提供了一种制备上述的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h～14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液，进行诱导表达，离心后，得到菌体；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后离心，取上清液；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。
优选地，S2中所述PCR扩增的反应体系为：2×Pfu Master Mix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。
优选地，S5中所述LB培养基中的卡那霉素的浓度为50mg/L。
优选地，S5中所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h。
优选地，S5中离心的转速为4000rpm～5000rpm，离心的时间为5min～10min。
优选地，S6中离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心的时间为10min～20min。
优选地，S6中超声裂解的反应条件为：在功率为150W～200W的条件下，超声3s～5s，然后停止3s～5s，循环进行，共计进行45min～50min。
优选地，S7中纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的小鼠截短IL-36γ蛋白的制备方法简单，产量高，采用亲和层析，能够一步得到纯度较高的蛋白，本发明制备的小鼠截短IL-36γ蛋白能够在免疫调节方面，特别是炎症性肠病中发挥作用。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的实施例3制备的截短IL-36γ蛋白的电泳图。
图2是本发明的实施例3制备小鼠截短IL-36γ蛋白处理的DSS诱导的肠炎模型的小鼠体重变化图。
图3是本发明的实施例3制备小鼠截短IL-36γ蛋白处理的解剖小鼠大肠图。
图4是本发明的实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组小鼠上皮组织的光学显微镜图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的小鼠截短IL-36γ蛋白，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
实施例2
本实施例还提供了一种制备实施例1的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：对原始的小鼠IL-36γ核苷酸序列进行密码子优化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白基因，将合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；所述原始的小鼠IL-36γ具有序列表SEQ.ID.No.5的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白基因具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；所述PCR扩增的反应体系为：2×Pfu Master Mix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含浓度为50mg/L的卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液，进行诱导表达，再在转速为4000r/min的条件下离心10min后，得到菌体；所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后在转速为10000r/min的条件下离心10min，取上清液；超声裂解的反应条件为：在功率为150W的条件下，超声3s，然后停止3s，循环进行，共计进行50min；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白；纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白的电泳图见图1，图中M为蛋白内参；图中1为S4中得到的IL-36γ重组工程菌的总细菌蛋白；图中2为S5中20℃经异丙基硫代半乳糖苷诱导的菌体的细菌总蛋白；图中3为S7中200mM咪唑洗脱截短IL-36γ蛋白。由此可见，截短IL-36γ蛋白制备纯化成功。
实施例3
本实施例还提供了一种制备实施例1的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；所述PCR扩增的反应体系为：2×Pfu Master Mix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含浓度为50mg/L的卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷溶液，进行诱导表达，再在转速为5000r/min r/min的条件下离心5min后，得到菌体；所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后在转速为8000r/min的条件下离心20min，取上清液；超声裂解的反应条件为：在功率为200W的条件下，超声5s，然后停止5s，循环进行，共计进行45min；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白；纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
将实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白用于降低DSS诱导的肠炎易感性的试验：
DSS诱导的肠炎动物模型的建立与观察
(1)DSS肠炎模型建立：
SPF级C57BL/6小鼠(6-8周，18-22g，雄性)，购于华阜康生物科技有限公司。饲养于桂林医学院实验动物中心SPF级动物实验室，温度24℃，湿度50％±10％，勤换垫料，喂食SPF级小鼠饲料及清洁消毒饮水。本实验由桂林医学院动物实验伦理委员会批准。实验小鼠给予2.5％的DSS饮用水5天直至小鼠体重降至80％以下。每日观测小鼠肠炎发病进展。(2)实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白干预DSS肠炎模型：
小鼠截短IL-36γ蛋白处理组(8只)：在饮用DSS溶液的同时，腹腔注射实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白(1μg/只/天，溶于100μL的PBS中)；
PBS处理组(8只)：在饮用DSS溶液的同时，腹腔注射PBS溶液(100μL/只/天)。每天进行DSS诱导肠炎模型小鼠的疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分；于DSS肠炎诱导第5日，处死小鼠，取结肠组织0.5cm，冲洗干净，4％多聚甲醛固定于4℃避光保存不超过24h。
用C57BL/6小鼠建立了DSS诱导的肠炎模型，图2显示，与PBS处理组相比，实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组的体重逐渐出现下降缓慢的现象，图3显示，解剖小鼠取出完整的大肠，PBS处理组和小鼠截短IL-36γ蛋白处理组比，小鼠肠管明显缩短，狭窄变形，肠腔内有稀便，PBS处理组的平均长度为5.5cm，而实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组的平均长度为6.4cm。
(3)HE染色及组织病理学评分
将充分固定后的小鼠肠管用1×PBS缓冲液浸洗，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后烤干进行HE染色，步骤如下：
①、脱蜡：为防止玻片冷却，烤片后应立即将玻片放于二甲苯中：
二甲苯(I、II、III) 5min×3次，即每次更换新的二甲苯
100％乙醇(I、II、III) 5min×2次，即每次更换新的100％乙醇
95％、90％、80％、70％、50％乙醇水溶液5min/个，即每个浓度处理 5min
蒸馏水浸洗 5min
②、苏木素染细胞核：苏木素中浸泡4min，之后自来水冲洗15min。显微镜下观察染色深浅，用1％盐酸乙醇混合液分化5s，用自来水冲洗15min泛蓝。
③、伊红染液染细胞浆：将玻片架置于伊红染液中约1min，自来水换洗3次，冲去浮色，在镜下观察颜色深浅，再用蒸馏水浸洗1min，染色完成。
④、脱水透明封片：用滤纸吸干组织周围多余水分，切勿让组织干燥，放入梯度酒精中脱水：
Figure BDA0002779887590000081
中性树胶封片，晾干。
⑤、在光学显微镜下观察结肠组织的病理变化，根据Sun等的炎症分级标准，进行评分。评分标准如下：
上皮(E)：0，黏膜组织完整；1，杯状细胞消失；2，杯状细胞大面积消失；3，隐窝消失；4，隐窝大面积消失
炎症浸润(I)：0：无炎症浸润；1，基底部炎症浸润；2，炎症浸润到黏膜肌层；3，黏膜肌层有大量炎症浸润，黏膜层增厚并伴有水肿；4，炎症浸润到黏膜下层
病理评分＝E+I
小鼠结肠组织切片经HE染色，图4光学显微镜下观察可见，实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白处理组(8只)小鼠上皮组织基本完整，隐窝基本完好，杯状细胞基本完好，病理评分为3.23±0.5，而PBS对照组(8只)几乎没有完整的上皮组织，隐窝大面积消失，杯状细胞大面积消失以及大量炎性细胞浸润，组织损伤评分明显增加，病理评分为6.75±1.26。上述结果说明给予实施例3制备的小鼠截短IL-36γ蛋白降低小鼠对DSS诱导的肠炎易感性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 桂林医学院附属医院
<120> 一种小鼠截短IL-36γ蛋白及其制备方法
<130> 2020.7.15
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 1
atggggcgtg aaaccccgga tttcggtgaa gttttcgatc tggatcagca ggtttggatc 60
ttccgtaacc aggcgctggt taccgttccg cgttctcacc gtgttacccc ggtttctgtt 120
accatcctgc cgtgcaaata cccggaatct ctggaacagg ataaaggtat cgctatctac 180
ctgggtatcc agaacccgga taaatgcctg ttctgtaaag aagttaacgg tcacccgacc 240
ctgctgctga aagaagaaaa aatcctggat ctgtaccacc acccggaacc gatgaaaccg 300
ttcctgttct accacacccg taccggtggt accagcacct tcgaatctgt ggcgttccca 360
ggtcactaca tcgcttcttc taaaaccggc aacccgatct tcctgaccag caaaaaaggt 420
gaatactata acatcaactt caacctggat atcaaatctc tcgagcacca ccaccaccac 480
cac 483
<210> 2
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 2
Met Gly Arg Glu Thr Pro Asp Phe Gly Glu Val Phe Asp Leu Asp Gln
1 5 10 15
Gln Val Trp Ile Phe Arg Asn Gln Ala Leu Val Thr Val Pro Arg Ser
20 25 30
His Arg Val Thr Pro Val Ser Val Thr Ile Leu Pro Cys Lys Tyr Pro
35 40 45
Glu Ser Leu Glu Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Tyr Leu Gly Ile Gln
50 55 60
Asn Pro Asp Lys Cys Leu Phe Cys Lys Glu Val Asn Gly His Pro Thr
65 70 75 80
Leu Leu Leu Lys Glu Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr His His Pro Glu
85 90 95
Pro Met Lys Pro Phe Leu Phe Tyr His Thr Arg Thr Gly Gly Thr Ser
100 105 110
Thr Phe Glu Ser Val Ala Phe Pro Gly His Tyr Ile Ala Ser Ser Lys
115 120 125
Thr Gly Asn Pro Ile Phe Leu Thr Ser Lys Lys Gly Glu Tyr Tyr Asn
130 135 140
Ile Asn Phe Asn Leu Asp Ile Lys Ser Leu Glu His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 3
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<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 4
cccctcgaga gatttgatat ccaggttg 28
<210> 5
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工合成 (Artificial synthesis)
<400> 5
ggaagagaaa ctcctgactt tggggaggtt tttgacttgg accagcaggt gtggatcttt 60
cgtaatcagg cccttgtgac agttccacga agccacagag taaccccagt cagcgtgact 120
atcctcccat gcaagtaccc agagtctctt gaacaggaca aagggattgc catttatttg 180
ggaattcaga atccagataa atgcctgttt tgtaaggaag ttaatggaca ccctactttg 240
ctgctaaagg aagagaagat tttggatttg taccaccacc ctgagccaat gaagccattc 300
ctgttttacc acacccggac aggtggaaca tccacctttg aatcagtggc tttccctggc 360
cactatattg cctcctccaa gactggcaac cccatcttcc tcacatcaaa aaagggagaa 420
tattacaaca ttaacttcaa tttagatata aagtct 456

Claims (9)

1.一种小鼠截短IL-36γ蛋白，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。
2.一种制备如权利要求1所述的小鼠截短IL-36γ蛋白的方法，其特征在于，该方法为：
S1、构建pUC57-mIL-36γ质粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57载体质粒，构建pUC57-mIL-36γ质粒；
S2、PCR扩增：以P1和P2为特异性引物，在引物的两侧导入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ质粒为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述P1特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特异性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；
S3、重组表达载体pET28a-mIL-36γ的构建：将pET28a载体质粒和S2中得到的PCR扩增产物分别均用NcoⅠ内切酶和XhoⅠ内切酶进行双酶切，双酶切后凝胶回收pET28a载体和IL-36γ，将回收后的pET28a载体与IL-36γ经T4连接酶定向连接，构建重组表达载体pET28a-mIL-36γ；
S4、转化：将S3中得到的重组表达载体pET28a-mIL-36γ转化大肠杆菌BL21，得到IL-36γ重组工程菌；
S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的诱导表达：将S4中得到的IL-36γ重组工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，在温度为37℃、摇速为200r/min的条件下震荡培养12h～14h后，以1:100的比例进行扩大培养，在温度为37℃、摇速为210r/min的条件下震荡培养3h，至OD600达到0.6时止，加入浓度为0.7mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶液，进行诱导表达，离心后，得到菌体；
S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的纯化：采用超声破碎法将S5中得到的菌体进行超声裂解后离心，取上清液；
S7、用Ni-NAT柱对S6中得到的上清液进行纯化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中所述PCR扩增的反应体系为：2×PfuMaster Mix 25μL，P1特异性引物2μL、P2特异性引物2μL、pUC57-mIL-36γ质粒0.2μL，双蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，扩增30个循环；72℃延伸10min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S5中所述LB培养基中的卡那霉素的浓度为50mg/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S5中所述诱导表达的条件为温度为20℃，摇速为120r/min的条件下诱导20h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S5中离心的转速为4000rpm～5000rpm，离心的时间为5min～10min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S6中离心的转速为8000rpm～10000rpm，离心的时间为10min～20min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S6中超声裂解的反应条件为：在功率为150W～200W的条件下，超声3s～5s，然后停止3s～5s，循环进行，共计进行45min～50min。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S7中纯化的方法为：用浓度为50mmol/L的咪唑溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mmol/L的咪唑溶液洗脱截短IL-36γ蛋白。
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