CN108034643B

CN108034643B - 7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN108034643B
Application number: CN201711364819.6A
Authority: CN
Inventors: 王伯初; 季顺林; 唐士金; 祝连彩; 娄德帅; 谭君
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: CN108034643A

Abstract

本发明公开了7α‑羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用。本发明所提供的7α‑羟基类固醇脱氢酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，还公开了所述的7α‑羟基类固醇脱氢酶的基因的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示。该7α‑羟基类固醇脱氢酶能够催化底物牛磺胆酸(TCA)生成牛磺7‑酮胆酸(T7K‑CA)、催化底物甘氨胆酸(GCA)生成甘氨7‑酮胆酸(G7K‑CA)、催化底物牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)生成牛磺7‑酮石胆酸(T7K‑LCA)、催化底物甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)生成甘氨7‑酮石胆酸(G7K‑LCA)、催化底物苯甲酰甲酸乙酯(Ethyl benzoylformate，EB)生成苯甲醇甲酸乙酯(Ethyl 2‑hydroxy‑2‑phenylacetate)，并且具有更好的催化活性，对TCDCA、GCDCA、EB的催化活性分别为撒丁岛梭菌7α‑HSDH的10倍、5倍、3倍，具有很大的工业应用价值。

Description

7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有5个，它们分别来自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichia coli；来自Clostridium absonum和Collinsellaaerofaciens的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。

酶的活性和热稳定性是决定能否投入工业生产的重要参数，现有的羟基类固醇脱氢酶的活性和稳定性还不能同时满足工业生产的需求，因此，需要进一步寻找和开发新的适用于工业大规模生产的羟基类固醇脱氢酶。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供一种新的7α-羟基类固醇脱氢酶。

本发明所提供的7α-羟基类固醇脱氢酶，为如下(1)或(2)所示：

(1)SEQ ID No.1所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。

本发明所提供的7α-羟基类固醇脱氢酶能够催化底物牛磺胆酸(TCA)生成牛磺7-酮胆酸(T7K-CA)、催化底物甘氨胆酸(GCA)生成甘氨7-酮胆酸(G7K-CA)、催化底物牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)生成牛磺7-酮石胆酸(T7K-LCA)、催化底物甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)生成甘氨7-酮石胆酸(G7K-LCA)、催化底物苯甲酰甲酸乙酯(Ethyl benzoylformate，EB)生成苯甲醇甲酸乙酯(Ethyl 2-hydroxy-2-phenylacetate)。并且与撒丁岛梭菌Clostridiumabsonum中的7α-羟基类固醇脱氢酶(命名为Ca7α-HSDH)相比，具有更好的催化活性，对TCDCA、GCDCA和EB的催化活性分别为撒丁岛梭菌7α-HSDH的10倍、5倍和3倍，具有很大的工业应用价值。

本发明还提供了所述7α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。

本发明利用宏基因组测序技术从四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品中分离出一种新的7α-羟基类固醇脱氢酶基因，即7α-HSDHJ-1-1基因，其核苷酸序列自5’末端第1位到第786位为开放阅读框，开放阅读框部分为786bp，其编码的7α-HSDHJ-1-1蛋白的氨基酸如序列表中序列1所示，序列1由260个氨基酸序列组成。

含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明所述的载体，可以是克隆载体，包含7α-HSDHJ-1-1基因和质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含7α-HSDHJ-1-1基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。

本发明提供的重组细胞，可以是包含克隆载体的重组细胞，例如E.coli DH5α；也可以是包含表达载体的细胞，在适当的条件下培养细胞，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导7α-HSDHJ-1-1的表达。

所述7α-羟基类固醇脱氢酶在催化反应中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种催化剂，所述催化剂包括所述的7α-羟基类固醇脱氢酶。

本发明所提供的催化剂，其有效成分包括本发明的7α-HSDHJ-1-1。所述催化剂也可以与其它适合的催化剂同时使用，从而提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

本发明还提供了一种实现底物的羰基不对称还原的方法，使用所述7α-羟基类固醇脱氢酶蛋白或所述催化剂对底物进行催化反应。

所述底物选自牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、苯甲酰甲酸乙酯中一种或几种。

所述催化反应为：

催化底物牛磺胆酸生成牛磺7-酮胆酸；

或催化底物甘氨胆酸生成甘氨7-酮胆酸；

或催化底物牛磺鹅去氧胆酸生成牛磺7-酮石胆酸；

或催化底物甘氨鹅去氧胆酸生成甘氨7-酮石胆酸；

或催化底物苯甲酰甲酸乙酯生成苯甲醇甲酸乙酯。

本发明所提供的7α-羟基类固醇脱氢酶蛋白，能够催化牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的C₇α-羟基的羰基不对称还原反应，催化苯甲酰甲酸乙酯(Ethyl benzoylformate，EB)的苯甲酰基中羰基与羟基的不对称还原反应。

附图说明

图1是7α-、7β-HSDH联合转化TCDCA制备TUDCA示意图。

图2是分离的7α-HSDHJ-1-1基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图3是7α-HSDHJ-1-1和撒丁岛梭菌7α-HSDH酶蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为7α-HSDHJ-1-1，泳道2为撒丁岛梭菌7α-HSDH，M为Marker。。

图4是7α-HSDHJ-1-1基因与撒丁岛梭菌7α-HSDH基因的序列比对结果；其中，Ca7α-HSDH为现有的撒丁岛梭菌7α-HSDH基因的核苷酸序列，J-1-1为本发明分离的7α-HSDHJ-1-1基因的核苷酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

生物材料：

E.coli DH5α感受态细胞，购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB101；

E.coli BL21感受态细胞，购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB105。

实验试剂：

粪便DNA基因组提取试剂盒，购买自德国Qiagen公司，货号：51604；

琼脂糖凝胶回收试剂盒，购买自Omega，货号：D2500-01；

载体pGEX-6p-2，购买自优宝公司：货号VT1259；

质粒提取试剂盒OMEGA Plasmid Mini Kit I，购买自OMEGA公司，货号：D6943；

限制性内切酶BamHI，购买自大连宝生物科技有限公司，货号：1010S；

限制性内切酶XhoI，购买自大连宝生物科技有限公司，货号：1094S；

DNA连接酶：T4 DNA Ligase，购买自大连宝生物科技有限公司，货号：D2011A；

Lysis buffer(裂解缓冲液)，配制而得，10mM pH 7.3的PBS含有PMSF 0.1mM、亮肽素Leupeptin 0.5mg/mL；

Glutathione Sepharose 4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836；

PreScission Protease，购买自GenScript公司，货号：Z02799-100；

BCA试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006；

TCDCA，购买自百灵威科技公司，货号：330776；

GCDCA，购买自百灵威科技公司，货号：107563；

TCA，购买自百灵威科技公司，货号：551055；

GCA，购买自百灵威科技公司，货号：135362；

EB，购买自百灵威科技公司，货号：242101；DNA提取所使用的黑熊粪便，本实验室冻存。

以下实施例中未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可根据本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、新的7α-HSDHJ-1-1基因的发现

使用灭菌处理的药匙，采取了四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品，并干冰保存运回实验室。使用Qiagen粪便DNA基因组提取试剂盒提取了黑熊粪便的总DNA，交由上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。用现有的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶(撒丁岛梭菌7α-HSDH)编码基因序列与宏基因组测序数据进行对比，发现了一种新的7α-HSDHJ-1-1基因，其核苷酸序列5’末端第1位到第786位为开放阅读框，开放阅读框部分为786bp，其编码的7α-HSDHJ-1-1蛋白的氨基酸如SEQ ID No.1所示，序列1由260个氨基酸序列组成。序列比对结果表明，这种新的7α-HSDH J-1-1基因与现有的撒丁岛梭菌7α-HSDH基因序列的一致性为72.8％(图4)。

实施例2、基因的克隆

1)引物设计：对测序获得的新的7α-HSDHJ-1-1基因序列设计引物，引物核苷酸序列如下：

J-1-1-BamHI-F：5′-CGGGATCCATGAGAGTAAAAGATAAAATAG-3′(序列表中序列2)，

J-1-1-XhoI-R：5′-CGCTCGAGTTATCTTTGAACAAGGTCTCCGTATT-3′(序列表中序列3)。

2)PCR扩增：以黑熊粪便的总DNA为模板，采用步骤1)获得的引物，按照下列PCR体系和程序进行扩增。

PCR体系包括：template DNA是0.5μL，J-1-1-BamHI-F(10μM)是2μL，J-1-1-XhoI-R(10μM)是2μL，0.1％BSA是3μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase是25μL，补ddH₂O至PCR体系为50μL。

PCR程序如下：

a.94℃预变性5min；

b.98℃变性10sec，53℃退火10sec，72℃延伸10sec，40个循环；

c.72℃延伸10min。

3)琼脂糖凝胶电泳：使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图2所示，出现大小约为800bp的条带。

4)切胶回收：在紫外灯下切取目的条带，使用Omega琼脂糖凝胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书中的操作步骤回收目的基因片段。

5)双酶切7α-HSDHJ-1-1基因：以BamHI和XhoI(均购买自大连宝生物科技有限公司)为限制性内切酶，双酶切4)切胶回收的7α-HSDHJ-1-1基因。

双酶切体系包括：7α-HSDHJ-1-1基因是35μL，BamHI是3μL，XhoI是3μL，10×Kbuffer是6μL，补无菌双蒸水至体系为60μL。

6)回收双酶切产物：使用Omega回收试剂盒，按照试剂盒说明书中的操作步骤回收双酶切目的基因片段。

实施例3、新基因的表达、提取与纯化

1.构建连接载体：将7α-HSDHJ-1-1基因的序列全长连接在载体pGEX-6p-2上。

连接体系包括：双酶切7α-HSDHJ-1-1基因是6μL，T4 DNA Ligase是1μL，载体pGEX-6p-2是2μL，10×T4 Ligase buffer是1μL，体系为10μL，16℃连接12h。

2.转化E.coli DH5α感受态细胞，步骤如下：

1)感受态细胞E.coli DH5α(购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB101)放置冰上融化。

2)将步骤1所得的连接体系加入融化的E.coli DH5α感受态中，冰上30min。

3)42℃热处理90s。

4)冰上静置2min。

5)加入无抗LB培养基600μL，摇床温度37℃，摇床摇速150rpm，时间45min。

6)吸取200μL菌液，涂布于氨苄青霉素(Amp⁺)抗性LB平板培养基上。

7)37℃过夜培养。

3.阳性克隆鉴定，步骤如下：

1)挑选单菌落，接种于LB/Amp⁺的液体培养基中，180rpm、37℃培养12小时，14000rpm离心4min获取菌体。

2)使用OMEGA Plasmid Mini Kit I质粒提取试剂盒，按照说明书中的操作步骤提取质粒。

3)使用克隆引物J-1-1-BamHI-F和J-1-1-XhoI-R按照实施例1中的PCR体系和程序进行PCR验证，确定基因片段成功插入pGEX-6p-2载体中。

4)将鉴定正确的重组质粒送上海生工公司测序，将测序结果比对正确的重组质粒pGEX-6p-2/7α-HSDHJ-1-1作为基因表达载体。

4.7α-HSDHJ-1-1基因的表达

1)质粒转化E.coli BL21细胞(购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：CB105)

a.-80℃中取出E.coliBL21感受态细胞冰上放置10min。

b.加入2μL表达载体pGEX-6p-2/7α-HSDHJ-1-1，冰上放置30min。

c.42℃热处理90sec。

d.冰上放置2min。

e.复苏，加入600μL LB培养基，于37℃，150rpm摇床培养45min。

f.吸取200μL菌液，涂布于Amp⁺LB平板培养基上。

g.37℃培养过夜，即得到重组细胞。

2)重组细胞表达与纯化

a.将重组细胞接种入无菌LB液体培养基中，氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，37℃，180rpm摇床培养。

b.待菌液OD600≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃诱导12h。8000rpm，5min收集菌体。

c.按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm离心20min。取上清。

d.将上清与Glutathione Sepharose 4B结合，填料使用的比例为每升培养体系使用5mL填料，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬。

e.结合完毕后，5000rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积，去除杂蛋白。

f.加入PreScission Protease酶切缓冲液。

g.4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。

h.将所得样品进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度，分子量约为27KD，使用BCA试剂盒按照试剂盒说明书的操作步骤测定纯化蛋白的浓度。

结果如图3所示，获得的7α-HSDHJ-1-1酶蛋白纯度很高，呈单一条带。以相同的方法对撒丁岛梭菌7α-HSDH进行蛋白表达，结果如图3所示，也获得了单一条带的撒丁岛梭菌7α-HSDH。图3中泳道1为7α-HSDHJ-1-1，泳道2为撒丁岛梭菌7α-HSDH，M为Marker。

实施例4、7α-HSDHJ-1-1基因的功能鉴定和酶活测试

在25℃条件下，向比色皿中加入1958μL 50mM Tris-HCl(pH＝8.0)溶液，20μL50mM的NADP⁺溶液，再向其中加入2μL上述获得的7α-HSDHJ-1-1酶蛋白溶液，最后加入20μL50mM的底物溶液，充分吹打混匀。混匀后立即置于分光光度计中调零。开始计时，每分钟读取一次340nm处光吸收的变化值。

与此同时，按照上述相同的方法测定撒丁岛梭菌7α-HSDH的酶活。本发明7α-HSDHJ-1-1酶蛋白以及撒丁岛梭菌7α-HSDH酶蛋白对各种底物的比活力如表1所示。比活力(U/mg)定义：在上述反应条件下，每毫克蛋白所含的酶活力单位数。

表1 7α-HSDHJ-1-1与撒丁岛梭菌7α-HSDH催化各底物的酶活比较

结果表明，本发明分离得到的7α-HSDHJ-1-1基因的产物为7α-羟基类固醇脱氢酶，该7α-羟基类固醇脱氢酶能够催化底物牛磺胆酸(TCA)生成牛磺7-酮胆酸(T7K-CA)、催化底物甘氨胆酸(GCA)生成甘氨7-酮胆酸(G7K-CA)、催化底物牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)生成牛磺7-酮石胆酸(T7K-LCA)、催化底物甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)生成甘氨7-酮石胆酸(G7K-LCA)、催化底物苯甲酰甲酸乙酯(Ethyl benzoylformate，EB)生成苯甲醇甲酸乙酯(Ethyl 2-hydroxy-2-phenylacetate)。

从表1可以看出，与撒丁岛梭菌7α-HSDH相比，本发明的7α-HSDHJ-1-1具有更高的酶活，对TCDCA、GCDCA和EB的催化活性分别为撒丁岛梭菌7α-HSDH的10倍、5倍和3倍，具有很大的工业应用价值。

实施例5、7α-HSDHJ-1-1热稳定性研究

将酶样品(不含甘油)在50℃金属浴放置20min，按照上述步骤三的测定酶活的方法检测残余酶活。每个样品进行不少于3次的重复实验。

结果如表2所示，在50℃热处理20min后，撒丁岛梭菌7α-HSDH酶活迅速下降，仅保留32.33％的酶活，而7α-HSDHJ-1-1仍保留74.47％的酶活。表明相比与撒丁岛梭菌7α-HSDH，7α-HSDHJ-1-1具有较好的热稳定性，更适于工业应用。

表2.撒丁岛梭菌7α-HSDH与7α-HSDHJ-1-1热稳定性比较

<110> 重庆大学

<120> 7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用

<130> P1730480.SEQ

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 260

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 7α-HSDHJ-1-1

<400> 1

Met Arg Val Lys Asp Lys Ile Ala Leu Val Thr Ser Ser Thr Lys Gly

1 5 10 15

Ile Gly Leu Ala Cys Ala Lys Ala Leu Ala Lys Asn Gly Ala Leu Val

20 25 30

Tyr Ile Ala Ala Arg Asn Glu Glu Leu Ala Asn Glu Val Ile Ala Glu

35 40 45

Ile Glu Ser Glu Gly Gly Lys Ala Lys Phe Val Tyr Phe Asn Ala Arg

50 55 60

Glu Val Glu Thr Tyr Asn Ser Met Ile Asp Thr Val Ile Glu Asn Glu

65 70 75 80

Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Tyr Gly Gly Thr Asn Val Gln

85 90 95

Leu Asp Lys Asn Leu Val Asp Gly Asp Thr Asp Ala Phe Phe Asn Ile

100 105 110

Val Gln Asp Asn Leu Gln Ser Val Tyr Leu Pro Cys Lys Arg Val Val

115 120 125

Pro His Met Ile Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser Ser

130 135 140

Ile Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Ser Arg Met Gly Tyr Cys Val Thr

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ile Asn Ser Leu Thr Gln Asn Ile Ala Leu Gln Tyr Ala

165 170 175

His Asp Asn Val Arg Cys Asn Ala Val Leu Pro Gly Leu Thr Ala Thr

180 185 190

Lys Ala Ala Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Phe Arg Lys Ser Phe Leu

195 200 205

Arg His Val Pro Leu Asn Arg Met Gly Thr Pro Glu Asp Ile Ala Asn

210 215 220

Ala Val Leu Phe Tyr Ala Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Thr Gly Asp

225 230 235 240

Ile Leu Glu Val Ser Gly Gly Tyr Ala Leu Gly Thr Pro Gln Tyr Gly

245 250 255

Asp Leu Val Gln

260

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> J-1-1-BamHI-F

<400> 2

cgggatccat gagagtaaaa gataaaatag 30

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> J-1-1-XhoI-R

<400> 3

cgctcgagtt atctttgaac aaggtctccg tatt 34

Claims

1.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.权利要求1所述的蛋白在催化底物牛磺胆酸生成牛磺7-酮胆酸、或催化底物甘氨胆酸生成甘氨7-酮胆酸、或催化底物牛磺鹅去氧胆酸生成牛磺7-酮石胆酸、或催化底物甘氨鹅去氧胆酸生成甘氨7-酮石胆酸、或催化底物苯甲酰甲酸乙酯生成苯甲醇甲酸乙酯中的应用。

4.一种催化剂，其特征在于：包括权利要求1所述的蛋白。

5.一种实现底物的羰基不对称还原的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的蛋白或权利要求4所述的催化剂对底物进行催化反应；所述底物选自牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、苯甲酰甲酸乙酯中一种或几种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述催化反应为：

催化底物牛磺胆酸生成牛磺7-酮胆酸；

或催化底物甘氨胆酸生成甘氨7-酮胆酸；

或催化底物牛磺鹅去氧胆酸生成牛磺7-酮石胆酸；

或催化底物甘氨鹅去氧胆酸生成甘氨7-酮石胆酸；

或催化底物苯甲酰甲酸乙酯生成苯甲醇甲酸乙酯。