CN115927428A

CN115927428A - 一种应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法、遗传操作系统、菌株和应用

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Publication number: CN115927428A
Application number: CN202211024636.0A
Authority: CN
Inventors: 张会图; 李相勋; 石爱琴
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开一种应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法、遗传操作系统、菌株和应用，所述系统的构建方法包括如下步骤：使用基本的分子生物学技术手段扩增获得来自pCas9的cas9基因，并以pART2为载体，再经过对来自pTrc99a、pXMJ19质粒部分片段的引入修饰，获得CRISPR/Cas9质粒，并命名为pAS4，即为适用于简单节杆菌的CRISPR/Cas9遗传操作系统。本发明实现CRISPR/Cas系统在简单节杆菌中的有效应用，提高简单节杆菌的遗传可操作性，为更好探究简单节杆菌中与醋酸可的松代谢相关的基因或基因簇莫定理论基础。

Description

一种应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法、遗传操作系统、菌株和应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，尤其是一种应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法、遗传操作系统、菌株和应用。

背景技术

简单节杆菌(Arthrobacter simplex，又名Pimelobactersiplex)属于革兰氏阳性严格好氧菌，对有机溶剂的耐受性比较高，并且可以生产多种甾体代谢酶，因此广泛用于进行甾体分子的转化。简单节杆菌在1，2-饱和-3-酮-甾体(如醋酸可的松)的诱导下产生的3-酮基甾体△1-脱氢酶(KsdD)[4-烯-3-氧代甾体：(受体)1-烯-氧化还原酶，EC 1.3.99.4]属于FAD-依赖性氧化还原酶，可以催化在甾体A环的1，2位引入键，被广泛用于生产有价值的药物和类固醇产品的直接前体；醋酸可的松属于糖皮质激素，可以在细胞生长的任何时间加入，从而实现对酶生产的诱导。

醋酸可的松在KsdD催化下可以转化为醋酸尼泼松，醋酸尼泼松是一种肾上腺皮质激素，能对抗细菌内毒素对机体的刺激反应，以减轻细胞损伤、充分保护机体；适用于治疗类风湿关节炎、风湿热、红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎、急性淋巴白血病等。醋酸尼泼松极易自消化道吸收，其本身以活性形式存在，无需经肝脏转化即发挥其生物效应。相对于醋酸可的松，醋酸尼泼松的抗炎作用提高了3-4倍，并且可以减少由钠滞留带来的副作用。因此，研究醋酸可的松△1-脱氢生产醋酸尼泼松具有重要的医学价值。

简单节杆菌属于革兰氏阳性菌，属于高GC含量的微生物，介于细菌和放线菌之间，分类有时分到放线菌，遗传操作比较困难。

目前，CRISPR/Cas系统是应用最广的基因组编辑技术，自2007年发现以来，研究者对其作用机理进行了研究和详细的阐述。目前已经成功应用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、链霉菌、植物以及小鼠细胞和人类细胞的基因组编辑；另外，通过对CRISPR/Cas9系统进行改造，实现了该系统在基因转录研究方面的应用。

在本发明中，基于对传统CRISPR/Cas系统进行改进，构建了一种适用于简单节杆菌的CRISPR/Cas9高效遗传操作系统，并成功地利用该系统对简单节杆菌中ksdD基因进行敲除，经过筛选后获得ksdD敲除菌株AS002。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法、遗传操作系统、菌株和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种适用于简单节杆菌的CRISPR/Cas9遗传操作系统，所述系统的构建方法包括如下步骤：

使用基本的分子生物学技术手段扩增获得来自pCas9的cas9基因，并以pART2为载体，再经过对来自pTrc99a、pXMJ19质粒部分片段的引入修饰，获得CRISPR/Cas9质粒，并命名为pAS4，即为适用于简单节杆菌的CRISPR/Cas9遗传操作系统。

进一步地，所述pCas9为Addgene plasmid#42876。

进一步地，所述系统的构建方法包括如下具体步骤：

(1)以pCas9为模板，扩增cas9基因，并将其克隆到pART2质粒上，所得质粒命名为pAS1，Cas9将利用启动子hdnO进行转录；

(2)直接合成不携带N20的gRNA寡核苷酸链，将其克隆到pTrc 99a，使其利用trc启动子转录，获得质粒pAS2；合成携带用于删除pART2质粒20bp靶点序列的gRNA，并将其克隆到pXMJ19上，使其利用tac启动子转录，需要IPTG诱导，获得质粒pAS3；

(3)以pAS2为模板，将trc启动子、gRNA以及TrrnB进行PCR扩增，获得片段1；以pAS3为模版，PCR扩增获得片段2，片段2包括lacl-Ptac-gRNA(pART2)-TrrnB序列；将片段1和片段2进行连接，获得片段3；将片段3克隆到pAS1，获得质粒pAS4；质粒pAS4将用于克隆靶标基因的gRNA(N20)和进行cas9基因的表达，从而进行靶标基因的编辑；同时pAS4上克隆有进行pART2消除的gRNA，在IPTG诱导下gRNA(pART2)能够利用tac启动子进行转录，转录产物指导Cas9对pAS4进行切割，从而将pAS4从细胞内删除。

如上所述的遗传操作系统在简单节杆菌的基因编辑中的应用。

利用如上所述的遗传操作系统的应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法，所述方法通过PCR技术获得ksdD基因的gRNAN20序列，利用CRISPR/Cas9遗传操作系统，经过酶切、链接同源重组手段获得ksdD基因敲除质粒，利用等高效转化手段以及筛选条件得到阳性转化子，并通过PCR技术验证成功得到ksdD敲除菌株。

进一步地，所述高效转化手段为化转方法。

进一步地，所述化转方法为电转。

利用如上所述的遗传操作系统的ksdD基因敲除菌株，所述ksdD基因敲除菌株的构建方法包括：

通过PCR技术获得ksdD基因的gRNAN20序列，利用CRISPR/Cas9遗传操作系统，经过酶切、链接同源重组手段获得ksdD基因敲除质粒，利用等高效转化手段以及筛选条件得到阳性转化子，并通过PCR技术验证成功得到ksdD敲除菌株。

进一步地，所述ksdD基因敲除菌株的具体构建方法包括：

(1)以简单节杆菌A.simplex 156(Arthrobacter simplex 156(IFO 12069),https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP009896.1)基因组为模板，克隆ksdD基因到pEASY-Blunt载体上，将得到的重组质粒命名为pAS5；第二步，以pAS5质粒DNA为模板，PCR扩增pEASY-Blunt载体和ksdD基因上下游各400个碱基，所得DNA扩增片段进行磷酸化处理和自连反应，自连得到的质粒命名为pAS6；以pAS6质粒DNA为模板，用引物ksdD-up/ksdD-down扩增DNA片段1用于基因敲除；其中，ksdD-up的序列为SEQ ID NO.1：5′-ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′，ksdD-down的序列为SEQ ID NO.2：5′-TCATCGCGCGTCCTCGG-3′；

(2)设计用于ksdD基因编辑的gRNAN20序列，其正义链为SEQ ID NO.3：5'-TTGCAGCCCGACGACCTGTTCATG-3'，其反义链为SEQ ID NO.4：3'-GTCGGGCTGCTGGACAAGTACTG-5'；将其克隆到pAS4上，获得质粒pAS7；

(3)将DNA片段I和pAS7共转入简单节杆菌A.simplex 156感受态细胞，验证重组子，以证明ksdD基因已经敲除，并将菌株命名为AS001；

(4)对AS001进行LB加IPTG诱导表达，以去除pAS7，在LB平板上划线培养，进行PCR鉴定，确认质粒的删除，阳性克隆命名为AS002。

如上所述的ksdD基因敲除菌株在筛选参与醋酸可的松代谢的相关基因中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明利用CRISPR/Cas9系统对简单节杆菌(A.simplex156)中参与醋酸可的松代谢的脱氢酶基因ksdD进行敲除，成功获得了ksdD敲除菌株AS002。

2、本发明实现CRISPR/Cas系统在简单节杆菌中的有效应用，提高简单节杆菌的遗传可操作性，为更好探究简单节杆菌中与醋酸可的松代谢相关的基因或基因簇莫定理论基础。

3、本发明通过构建适用于简单节杆菌(A.simplex 156)的遗传操作系统，用于获得删除脱氢酶基因ksdD的简单节杆菌(A.simplex 156)基因组文库，能够用于筛选除脱氢酶基因ksdD以外，其它参与醋酸可的松代谢的相关基因，本发明CRISPR/Cas9遗传操作系统高效可靠。

附图说明

图1为本发明中pAS1质粒结构图(已标明关键基因)；

图2为本发明中pAS2质粒结构图(已标明关键基因)；

图3为本发明中pAS3质粒结构图(已标明关键基因)；

图4为本发明中pAS4质粒合成流程图(已标明关键基因)；

图5为本发明中cas9基因PCR扩增核酸电泳图；其中：M为DNAMarker，1为cas9基因；

图6为本发明中ksdD基因PCR扩增核酸电泳图；其中：M为DNAMarker，1为ksdD基因；

图7为本发明中ksdD基因敲除验证核酸电泳图；其中1，2，3为阳性克隆菌p验证，4为ksdD对照基因；

图8为本发明中卡纳抗性基因PCR验证核酸电泳图；其中：M为DNAMarker，1，2为卡那霉素抗性基因验证片段，3，4，5，6为阳性转化子菌落PCR验证结果。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

使用基本的分子生物学技术手段扩增获得来自pCas9的cas9基因，并以pART2(质粒报道于文献Sandu Cristinel,Chiribau Calin-Bogdan,Sachelaru Paula,BrandschRoderich.Plasmids for nicotine-dependent and-independent gene expression inArthrobacter nicotinovorans and other arthrobacter species.[J].Applied andenvironmental microbiology,2005,71(12).DOI:10.1128/AEM.71.12.8920-8924.2005)为载体，再经过对来自pTrc99a、pXMJ19质粒部分片段的引入修饰，获得CRISPR/Cas9质粒，并命名为pAS4，即为适用于简单节杆菌的CRISPR/Cas9遗传操作系统。

较优地，所述pCas9为Addgene plasmid#42876。

较优地，所述系统的构建方法包括如下具体步骤：

较优地，所述高效转化手段为化转方法。

较优地，所述化转方法为电转。

较优地，所述ksdD基因敲除菌株的具体构建方法包括：

(1)以简单节杆菌A.simplex 156(Arthrobacter simplex 156(IFO12069),https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP009896.1)基因组为模板，克隆ksdD基因到pEASY-Blunt载体上，将得到的重组质粒命名为pAS5；第二步，以pAS5质粒DNA为模板，PCR扩增pEASY-Blunt载体和ksdD基因上下游各400个碱基，所得DNA扩增片段进行磷酸化处理和自连反应，自连得到的质粒命名为pAS6；以pAS6质粒DNA为模板，用引物ksdD-up/ksdD-down扩增DNA片段1用于基因敲除；其中，ksdD-up的序列为SEQ ID NO.1：5′-ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′，ksdD-down的序列为SEQ ID NO.2：5′-TCATCGCGCGTCCTCGG-3′；

具体地，相关制备及检测实施例如下：

使用基本的分子生物学技术手段扩增获得来自pCas9(Addgene plasmid#42876)的cas9基因，并以pART2为载体，再经过对来自pTrc99a、pXMJ19质粒部分片段的引入修饰，获得CRISPR/Cas9质粒，并命名为pAS4。通过PCR技术获得ksdD基因的gRNAN20序列，经过酶切、链接同源重组等手段获得ksdD基因敲除质粒，利用化转(电转)等高效转化手段以及适合的筛选条件得到阳性转化子，并通过PCR技术验证成功得到ksdD敲除菌株。

在本发明中采用如下定义：

DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

本发明中使用的培养基及所使用溶液配置可以如下：

(1)LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，酵母提取物5.0。

(2)LA培养基：LB中加入1.5％(w/v)琼脂粉。pH 7.0～7.2。

(3)简单节杆菌复苏培养基：LB培养基中加入0.5mol/L的山梨醇，pH调至7.0～7.2。

0.1mol/LCaCl₂溶液：称量CaCl₂1.11 g溶于100mL去离子水中，121℃灭菌20min。

(4)简单节杆菌生长培养基

斜面培养基：葡萄糖1％，酵母膏1％,琼脂条2％，pH值7.0。

种子培养基：葡萄糖1％，玉米1.2％，酵母膏0.5％，KH₂PO₄0.25％，pH值6.7～7.0。

(5)核酸电泳缓冲液(50×TAE)：Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g，加入800mL的去离子水，搅拌溶解，加入冰乙酸57.1mL，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。使用时稀释50倍。

(6)氯霉素贮液(40mg/mL)：0.4g氯霉素溶于10mL ddH2O中，过滤除菌。

(7)氨苄青霉素贮液(50mg/mL)：0.5g氨苄青霉素溶于10mL ddH2O中，过滤除菌。

(8)硫酸卡那霉素贮液(50mg/mL)：0.5g氨苄青霉素溶于10mL ddH2O中，过滤除菌。

(9)溶液I：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)；115℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存。

(10)溶液II：200mmol/LNaOH；1％SDS(现用现配)。

(11)溶液III：5mol/L乙酸钾60.0mL；冰乙酸11.5mL；水28.5mL(4℃保存，使用时置于冰浴中)。

(12)酚/氯仿/异戊醇混合溶液：将酚、氯仿、异戊醇按体积比25：24：1混合，室温搅拌过夜，至完全溶解。

(13)RNase溶液(10mg/mL)：用10mmol/LTris-HCl(pH 8.0)溶液配制，100℃煮沸15min，冰浴冷却，-20℃保存备用。

溶菌酶溶液(10mg/mL)：用10mmol/LTris-HCl(pH8.0)配制成10mg/mL的贮存液，-20℃保存备用。

(14)20mg/mL蛋白酶K：用50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，1.5mmol/L醋酸钙配制成20mg/mL的贮存液，-20℃保存备用。

(15)0.1mol/L CaCl₂溶液：称量CaCl₂1.11 g溶于100mL去离子水中，121℃灭菌20min。

培养基的固态培养基添加2％琼脂。

以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1：CRISPR/Cas9质粒的获得

1、上述CRISPR/Cas系统中cas9基因来源为pCas9(Addgene plasmid#42876)，该质粒来自实验室保藏菌株，本实验室已将pCas9质粒化转到E.coli DH5α中，并于-80℃甘油管中保藏。

其中，大肠杆菌E.coli DH5α感受态制备及化转操作方法如下：

(1)挑取三区划线后生长出的E.coli DH5α单菌落于无抗的5mL LB液体培养基的试管，37℃振荡培养过夜至对数生长后期。

(2)以1％的接种量将种子液转接于50mL LB液体培养基的三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.4～0.5。

(3)在超净台内，将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min。

(4)4℃，4000r/min离心10min，回收菌体，将培养液除尽。

(5)用10mL～15mL冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液悬浮菌体，冰上放置30min。

(6)4000r/min，4℃离心10min，回收菌体。

(7)用800μL冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液悬浮，分装，每50μL一份，将此感受态细胞悬液贮存于-70℃冰箱，可保存半年，不可反复冻融，使用时需在冰上解冻。

(8)从-70℃冰箱中取出感受态细胞，立即置于冰上解冻。

(9)加入10μLpCas9质粒质粒(含量不超过50ng)，轻轻混匀(不可用力过大，不可涡旋)，冰浴30min。

(10)42℃热激90s，立刻冰浴3min。

(11)加入800μl新鲜LB液体培养基，37℃，180r/min复苏培养40～50min。

(12)复苏后，离心3min，4000r/min，取出上清，剩余200μl上清，吹打数次，重悬菌体。

(13)涂布在含有氨苄抗生素的筛选平板上，正面向上放置1小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养。挑取正确的转化子，并于-80℃甘油管中保藏。

利用北京博迈德科技发展有限公司的质粒小量快速提取试剂盒，主要操作步骤如下。

(1)取一环保存有pCas9质粒的菌株斜面接种，划线分离于含有氨苄抗生素的LA平板上，37℃倒置培养过夜。

(2)挑取单菌落，接入到5mL含氨苄抗生素的LB液体培养基中，于37℃，180r/min培养过夜。

(3)将1.5mL-3mL菌液转入干净微量离心管中，9000r/min离心30s收集菌体，弃上清。

(4)将沉淀重悬于250μL溶液I中，用枪头反复吹打混匀。

(5)加入250μL溶液II，盖紧管口，温和的上下翻转4-5次，确保离心管的整个内表面菌与溶液P2接触，室温放置4min。

(6)加入350μL预冷的溶液III，立即温和翻转离心管4-7次，使溶液P3在粘稠的细菌裂解液中混合均匀并出现白色絮状沉淀，13000r/min离心10min，小心取上清。

(7)将上一步所得上清，转移到吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，13000r/min离心30s-60s，倒掉收集管中的废液。

(8)加入500μL漂洗液WB，12000r/min离心30s，弃掉废液。

(9)重复步骤(8)，将吸附柱AC放回空收集管中，12000r/min离心2min，吹干或烘干以充分除去漂洗液中的乙醇，以免乙醇抑制下游反应。

(10)取出吸附柱AC，放入一个干净的EP管中，在吸附膜中间部位加30μL-50μL洗脱缓冲液TE(或无菌水)，室温放置2min，12000r/min离心1min。收集液体-20℃保藏备用。

2、扩增pCas9质粒中的cas9基因

设计Cas9编码基因的扩增引物，序列如下：

上游C9F1(5′-CCGCGGATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAG-3′)：

下游C9R1(5′-TCAGTCACCTCCTAGCTGACGGGCCC-3′)：

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

PrimeSTAR Max	25μL
		上游引物P1(20μmol/L)	2μL
下游引物P2(20μmol/L)	2μL
		质粒	2μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	19μL
		总体积	50μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara

扩增程序的设置为：

a.预变性：98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：54℃45s；

d.延伸：72℃25s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到cas9基因的条带，约4107bp，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD-19T连接并送测序公司进行测序。结果如图5所示。

3、CRISPR/Cas质粒pAS4的构建(pAS4质粒的构建过程中所涉及的酶切、酶连，克隆等操作均为基本遗传操作。)

(1)将上述获得cas9基因片段通过酶切、酶连的方式克隆到经过双酶切线性化的pART2质粒上(质粒报道于文献Sandu Cristinel,Chiribau Calin-Bogdan,SachelaruPaula,Brandsch Roderich.Plasmids for nicotine-dependent and-independent geneexpression inArthrobacter nicotinovorans and other arthrobacter species.[J].Applied and environmental microbiology,2005,71(12).DOI:10.1128/AEM.71.12.8920-8924.2005)，所得质粒命名为pAS1，见图1。

(2)合成不携带N20的gRNA寡核苷酸链，将其克隆到pTrc 99a，获得质粒pAS2，见图2。

(3)设计携带用于删除pART2质粒20bp靶点序列的gRNA，并将其克隆到质粒pXMJ19上，获得质粒pAS3，见图3。

(4)以pAS2为模板，将trc启动子、gRNA以及TrrnB进行PCR扩增，获得片段1；以pAS3为模版，PCR扩增获得片段2，片段2包括lacl-Ptac-gRNA(pART2)-TrrnB序列；将片段1和片段2进行连接，获得片段3；将片段3克隆到pAS1，获得质粒pAS4，详细流程见图4。

实施例2：脱氢酶基因ksdD敲除质粒的构建

1、简单节杆菌(A.simplex 156)ksdD基因的获得

简单节杆菌(A.simplex 156)保藏于本实验室，基因组DNA的提取，用购自北京全世金生物技术有限公司的提取试剂盒，主要操作步骤如下。

(1)取一环保藏的菌株接种于上述生长斜面培养基中，划线分离于从平板培养基上挑选单菌落接种至5mL的液体LB培养基中，适当温度条件下，振荡培养过夜至对数中后期。

(2)取菌液0.5mL-1mL，12000r/min离心1min，弃上清液。

(3)加入100μL TE溶液，在漩涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散。

(4)再加入650μL TE溶液，振荡混匀(注意不要残留细小菌块)。

(5)向悬液中加入7.5μL的100mg/mL溶菌酶至终浓度为1mg/mL，混匀，37℃水浴30min。

(6)再向悬液中加入7.5μL蛋白酶K(10mg/mL)至终浓度为0.1mg/mL，混匀，55℃继续水浴1h，中间轻缓颠倒离心管数次。

(7)水浴结束后向溶液中加入用等体积(750μL)的苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液，上下颠倒充分混匀，12000r/min离心5min。将上清液移至新的离心管中，然后再用苯酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次。

(8)取上清液再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。

(9)取上清液至新的离心管中(约500μL)，向上清液中加入1/10体积(约50μL)的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)，混匀，-20℃静止30min沉淀DNA，取出，4℃、12000r/min离心10min。

(10)小心弃去上清液，用1mL的70％乙醇洗涤沉淀，4℃、12000r/min离心5min。再用70％乙醇洗涤一次，放入55℃烘箱中数分钟除去乙醇。

(11)用60μL含RNaseA(终浓度20μg/mL)的TE溶解，37℃温浴30min，除去RNA。

(12)取5μL样品进行电泳初步确定DNA的含量。

(13)样品贮存在-20℃冰箱里。

利用上述基因组为模板，以ksdD-F和ksdD-R为引物退火温度为62.5℃，成功的克隆出目的基因(ksdD，GenBank:D37969.1)，PCR产物电泳图如图3-5。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，约1547bp，与ksdD基因大小相符，证明通过PCR扩增获得ksdD基因，见图6。

设计ksdD编码基因的扩增引物，序列如下：

上游ksdD-F(5′-CCCATCGATATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′(ClaI))

(划线部分为ClaI酶切位点)

设计ksdD编码基因的扩增引物，序列如下：

下游ksdD-R(5′-TGCTCTAGATCATCGCGCGTCCTCGG-3′(XbaI))

(划线部分为XbaI酶切位点)

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

LA-Taq	0.2μL
		上游引物P1(20μmol/L)	2μL
下游引物P2(20μmol/L)	2μL
		简单节杆菌基因组	2μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	33.8μL
		10×buffer	5μL
dNTP	5μL
		总体积	50μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara

扩增程序的设置为：

g.预变性:95℃5min；

h.变性：94℃45s；

i.退火：62.5℃45s；

j.延伸：72℃60s；

k.b-d反应30个循环；

l.延伸:72℃10min。

将DNA片断进行回收，利用北京天恩泽基因科技发展有限公司的柱式试剂盒，主要操作步骤如下。

(1)切取含DNA片段的琼脂糖凝胶，放入干净的1.5mL离心管中，用移液枪头捣碎，按重量比为1︰3到1︰5的比例加入通用溶胶液。如为PCR回收，直接在PCR反应管中加入3-5倍体积的通用溶胶液，混匀。

(2)50℃保温使胶完全溶化，其间可以振荡数次以促进琼脂糖凝胶的溶化。如果片段长度在300bp以下，不要加热，以免DNA变性，影响回收率。

(3)将离心管中的溶液转移到离心吸附柱中，套上液体收集管，静置3min。静置有助于DNA与离心吸附柱的硅胶膜结合。若一次加不完，可分两次加入并离心。

(4)12000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体。

(5)加0.7mL-0.8mL通用洗柱液于离心柱中，室温静置2min。

(6)12000r/min离心1min，倒弃收集管中的废液。

(7)12000r/min离心2min以去除离心柱中的残留液体。

(8)将离心柱置于一新的干净的塑料离心管中，加入30μL-100μL 50℃预热的通用洗脱液，静置3min。

(9)12000r/min离心1min。

(10)离心管底部所得溶液即为纯化的DNA溶液。

将获得的DNA溶液通过酶切、连接方式整合到pEASY-Blunt载体中并命名pAS5。

2、DNA片段I以及含N20 gRNA的pAS4敲除质粒构建

以pAS5质粒DNA为模板，PCR扩增pEASY-Blunt载体和ksdD基因上下游各400个左右碱基，所得DNA扩增片段进行磷酸化处理和自连反应，自连得到的质粒命名为pAS6。以pAS6质粒DNA为模板，用引物ksdD-up/ksdD-down(ksdD-up的序列为：5′-ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3′，ksdD-down的序列为：5′-TCATCGCGCGTCCTCGG-3′扩增DNA片段1(即ksdD基因序列)用于基因敲除。

设计用于ksdD基因编辑的gRNAN20序列：

正义链:5'-TTGCAGCCCGACGACCTGTTCATG-3'

反义链:3'-GTCGGGCTGCTGGACAAGTACTG-5'

通过Gibson assembly技术无缝克隆到经过SapI单酶切线性化质粒pAS4上，获得质粒命名为pAS7。

根据酶切需要选择不同的限制性内切酶，酶切反应体系如下：

SapI单酶切体系(20μL)：

酶切温度37℃，酶切时间6h。

实施例3：ksdD基因敲除菌株的构建

首先需要制备简单节杆菌感受态，然后通过电转的方式将上述构建质粒导入受体菌内，具体操作步骤如下:

1、简单节杆菌感受态制备

(1)挑取新鲜的简单节杆菌单菌落于25mL生长培养基(培养基配配方见(4)简单节杆菌生长培养基)中，32℃振荡培养过夜(12h)，直至对数生长后期，得种子液。

(2)种子液以1/16的接种量接种于50mL生长培养基中，32℃振荡培养至OD600在0.3～0.5加入终浓度为10μg/mL的氨苄青霉素，32℃振荡培养1h。

(3)冰浴冷却培养物10min,于4℃，2000r/min离心15min，收集菌体。

(4)用预冷的电击缓冲液反复洗涤菌体收集物4次。

(5)用1mL电击缓冲液重新悬浮菌体收集物，细胞浓度应该在1～1.3×1010cfu/mL。

(6)菌体悬浮物，即感受态细胞小份分装，每份60μL，于-80℃保存。

2、简单节杆菌的电转

(1)从-70℃冰箱中取60μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置于冰上。

(2)向60μL感受态细胞中加入0.5μL(50ng/μL)质粒DNA与0.5μL(50ng/μL)的上述DNA片段I，混匀。转移混合物到冰冷的电转杯(1.0mm)中，冰浴1～1.5min，电击一次(1500V，4.0～5.0)。

(3)电击完毕后，立即加入1mL简单节杆菌复苏培养基，混匀。

(4)将混合物转移干灭好的试管中，37℃摇床震荡培养8h。

(5)取200μL复苏培养物涂布于含有氯霉素抗生素的筛选平板，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，32℃培养24～30h。

同时做3组对照：方法同上。

3、敲除菌株AS001的筛选

4、使用PCR技术对上述操作得到的转化子进行验证，证明敲除成功，结果见图7。由于ksdD的敲除，所以无法通过PCR操作获得片段，而未敲除成功的菌株则可以得到约1500bp大小的DNA片段。

5、引物设计同ksdD扩增引物，条件同ksdD扩增条件。

6、pAS7质粒的消除

7、挑取上述验证正确的AS001于LB培养基中，加IPTG诱导表达，以去除pAS7，在LB平板上划线培养，所得单克隆在含有硫酸卡那霉素的LB平板和无抗生素LB培养平板上分别划线，挑取只在无抗LB平板上生长的单克隆，以卡那霉素抗性基因部分基因为模板进行PCR鉴定，以无法扩增出抗性基因片段为筛选标记，确认质粒的删除，结果见图8，阳性克隆命名为AS002。

设计卡那霉素抗性编码基因的验证引物，序列如下：

上游KF1(5′-ATGAGCCATATTCAACGG-3′)：

下游KR1(5′-GACTTGTTCAACAGGCCA-3′)

扩增条件如上述LATaq的条件。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一种适用于简单节杆菌的CRISPR/Cas9遗传操作系统，其特征在于：所述系统的构建方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9遗传操作系统，其特征在于：所述pCas9为Addgene plasmid#42876。

3.根据权利要求1或2所述的CRISPR/Cas9遗传操作系统，其特征在于：所述系统的构建方法包括如下具体步骤：

4.如权利要求1至3任一项所述的遗传操作系统在简单节杆菌的基因编辑中的应用。

5.利用如权利要求1至3任一项所述的遗传操作系统的应用于简单节杆菌的基因快速编辑方法，其特征在于：所述方法通过PCR技术获得ksdD基因的gRNAN20序列，利用CRISPR/Cas9遗传操作系统，经过酶切、链接同源重组手段获得ksdD基因敲除质粒，利用等高效转化手段以及筛选条件得到阳性转化子，并通过PCR技术验证成功得到ksdD敲除菌株。

6.根据权利要求5所述的基因快速编辑方法，其特征在于：所述高效转化手段为化转方法。

7.根据权利要求6所述的基因快速编辑方法，其特征在于：所述化转方法为电转。

8.利用如权利要求1至3任一项所述的遗传操作系统的ksdD基因敲除菌株，其特征在于：所述ksdD基因敲除菌株的构建方法包括：

9.根据权利要求8所述的ksdD基因敲除菌株，其特征在于：所述ksdD基因敲除菌株的具体构建方法包括：

(1)以简单节杆菌A.simplex 15基因组为模板，克隆ksdD基因到pEASY-Blunt载体上，将得到的重组质粒命名为pAS5；第二步，以pAS5质粒DNA为模板，PCR扩增pEASY-Blunt载体和ksdD基因上下游各400个碱基，所得DNA扩增片段进行磷酸化处理和自连反应，自连得到的质粒命名为pAS6；以pAS6质粒DNA为模板，用引物ksdD-up/ksdD-down扩增DNA片段1用于基因敲除；其中，ksdD-up的序列为SEQ ID NO.1，ksdD-down的序列为SEQ ID NO.2；

(2)设计用于ksdD基因编辑的gRNAN20序列，其正义链为SEQ ID NO.3，其反义链为SEQID NO.4；将其克隆到pAS4上，获得质粒pAS7；

10.如权利要求8或9所述的ksdD基因敲除菌株在筛选参与醋酸可的松代谢的相关基因中的应用。