CN116064813B - Trim29基因甲基化的检测引物组合物、甲基化检测方法及应用 - Google Patents

Trim29基因甲基化的检测引物组合物、甲基化检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物、甲基化方法及应用。TRIM29基因甲基化的检测引物组合物包括上游引物TRIM29‑cg‑F、下游引物TRIM29‑cg‑R和测序引物TRIM29‑cg‑S，所述上游引物TRIM29‑cg‑F与所述下游引物TRIM29‑cg‑R能够扩增TRIM29基因，所述测序引物TRIM29‑cg‑S能够对TRIM29基因扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。本发明通过TRIM29基因甲基化的检测引物组合物及焦磷酸测序技术检测TRIM29基因甲基化水平，采用鼻咽拭子无创、快速，灵敏度及准确性高，对于鼻咽癌的早期检测有重要意义。

Description

TRIM29基因甲基化的检测引物组合物、甲基化检测方法及 应用
技术领域
本申请涉及分子生物检测技术领域，特别是涉及一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物、甲基化方法及应用。
背景技术
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种来源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤。由于鼻咽癌好发于壮年并且其发病部位较为隐蔽、解剖结构复杂而不易被早期发现，大部分患者就诊时已处于中晚期，治疗效果不理想。如果鼻咽癌患者能够在早期阶段发现并进行治疗，其预后将会极大地改善。特异性肿瘤相关基因CpG岛甲基化异常导致其转录表达异常，鼻咽癌相关基因的甲基化状态改变被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物，可作为肿瘤发生的一个早期敏感指标。
目前临床应用的鼻咽癌血清标志物主要有血清EB病毒抗体和EB病毒DNA拷贝数，此外依靠影像诊断和病理诊断，缺乏血清学特异的标志物。但是，EB病毒感染的人群中只有一小部分发生鼻咽癌，而且EB病毒的感染被认为是世界大部分地区都会存在。因此，寻找鼻咽癌高危易感人群的筛查、早期诊断等的敏感特异的分子靶标的相关研究依然非常重要。
TRIM29是TRIM(tripartite motif)家族的成员之一。TRIM29基因位于染色体11q23.3区域，编码蛋白又名ATDC(Ataxia-Telangiectasia Group D-AssociatedProtein)，TRIM29包含B-box1、B-box2结构域和coiled-coil结构域。近年来关于TRIM29的研究报道在肿瘤学领域较多，研究者发现其在多种类型的肿瘤中表达异常，如肺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌等。TRIM29可以与p53结合而阻止其进入细胞核，下调p53对下游基因p21和NOXA的转录活性，抑制其抗凋亡能力；此外，TRIM29还可以与Tip60结合而抑制Tip60对p53Lys120的乙酰化，进而使肿瘤细胞的增殖能力增强。在胰腺癌的研究中，TRIM29通过与分子Dvl2相互作用，激活β-catenin通路，促进胰腺癌细胞的生长和转移，与肿瘤的进展密切相关。近期，有研究报道了在皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌中TRIM29的表达被DNA甲基化沉默。但并无报道TRIM29基因低甲基化与鼻咽癌有无关系，因此，寻找新的TRIM29上的DNA标记物对鼻咽癌的诊断有重要的作用。
发明内容
基于此，有必要提供一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物。本发明通过TRIM29基因甲基化的检测引物组合物以及焦磷酸测序技术检测TRIM29基因甲基化的水平，采用鼻咽拭子无创、快速，灵敏度及准确性高，对于鼻咽癌的早期检测具有重要意义。
本申请一实施例提供了一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物。
一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，其特征在于，包括上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R和测序引物TRIM29-cg-S，所述上游引物TRIM29-cg-F与所述下游引物TRIM29-cg-R能够扩增TRIM29基因，所述测序引物TRIM29-cg-S能够对TRIM29基因扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。
在其中一些实施例中，所述上游引物TRIM29-cg-F与所述下游引物TRIM29-cg-R能够扩增TRIM29基因的第一外显子区域。
一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，包括上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R和测序引物TRIM29-cg-S，所述上游引物TRIM29-cg-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述下游引物TRIM29-cg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述测序引物TRIM29-cg-S的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在其中一些实施例中，TRIM29基因甲基化位点位于TRIM29基因组序列的第一外显子区域。
本申请一实施例提供了一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在制备TRIM29甲基化检测工具中的应用。
在其中一些实施例中，所述TRIM29甲基化检测工具包括但不限于单独试剂或试剂盒。
本申请一实施例提供了一种TRIM29甲基化检测工具。
一种TRIM29甲基化检测工具，包括所述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物。
本申请一实施例提供了一种所述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在制备鼻咽癌检测工具中的应用。
本申请一实施例提供了一种非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法，包括如下步骤：
步骤S1、提取待测样本DNA；
步骤S2、对步骤S1提取的待测样本DNA进行转化和纯化处理，得到DNA模板；
步骤S3、利用上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R对步骤S2转化和纯化处理得到的DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物；
步骤S4、利用测序引物TRIM29-cg-S对步骤S3扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。
在其中一些实施例中，步骤S2中待测样本DNA的浓度大于50ng/μL，待测样本DNA的样本总量大于1μg。
在其中一些实施例中，步骤S3中PCR扩增的反应体系如下：
扩增的反应程序为：95℃15s，56℃30s，72℃30s，50次循环；72℃，5min；4℃保持。
与现有技术相比，上述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物的有益效果在于：
(1)本发明公开了用于检测与鼻咽癌相关的TRIM29基因的第一外显子区域甲基化程度的检测引物组合物，TRIM29基因第一外显子区域DNA甲基化水平在鼻咽癌中显著降低。本发明发现了TRIM29基因甲基化位点可作为一种新的鼻咽癌肿瘤标志物，在鼻咽癌早期检测和诊断中有重要的价值。
(2)本发明可通过鼻拭子、咽拭子等检测高危易感人群、患者的TRIM29基因位点的甲基化程度，从而达到无创检测的目的。
(3)本发明所述的甲基化检测方法操作简便、适用范围广，且DNA甲基化修饰稳定，不容易降解，便于保存和运输，检测结果准确性高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
为了更完整地理解本申请及其有益效果，下面将结合附图来进行说明。其中，在下面的描述中相同的附图标号表示相同部分。
图1为TRIM29基因组序列的第一外显子区域以及所检测的6个CpG位点的详细位置图；
图2为TRIM29基因DNA甲基化水平检测结果示例图；
图3为鼻咽癌患者组织样本与对照组之间TRIM29基因甲基化差异图；
图4为鼻咽癌患者鼻咽拭子样本与对照组之间TRIM29基因甲基化差异图；
图5为鼻咽癌患者鼻咽拭子中TRIM29基因甲基化的ROC曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，本发明的TRIM29基因甲基化位点可作为一种新的鼻咽癌肿瘤标志物，在鼻咽癌早期检测和诊断中有重要的价值。为了更清楚的说明TRIM29基因甲基化的检测引物组合物的结构，以下将结合附图对TRIM29基因甲基化的检测引物组合物进行介绍。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明一实施例提供了一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物。
一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，包括上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29cg-R和测序引物TRIM29cgS，所述上游引物TRIM29cg-F与所述下游引物TRIM29cg-R能够扩增TRIM29基因，所述测序引物TRIM29cgS能够对TRIM29基因扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。
在其中一些实施例中，所述上游引物TRIM29cg-F与所述下游引物TRIM29cg-R能够扩增TRIM29基因的第一外显子区域。
一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，包括上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R和测序引物TRIM29-cg-S，所述上游引物TRIM29-cg-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述下游引物TRIM29-cg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述测序引物TRIM29-cg-S的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，TRIM29基因在genbank中的登录号为NC_000011.9。TRIM29基因组序列全长为26,870bp(chromosome11：119981994-120008863)，TRIM29基因组序列由8个内含子和9个外显子组成。
其中，上游引物TRIM29-cg-F(SEQ ID NO:1)：5’-GTAGGGTTTTAGTTGGGGGTTGTTA-3’；
下游引物TRIM29-cg-R(SEQ ID NO:2)：Biotin-5’-AAAAATCCCACAACACCTCCTC-3’；
测序引物TRIM29-cg-S(SEQ ID NO:3)：5’-GGAAGTTTAAGGTGTTTATTA-3'。
在其中一些实施例中，TRIM29基因组序列的甲基化位点位于TRIM29第一外显子区域，如附图1所示，图1为TRIM29基因组序列的第一外显子区域以及所检测的6个CpG位点(图1中的①-⑥)的详细位置图。图1中，第一外显子区域(图1中所示Exon 1)具体位置为Chr11:120008260-120008312(GRCh37/hg19)。
本发明一实施例提供了一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在制备TRIM29甲基化检测工具中的应用。
在其中一些实施例中，所述TRIM29甲基化检测工具包括但不限于单独试剂或试剂盒。
本发明一实施例提供了一种TRIM29甲基化检测工具。
一种TRIM29甲基化检测工具，包括所述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物。
本发明一实施例提供了所述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在检测鼻咽癌中的应用。
本发明一实施例提供了一种所述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在制备鼻咽癌检测工具中的应用。
本发明一实施例提供了一种非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法，包括如下步骤：
步骤S1、提取待测样本DNA；
步骤S2、对步骤S1提取的待测样本DNA进行转化和纯化处理，得到DNA模板；
步骤S3、利用上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R对步骤S2转化和纯化处理得到的DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物；
步骤S4、利用测序引物TRIM29-cg-S对步骤S3扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。
在其中一些实施例中，步骤S1中，按照商品化基因组提取试剂盒(QIAGEN，69504)提取肿瘤组织及正常组织(或鼻、咽拭子等)的待测样本DNA。
在其中一些实施例中，步骤S2中转化和纯化处理前的待测样本DNA的浓度大于50ng/μL，待测样本DNA的样本总量大于1μg。
在其中一些实施例中，步骤S3中PCR扩增的反应体系如下：
扩增的反应程序为：95℃15s，56℃30s，72℃30s，50次循环；72℃，5min；4℃保持。
实施例1
本实施例提供了一种非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法。
一种非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法，包括如下步骤：
步骤S1、按照商品化基因组提取试剂盒(QIAGEN，69504)提取肿瘤组织，及正常组织(或鼻拭子、咽拭子等)的待测样本DNA。
步骤S2、对步骤S1提取的1μg待测样本DNA，用甲基化转化试剂盒EpiTectBisulfite Kit(QIAGEN，59104)进行转化和纯化处理。步骤S2具体包括如下：
S2.1、使用Nano Drop ND-2000分光光度计，确定待测样本DNA浓度，待测样本DNA的浓度大于50ng/μL，待测样本DNA的样本总量大于1μg。
S2.2、试剂准备：
试剂1：加380μL RNase-free H2O到carrier RNA管中，室温下震荡5min，得到carrier RNA溶液，按表1配制得到试剂1。
表1
试剂 体积(μL)
BufferBL 620
carrierRNA溶液 6.2
总体积 626.2
试剂2：在试剂1中加入800μL RNase-free H2O，得到试剂2。
试剂3：在Buffer BW中加入30mL 100％乙醇，得到试剂3。
试剂4：在Buffer BD中加入27mL 100％乙醇，得到试剂4。
S2.3、按照下述表2，在200μL PCR管中配制重亚硫酸盐转化反应试剂，混合均匀。
表2
S2.4、反应程序：变性99℃5min；孵育60℃25min；99℃5min；60℃85min；99℃5min；60℃175min；20℃，hold。
S2.5、纯化处理
2.5.1将含有上述反应混合液的200μLPCR管短暂离心后，转移到1.5mL离心管中，向1.5mL离心管加入560μL新鲜制备的试剂1，涡旋混匀。
2.5.2将2.5.1的1.5mL离心管中的全部混合物转移到EpiTect纯化柱中。
2.5.3以大于10,000g的转速对纯化离心1min，弃废液。
2.5.4向2.5.3的纯化柱中加500μL试剂3，离心1min，弃废液。
2.5.5向2.5.4的纯化柱中加500μL试剂4，室温放置15min，之后离心1min，弃废液。
2.5.6向2.5.5的纯化柱中加500μL试剂3，离心1min，弃废液；重复此步骤一次。
2.5.7将2.5.6的纯化柱放在一个新的2mL离心管中，离心1min，弃废液。
2.5.8将2.5.7得到的纯化柱放在一个新的1.5mL离心管中加20μL Buffer EB，15,000g离心1min洗脱DNA，得到亚硫酸氢盐处理的DNA模板。
步骤S3、利用上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R对步骤S2转化和纯化处理得到的待测样本DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；以及
PCR扩增的反应体系(40μL)如下：
扩增的反应程序为：95℃15s，56℃30s，72℃30s，50次循环；72℃，5min；4℃保持。
其中，Taq DAN polymerase(Hot Start)、dNTP均购自TakaRa，Taq DNA聚合酶(Takara Hot StartTaq)、dNTP货号分别为DR007、D4030。
步骤S4、利用测序引物TRIM29-cg-S对步骤S3扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序。具体地，取40μL PCR产物经纯化得到单链DNA，与40μL测序buffer混合(其中含0.5μM测序引物S)，经80℃变性2min后，采用PyroMark ID测序仪进行测序分析。测序分析结果如图2所示，图2为TRIM29基因DNA甲基化水平检测结果示例图，图2中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，图2示有CpG1到CpG6(从左至右)的甲基化程度分别为25％，27％，25％，24％，24％，20％。
实施例2
本实施例对来自于中山大学肿瘤防治中心的36例鼻咽癌患者鼻咽组织和14例正常患者鼻咽组织的TRIM29基因甲基化水平进行检测，其中，14例正常患者鼻咽组织的TRIM29基因甲基化水平作为对照组。本实施例对TRIM29基因甲基化水平检测采用实施例1所述的非疾病性的检测TRIM29基因甲基化方法。检测结果如图3所示，图3为鼻咽癌患者组织样本与对照组之间TRIM29基因甲基化差异图，图3中，36例鼻咽癌患者(NPC，鼻咽癌患者鼻咽组织)TRIM29基因甲基化程度显著低于对照组(Normal，正常患者鼻咽组织)，图3中纵坐标表示的是甲基化程度。
实施例3
本实施例对来自于中山大学肿瘤防治中心的13例鼻咽癌鼻咽拭子和13例正常患者鼻咽拭子的TRIM29基因甲基化水平进行检测，其中，13例正常患者鼻咽拭子的TRIM29基因甲基化水平作为对照组。检测结果如下表3和图4所示。
表3
样本编号 甲基化％ Type
Q-01 63 Normal
Q-02 75 Normal
Q-03 66 Normal
Q-04 62 Normal
Q-05 57 Normal
Q-06 55 Normal
Q-07 64 Normal
Q-08 69 Normal
Q-09 80 Normal
Q-10 39 Normal
Q-11 49 Normal
Q-12 51 Normal
Q-13 69 Normal
Q-14 17 Tumor
Q-15 35 Tumor
Q-16 64 Tumor
Q-17 57 Tumor
Q-18 24 Tumor
Q-19 10 Tumor
Q-20 64 Tumor
Q-21 41 Tumor
Q-22 25 Tumor
Q-23 32 Tumor
Q-24 42 Tumor
Q-25 41 Tumor
Q-26 42 Tumor
表3中，Normal表示正常患者鼻咽组织，Tumor表示鼻咽癌患者鼻咽组织，Q-01至Q-13表示的是13例正常患者(Normal，正常患者鼻咽组织)，Q-14至Q-26表示的是13例鼻咽癌患者(NPC，鼻咽癌患者鼻咽组织)。
实施例3中，图4为鼻咽癌患者鼻咽拭子样本与对照组之间TRIM29基因甲基化差异图，图4中，13例鼻咽癌患者的TRIM29基因甲基化程度显著低于对照组，图4中的纵坐标表示的是甲基化程度。
综上所述，本发明中，对于样本总体来说，鼻咽癌患者中TRIM29基因甲基化程度显著低于正常鼻咽上皮的甲基化程度。用于鼻咽癌的诊断时，AUC 0.861，最佳临界点(45％)时灵敏度76.92％，特异性92.31％，参见图5所示，图5为鼻咽癌患者鼻咽拭子中TRIM29基因甲基化的ROC曲线图，图5的纵坐标表示的是灵敏度，横坐标表示的是特异性，阳性预测值90.90％，阴性预测值80.0％。
与现有技术相比，上述TRIM29基因甲基化的检测引物组合物的有益效果在于：
(1)本发明公开了用于检测与鼻咽癌相关的TRIM29基因的第一外显子区域甲基化程度的检测引物组合物，TRIM29基因第一外显子区域DNA甲基化水平在鼻咽癌中显著降低。本发明发现了TRIM29基因甲基化位点可作为一种新的鼻咽癌肿瘤标志物，在鼻咽癌早期检测和诊断中有重要的价值。
(2)本发明可通过鼻拭子、咽拭子等检测高危易感人群、患者的TRIM29基因位点的甲基化程度，从而达到无创检测的目的。
(3)本发明所述的甲基化检测方法操作简便、适用范围广，且DNA甲基化修饰稳定，不容易降解，便于保存和运输，检测结果准确性高。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，其特征在于，包括上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R和测序引物TRIM29-cg-S，所述上游引物TRIM29-cg-F与所述下游引物TRIM29-cg-R能够扩增TRIM29基因，所述测序引物TRIM29-cg-S能够对TRIM29基因扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序，所述上游引物TRIM29-cg-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物TRIM29-cg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述测序引物TRIM29-cg-S的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的TRIM29基因甲基化的检测引物组合物，其特征在于，所述上游引物TRIM29-cg-F与所述下游引物TRIM29-cg-R能够扩增TRIM29基因的第一外显子区域。
3.权利要求1-2任意一项所述的TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在制备TRIM29甲基化检测工具中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述TRIM29甲基化检测工具为单独试剂或试剂盒。
5.一种TRIM29甲基化检测工具，其特征在于，包括权利要求1-2任意一项所述的TRIM29基因甲基化的检测引物组合物。
6.权利要求1-2任意一项所述的TRIM29基因甲基化的检测引物组合物在制备鼻咽癌检测工具中的应用。
7.一种非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、提取待测样本DNA；
步骤S2、对步骤S1提取的待测样本DNA进行转化和纯化处理，得到DNA模板；
步骤S3、利用上游引物TRIM29-cg-F、下游引物TRIM29-cg-R对步骤S2转化和纯化处理得到的DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，其中，所述上游引物TRIM29-cg-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物TRIM29-cg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤S4、利用测序引物TRIM29-cg-S对步骤S3扩增后的PCR产物进行焦磷酸测序，其中，所述测序引物TRIM29-cg-S的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求7所述的非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法，其特征在于，步骤S2中待测样本DNA的浓度大于50ng/μL，待测样本DNA的样本总量大于1μg。
9.根据权利要求7或8所述的非疾病诊断目的的TRIM29基因甲基化检测方法，其特征在于，步骤S3中PCR扩增的反应体系如下：
扩增的反应程序为：95℃15s，56℃30s，72℃30s，50次循环；72℃，5min；4℃保持。
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