CN116047066A - Sgk1作为靶点在制备诊断、预防、治疗冠状病毒所致疾病的产品中的应用 - Google Patents

Sgk1作为靶点在制备诊断、预防、治疗冠状病毒所致疾病的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SGK1作为靶点在制备诊断、预防、治疗冠状病毒所致疾病的产品中的应用；本发明提供了SGK1磷酸化作为SARS‑CoV‑2诱导的炎症的诊断标志物，还通过实验证明了SGK1抑制剂EMD638683可抑制SARS‑CoV‑2诱导的炎症反应，显著缓解小鼠肺部受损组织。还通过离体实验证明了SGK1的敲除可以显著阻断SARS‑CoV‑2诱导的炎症反应，从而提示了SGK1抑制剂均具有抗COVID‑19炎症的作用。SGK1抑制剂有望成为冠状病毒所致疾病提供候选药物，对治疗SARS‑CoV‑2冠状病毒及其它冠状病毒所致疾病具有重大应用价值。

Description

SGK1作为靶点在制备诊断、预防、治疗冠状病毒所致疾病的产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及SGK1作为靶点在制备诊断、预防、治疗冠状病毒所致疾病的产品中的应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引起新型冠状病毒感染(COVID-19)的病原体，属于β冠状病毒属。在人类冠状病毒中最接近的亲属是SARS-CoV，具有79％的遗传相似性。COVID-19症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。SARS-CoV-2感染的病理生理学与SARS-CoV感染的病理生理学非常相似，其侵袭性炎症反应导致了对气道的损害。因此，患者的疾病严重程度不仅取决于病毒感染，还取决于宿主的免疫反应。严重COVID-19中所报道的免疫系统响应病毒感染和继发感染大量释放细胞因子，可导致细胞因子风暴和败血症症状，这是导致致命COVID-19病例死亡的原因。在这些情况下，不受控制的炎症会造成多器官损伤，从而导致器官衰竭，尤其是心脏，肝脏和肾脏系统的器官衰竭。最终大多数进展为器官衰竭的SARS-CoV-2感染患者会死亡。
目前，针对SARS-CoV-2感染的治疗手段主要包括应用抗体药物与局部或整体糖皮质激素治疗。然而，抗体和糖皮质激素治疗所带来的安全性及健康问题不容忽视，例如抗体药物在中和病毒蛋白的同时也会加剧炎症反应，从而加重肺部的损伤。另一方面，糖皮质激素地塞米松治疗患者的病症会得到解决，但是部分的患者会在停药以后出现头晕或者是腹部疼痛等情况，容易出现低热以及恶心呕吐的情况。会因为停止服用地塞米松而导致并发症的出现。较大剂量易引起糖尿病、骨质疏松、消化道溃疡和类库欣综合征症状，对下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制作用较强。此外，激素疗法禁忌证包括高血压、血栓症、心肌梗塞、胃与十二指肠溃疡、内脏手术、精神病、电解质代谢异常、青光眼等。
因此，仍需寻找替代疗法。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供SGK1作为靶点在开发诊断和/或预防和/或治疗冠状病毒所致疾病中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供SGK1磷酸化作为标志物或检测SGK1磷酸化水平的物质在制备产品中的应用，所述产品的功能为(a1)～(a3)中的至少一种：
(a1)诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病；
(a2)诊断或辅助诊断冠状病毒感染；
(a3)诊断或辅助诊断冠状病毒炎症。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒包括：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
在本发明的一些实施方式中，还包括上述冠状病毒野生型和突变型，如SARS-CoV-2Delta突变株、SARS-CoV-2Alpha突变株、SARS-CoV-2Beta突变株、SARS-CoV-2Gamma突变株、SARS-CoV-2Omicron突变株等。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒所致疾病包括肺炎、单纯性感染、急性呼吸道疾病、重度急性呼吸道综合征、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、脓毒症、肠胃炎、败血症、肝炎、心肌炎、心力衰竭。
在本发明的一些实施方式中，所述肺炎包括轻症肺炎、重症肺炎。
在本发明的一些实施方式中，所述SARS-CoV-2引起的疾病为COVID-19。
在本发明的一些实施方式中，所述检测SGK1磷酸化水平的物质包括通过免疫印迹法、免疫组化法和免疫共沉淀法、酶联免疫吸附法、胶体金、质谱法、激酶活性法、细胞内流式细胞术等方法检测SGK1磷酸化水平的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。
本发明的第二方面，提供一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的检测SGK1磷酸化水平的物质以及至少一种其他可诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病和/或冠状病毒感染和/或冠状病毒炎症的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒包括：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
在本发明的一些实施方式中，还包括上述冠状病毒野生型和突变型，如SARS-CoV-2Delta突变株、SARS-CoV-2Alpha突变株、SARS-CoV-2Beta突变株、SARS-CoV-2Gamma突变株、SARS-CoV-2Omicron突变株等。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒所致疾病包括肺炎、单纯性感染、急性呼吸道疾病、重度急性呼吸道综合征、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、脓毒症、肠胃炎、败血症、肝炎、心肌炎、心力衰竭。
在本发明的一些实施方式中，所述肺炎包括轻症肺炎、重症肺炎。
在本发明的一些实施方式中，所述SARS-CoV-2引起的疾病为COVID-19。
在本发明的一些实施方式中，所述检测SGK1磷酸化水平的物质包括通过免疫印迹法、免疫组化法和免疫共沉淀法、酶联免疫吸附法、胶体金、质谱法、激酶活性法、细胞内流式细胞术等方法检测SGK1磷酸化水平的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述其他可诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病和/或冠状病毒感染和/或冠状病毒炎症的试剂包括：通过胶体金法、荧光免疫层析法、酶联免疫法、化学发光法、基因测序、核酸质谱分析、RNA捕获探针法、恒温扩增法、荧光定量PCR等方法诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病和/或冠状病毒感染和/或冠状病毒炎症的试剂；还包括通过检测已公开可用于诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病和/或冠状病毒感染和/或冠状病毒炎症的生物标志物的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
本发明的第三方面，提供SGK1抑制剂在(b1)～(b4)任一项中的应用：
(b1)制备预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的产品；
(b2)制备预防和/或治疗冠状病毒感染的产品；
(b3)制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的产品；
(b4)制备冠状病毒抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒包括：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
在本发明的一些实施方式中，还包括上述冠状病毒野生型和突变型，如SARS-CoV-2Delta突变株、SARS-CoV-2Alpha突变株、SARS-CoV-2Beta突变株、SARS-CoV-2Gamma突变株、SARS-CoV-2Omicron突变株等。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒所致疾病包括肺炎、单纯性感染、急性呼吸道疾病、重度急性呼吸道综合征、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、脓毒症、肠胃炎、败血症、肝炎、心肌炎、心力衰竭。
在本发明的一些实施方式中，所述肺炎包括轻症肺炎、重症肺炎。
在本发明的一些实施方式中，所述SARS-CoV-2引起的疾病为COVID-19。
在本发明的一些实施方式中，所述SGK1抑制剂包括(c1)～(c6)中的至少一种：
(c1)抑制SGK1活性的物质；
(c2)降低SGK1含量的物质；
(c3)沉默SGK1基因的物质；
(c4)敲除SGK1基因的物质；
(c5)抑制SGK1基因表达的物质；
(c6)抑制SGK1磷酸化的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述SGK1抑制剂包括：小分子化合物、肽、肽模拟物、基质类似物、适配体、抗体、dsRNA、shRNA、microRNA、siRNA、sgRNA中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述化合物为EMD638683或其药学上可接受的盐。
在本发明的一些实施方式中，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1所述或与该序列同源性在90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列：
5′-GCACATTGCAGGTACGAAGG-3′(SEQ ID NO.1)。
通过sgRNA配合CRRSPR/Cas9使用达到基因敲除的目的。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、口服剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、雾化给药或经皮给药中的至少一种。
本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品中包括SGK1抑制剂，所述SGK1抑制剂包括(c1)～(c6)中的至少一种：
(c1)抑制SGK1活性的物质；
(c2)降低SGK1含量的物质；
(c3)沉默SGK1基因的物质；
(c4)敲除SGK1基因的物质；
(c5)抑制SGK1基因表达的物质；
(c6)抑制SGK1磷酸化的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述产品的功能为(d1)～(d4)中的至少一种：
(d1)预防和/或治疗冠状病毒所致疾病；
(d2)预防和/或治疗冠状病毒感染；
(d3)预防和/或治疗冠状病毒炎症；
(d4)抑制冠状病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒包括：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
在本发明的一些实施方式中，还包括上述冠状病毒野生型和突变型，如SARS-CoV-2Delta突变株、SARS-CoV-2Alpha突变株、SARS-CoV-2Beta突变株、SARS-CoV-2Gamma突变株、SARS-CoV-2Omicron突变株等。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒所致疾病包括肺炎、单纯性感染、急性呼吸道疾病、重度急性呼吸道综合征、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、脓毒症、肠胃炎、败血症、肝炎、心肌炎、心力衰竭。
在本发明的一些实施方式中，所述肺炎包括轻症肺炎、重症肺炎。
在本发明的一些实施方式中，所述SARS-CoV-2引起的疾病为COVID-19。
在本发明的一些实施方式中，所述SGK1抑制剂包括：化合物、肽、肽模拟物、基质类似物、适配体、抗体、dsRNA、shRNA、microRNA、siRNA、sgRNA中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述化合物为EMD638683或其药学上可接受的盐。
在本发明的一些实施方式中，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1所述或与该序列同源性在90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列：
5′-GCACATTGCAGGTACGAAGG-3′(SEQ ID NO.1)。
通过sgRNA配合CRRSPR/Cas9使用达到基因敲除的目的。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包括至少一种其他可用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病和/或预防和/或治疗冠状病毒感染和/或预防和/或治疗冠状病毒炎症和/或抑制冠状病毒的成分。
在本发明的一些实施方式中，所述其他可用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病和/或预防和/或治疗冠状病毒感染和/或预防和/或治疗冠状病毒炎症和/或抑制冠状病毒的成分包括但不局限于：干扰素、奥司他韦及其盐、洛匹那韦、利托那韦、法匹拉韦、利巴韦林、瑞德西韦、氯喹及其盐、羟基氯喹及其盐、阿比多尔及其盐、白介素抑制剂、肿瘤坏死因子抑制剂、两面神激酶抑制剂、糖皮质激素、蛋白酶抑制剂、肠道微生态调节剂中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物。
在本发明的一些实施方式中，所述SGK1抑制剂和其他可用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病和/或预防和/或治疗冠状病毒感染和/或预防和/或治疗冠状病毒炎症和/或抑制冠状病毒的成分可以通过各种方式进行组合。在一些实例中，可以分别存在于不同药品中，以组合包装或联合用药的方式进行给予。在另一些实例中，可以共同存在于同一药品中，以复方药物方式进行给予。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、口服剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、雾化给药或经皮给药中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明通过细胞和动物模型实验发现对BEAS-2B细胞或小鼠施加SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激或进行SARS-CoV-2活病毒感染可引起SGK1磷酸化增强，证明了SGK1磷酸化增强是冠状病毒(如SARS-CoV-2)诱导炎症的标志物；可通过检测SGK1磷酸化水平对冠状病毒(如SARS-CoV-2)诱导炎症进行诊断或辅助诊断，有助于提高COVID-19诊断的准确性。
还通过检测模型小鼠肺部炎症信号通路的活化、肺部炎症因子的表达水平，以及病理切片等方式，证明了SGK1抑制剂EMD638683通过抑制SGK1磷酸化可抑制冠状病毒(如SARS-CoV-2)诱导的炎症反应，显著缓解小鼠肺部受损组织。还通过离体实验证明了SGK1的敲除可以显著阻断冠状病毒(如SARS-CoV-2)诱导的炎症反应，从而提示了SGK1抑制剂均具有抗COVID-19炎症的作用。SGK1抑制剂有望成为冠状病毒所致疾病提供候选药物，对治疗SARS-CoV-2冠状病毒及其它冠状病毒所致疾病具有重大应用价值。
附图说明
图1为对BEAS-2B细胞施加SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激可引起SGK1磷酸化。其中图1A为免疫印迹结果，图1B为图1A的统计图。
图2为气管内滴注SARS-CoV-2核衣壳蛋白可导致小鼠肺组织SGK1磷酸化增强。其中图2A为免疫印迹结果，图2B为图2A的统计图。
图3为鼻腔滴注SARS-CoV-2活病毒攻毒可导致小鼠肺组织SGK1磷酸化增强。其中图3A为染色结果，图3B为图3A的荧光亮度统计图(p-SGK1)。
图4为SGK1抑制剂EMD638683可显著抑制SARS-CoV-2N蛋白刺激所诱导的小鼠肺部经典炎症信号通路NF-κB的激活。其中图4A为免疫印迹结果，图4B为图4A的统计图。
图5为SGK1抑制剂EMD638683可显著抑制SARS-CoV-2N蛋白刺激所引起的小鼠肺部炎症因子表达水平上调。
图6为SGK1抑制剂EMD638683可显著缓解小鼠肺组织炎症细胞浸润情况。
图7为SGK1抑制剂EMD638683可显著抑制SARS-CoV-2N蛋白刺激所引起的BEAS-2B细胞炎症因子表达水平上调。
图8为对细胞SGK1进行敲除可显著抑制SARS-CoV-2N蛋白刺激所引起的BEAS-2B细胞炎症因子表达水平上调。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实验材料和方法
实验动物：SPF级ICR小鼠，雄性，6-8周，20～25g购自中山大学动物实验中心；SPF级BALB/c小鼠，雄性，6-8周，20～25g购自湖南SJA动物实验中心。
细胞：人气道上皮细胞株BEAS-2B，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。
重组SARS-CoV-2核衣壳蛋白，购自Novoprotein。
BCA蛋白检测试剂购自北京康为世纪公司、anti-SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体购自美国CST公司、anti-phospho-SGK1抗体购自美国Millipore公司、anti-SGK1抗体购自英国Abcam公司、anti-phospho-IκBα抗体购自美国CST公司、anti-IκBα抗体购自美国CST公司、anti-phospho-NF-κB p65抗体购自美国CST公司、anti-NF-κB p65抗体购自美国CST公司、anti-GAPDH抗体购自美国CST公司、二抗购自美国Earthox公司、ECL化学发光显色液购自上海天能公司、SteadyPure通用RNA提取试剂盒购自湖南艾科瑞公司、EVO M-MLV RT试剂盒购自湖南艾科瑞公司、SYBR Green试剂盒购自湖南艾科瑞公司、LightCycler 480仪器购自瑞士Roche公司。
蛋白质免疫印迹：小鼠肺组织在组织裂解液中均质，BEAS-2B细胞在细胞裂解液中裂解，完成后以4℃，13000g离心30min，将上清液轻轻转移至新的EP管中，-80℃保存。使用前，首先用BCA蛋白检测试剂对组织内总蛋白进行定量，随后在100℃水中煮8min。离心取上清，在每孔中加入40μg蛋白样品，进行电泳。电泳完毕后，将蛋白转移至PVDF膜上。使用5％脱脂奶粉室温封闭1h，TBST洗去奶粉后，将PVDF膜与一抗4℃孵育过夜。其中一抗包括anti-SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体、anti-phospho-SGK1抗体、anti-SGK1抗体、anti-phospho-IκBα抗体、anti-IκBα抗体、anti-phospho-NF-κB p65抗体、anti-NF-κB p65抗体、anti-GAPDH抗体。次日，使用TBST缓冲液清洗3次，每次10min，然后室温孵育二抗40min。最后，TBST缓冲液每次10min，清洗3次后，滴加ECL化学发光显色液显色。
荧光定量PCR：使用SteadyPure通用RNA提取试剂盒提取RNA。采用EVO M-MLV RT试剂盒进行反转录，并使用SYBR Green试剂盒，在LightCycler 480仪器上进行qPCR检测。95℃PCR 30s，95℃5s，58℃15s，72℃20s，共50个循环。使用2-ΔΔCt方法对相对mRNA变化进行校正和归一化。qPCR所使用的引物序列如表1所示。
表1引物序列
苏木素-伊红染色：将灌流处死小鼠的肺组织立即转移到4％多聚甲醛(pH＝7.4)中，并在4℃条件下固定4h。然后，将组织转移至30％蔗糖溶液(v/v)中4℃条件下脱水过夜。最后，使用冰冻切片机切片于-80℃中保存。在进行苏木素-伊红染色(HE)前先将冷冻切片取出回温，置于37℃孵育箱中2h。之后将回温好的切片，水中浸泡30-60秒左右。接着用蒸馏水润湿组织1-2min，甩掉水分，确保蒸馏水润湿整个组织，并均匀分布。再使用苏木素核染染液，染色5min左右，水洗3-5s。伊红浆染液染色2min，再水洗1-2min，滤纸吸干或自然晾干。乙醇梯度脱水，盖上树胶封片镜检。
数据处理：实验数据由平均值±标准差(mean±SD)的方式呈现。对于两组数据，采用T检验分析。对于三组或以上数据，采用单因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)并使用Dunnett法进行事后检验。设置P<0.05为显著性差异，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；ns表示无显着差异。
实施例1 SARS-CoV-2诱导炎症的标志
1、细胞及模型制作方法
造模开始前，BEAS-2B细胞先进行血清饥饿处理12h，随后加入SARS-CoV-2核衣壳蛋白使其工作浓度达到50μg/ml，处理12h或24h。实验共分为3组，分别为对照组(Control)、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理12h组(N(12h))、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理24h组(N(24h))，可以看出对BEAS-2B细胞施加SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激会引起多种炎症因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8)表达水平上调(图7)，说明细胞模型中产生了炎症，造模成功。
2、实验动物及模型制作方法
SPF级ICR小鼠腹腔注射三溴乙醇麻醉，随后气管内滴注SARS-CoV-2核衣壳蛋白(0.25mg/kg)。24h后完成造模，处死小鼠并完成后续实验。实验共分为2组，分别为对照组(Control)、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理组(N)，可以看出对在小鼠气管内滴注SARS-CoV-2核衣壳蛋白会引起多种炎症因子(包括IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α)表达水平显著上调(图5)，说明动物模型中产生了炎症，造模成功。
SPF级BALB/c小鼠麻醉后，使用Ad5-ACE2(总量2.5×108FFU，75μl)进行滴鼻处理。转染5天后，使用SARS-CoV-2(总量1×105PFU，50μl)进行攻毒。4天后完成造模，处死小鼠并完成后续实验。实验共分为2组，分别为对照组(Control)、SARS-CoV-2攻毒组(SARS-CoV-2)。
3、通过蛋白印迹检测发现，对BEAS-2B细胞施加SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激，可引起SGK1磷酸化增强，而不改变SGK1总蛋白水平(图1A)。定量分析结果显示，SGK1磷酸化在所有SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激组样本中显著增强，而在未刺激的对照组中几乎未检测到SGK1磷酸化，两组间定量分析差异接近2倍，具有统计学意义(图1B，n＝3)。
进一步在动物模型中进行验证：气管内滴注SARS-CoV-2核衣壳蛋白可导致小鼠肺组织SGK1磷酸化增强，而不改变SGK1总蛋白水平(图2A)，定量分析结果显示，SGK1磷酸化在所有SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激组样本中显著增强，而在未刺激的对照组中几乎未检测到SGK1磷酸化，两组间定量分析差异接近2倍，具有统计学意义(图2B，n＝3)。
最后，在SARS-CoV-2活病毒攻毒的小鼠中进行再次验证：SARS-CoV-2活病毒攻毒确可导致小鼠肺组织SGK1磷酸化显著增强(图3A)。定量分析结果显示，SGK1磷酸化在所有SARS-CoV-2活病毒攻毒组样本中显著增强，而在未刺激的对照组中几乎未检测到SGK1磷酸化，两组间定量分析差异达到约15倍，具有统计学意义(图3B，n＝3)。以上结果共同说明SGK1磷酸化增强是SARS-CoV-2诱导炎症的标志之一，在鉴定该疾病中可能是有用且具有前景的候选物。
实施例2 SGK1抑制剂EMD638683的在体抗炎实验
1、模型制作方法
SPF级ICR小鼠腹腔注射三溴乙醇麻醉，随后气管内滴注SARS-CoV-2核衣壳蛋白(0.25mg/kg)。24h后完成造模，处死小鼠并完成后续实验。EMD638383处理组小鼠于造模开始前1h腹腔注射EMD638683(10mg/kg)。实验共分为3组，分别为对照组(Control)、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理组(N protein)、SARS-CoV-2核衣壳蛋白合并EMD638683处理组(Nprotein+EMD638683)。
在体实验结果显示，对小鼠腹腔给予SGK1抑制剂EMD638683处理，可显著抑制SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激所诱导的经典炎症信号通路NF-κB的激活，其中包括针对IκB磷酸化增强的抑制以及针对NF-κB p65亚基磷酸化增强的抑制。灰度分析显示，抑制效果差异具有统计学意义(图4，n＝3)。另一方面，小鼠腹腔给予SGK1抑制剂EMD638683处理，可显著抑制SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激所引起的小鼠肺部炎症因子(包括IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α)表达水平上调，且可使其恢复至接近正常水平，差异具有统计学意义(图5，n＝3)。此外，小鼠腹腔给予SGK1抑制剂EMD638683处理还可以降低小鼠肺部炎症、显著缓解小鼠肺组织炎症细胞浸润情况，有助于修复受损组织(图6)。
实施例3 SGK1抑制或敲除的离体抗炎实验
1、SGK1抑制离体抗炎实验
1.1、BEAS-2B细胞先进行血清饥饿处理12h，随后，加入SARS-CoV-2核衣壳蛋白使其终浓度达到50μg/ml，处理12h或24h。EMD638383处理组细胞于造模开始前1h加入EMD638683(50μM)。实验共分为6组，分别为对照组、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理12h组、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理24h组、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理12h合并EMD638683处理组、SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理24h合并EMD638683处理组、EMD638683处理组。
结果显示，对气道上皮细胞给予SGK1抑制剂EMD638683，可显著抑制SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激所引起的多种炎症因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8)表达水平上调，且可使其恢复至接近正常水平，差异具有统计学意义(图7，n＝3)，说明SGK1抑制剂EMD638683可以起到抗COVID-19炎症反应的效果。
2、SGK1敲除的离体抗炎实验
2.1、SGK1基因敲除的细胞构建基于PXC9-puro质粒，其中含有靶向SGK1的sgRNA(序列为5′-GCACATTGCAGGTACGAAGG-3′(SEQ ID NO.1))或无序的对照gRNA(序列为5′-GTAGAGAGCGGCGCGCCTAC-3′(SEQ ID NO.2))。
2.2、敲除后的细胞先进行血清饥饿处理12h，随后，加入SARS-CoV-2核衣壳蛋白使其终浓度达到50μg/ml，处理12h或24h完成造模。实验共分为6组，分别为空载体细胞对照组、空载体细胞SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理12h组、空载体细胞SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理24h组、SGK1敲除细胞对照组、SGK1敲除细胞SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理12h组、SGK1敲除细胞SARS-CoV-2核衣壳蛋白处理24h组。
离体实验结果显示，对气道上皮细胞SGK1进行敲除，可显著抑制SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激所引起的多种炎症因子(包括IL-1β、IL-6、IL-8)表达水平上调。其中空载体细胞中，SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激12h或24h均可导致炎症因子表达上调，而在SGK1敲除细胞中，SARS-CoV-2核衣壳蛋白刺激12h或24h对细胞炎症因子表达无明显影响(图8，n＝3)，进一步证明了敲除SGK1可以起到抗COVID-19炎症反应的效果。
综上，SGK1可作为诊断、预防、治疗冠状病毒所致疾病的靶点，有利于冠状病毒所致疾病的诊断或治疗。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (15)

1.SGK1磷酸化作为标志物或检测SGK1磷酸化水平的物质在制备产品中的应用，所述产品的功能为(a1)～(a3)中的至少一种：
(a1)诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病；
(a2)诊断或辅助诊断冠状病毒感染；
(a3)诊断或辅助诊断冠状病毒炎症。
2.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的检测SGK1磷酸化水平的物质以及至少一种其他可用于诊断或辅助诊断冠状病毒所致疾病和/或冠状病毒感染和/或冠状病毒炎症的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的产品，其特征在于，所述冠状病毒包括：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
4.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的产品，其特征在于，所述冠状病毒所致疾病包括：肺炎、单纯性感染、急性呼吸道疾病、重度急性呼吸道综合征、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、脓毒症、肠胃炎、败血症、肝炎、心肌炎、心力衰竭。
5.根据权利要求1所述的应用或权利要求2-4任一项所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。
6.SGK1抑制剂在(b1)～(b4)至少一种中的应用：
(b1)制备预防和/或治疗冠状病毒所致疾病的产品；
(b2)制备预防和/或治疗冠状病毒感染的产品；
(b3)制备预防和/或治疗冠状病毒炎症的产品；
(b4)制备冠状病毒抑制剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括：SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒所致疾病包括：肺炎、单纯性感染、急性呼吸道疾病、重度急性呼吸道综合征、急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、脓毒症、肠胃炎、败血症、肝炎、心肌炎、心力衰竭。
9.根据权利要求6～8任一项所述的应用，其特征在于，所述SGK1抑制剂包括(c1)～(c6)中的至少一种：
(c1)抑制SGK1活性的物质；
(c2)降低SGK1含量的物质；
(c3)沉默SGK1基因的物质；
(c4)敲除SGK1基因的物质；
(c5)抑制SGK1基因表达的物质；
(c6)抑制SGK1磷酸化的物质。
10.一种产品，其特征在于，所述产品中包括SGK1抑制剂；所述SGK1抑制剂包括(c1)～(c6)中的至少一种：
(c1)抑制SGK1活性的物质；
(c2)降低SGK1含量的物质；
(c3)沉默SGK1基因的物质；
(c4)敲除SGK1基因的物质；
(c5)抑制SGK1基因表达的物质；
(c6)抑制SGK1磷酸化的物质。
11.根据权利要求9所述的应用或权利要求10所述的产品，其特征在于，所述SGK1抑制剂包括：小分子化合物、肽、肽模拟物、基质类似物、适配体、抗体、dsRNA、shRNA、microRNA、siRNA、sgRNA中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的应用或产品，其特征在于，所述化合物包括EMD638683或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求11所述的应用或产品，其特征在于，所述sgRNA的序列包括：5′-GCACATTGCAGGTACGAAGG-3′。
14.根据权利要求10所述的产品，其特征在于，所述产品中还包括至少一种其他可用于预防和/或治疗冠状病毒所致疾病和/或预防和/或治疗冠状病毒感染和/或预防和/或治疗冠状病毒炎症和/或抑制冠状病毒的成分。
15.根据权利要求6～9任一项所述的应用或权利要求10～14任一项所述的产品，其特征在于，所述产品为药物。
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