CN114984220B - Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用 - Google Patents

Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114984220B
CN114984220B CN202210548159.1A CN202210548159A CN114984220B CN 114984220 B CN114984220 B CN 114984220B CN 202210548159 A CN202210548159 A CN 202210548159A CN 114984220 B CN114984220 B CN 114984220B
Authority
CN
China
Prior art keywords
liver failure
acute liver
mas
preventing
mas receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210548159.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114984220A (zh
Inventor
李婧
杨长青
杨博
贾昊宇
陈帅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Tongji Hospital
Original Assignee
Shanghai Tongji Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Tongji Hospital filed Critical Shanghai Tongji Hospital
Priority to CN202210548159.1A priority Critical patent/CN114984220B/zh
Publication of CN114984220A publication Critical patent/CN114984220A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114984220B publication Critical patent/CN114984220B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用，该药物包括Mas受体抑制剂。本发明通过在LPS/D‑GalN诱导的小鼠急性肝衰竭模型上阐明阻断Mas受体对肝细胞的保护作用及潜在分子机制，证实阻断Mas受体可应用于预防及治疗LPS/D‑GalN诱导的急性肝衰竭，有望为制备和筛选预防和治疗急性肝衰竭的药物提供基础。

Description

Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用。
背景技术
急性肝衰竭(ALF)病死率高，高达30％，近年来，ALF发病率不断攀升，在全球范围内该疾病负担较重，其年发生率从每百万人1例升至每百万人2000-3000例，但具体机制不明，且治疗措施仍有大片空白。目前虽然有少数药物可应用于治疗ALF，但疗效有限，亟需加强基础机制研究及药物创新，有助于进一步推动我国ALF防治。
在发展中国家，乙型肝炎是ALF的主要原因，而在西方国家，对乙酰氨基酚引起的药物性肝损伤是主要原因。目前国内外学者多应用D-氨基半乳糖胺(D-GalN)造成原发性肝损伤，结合腹腔内注射脂多糖(LPS)模拟肠源性内毒素血症建立肝衰竭模型，其与HBV所致肝功能衰竭有较高的临床相关性，是目前比较公认的ALF动物模型之一。LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，D-GalN能加强LPS的急性毒性，而LPS能刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)，TNF-α在LPS/D-GalN诱导的小鼠肝炎的早期阶段能诱导肝细胞凋亡。
本发明采用LPS/D-GalN诱导的小鼠ALF模型开发更有效的，可同时预防及治疗ALF的药物干预新靶点。
发明内容
为了克服现有技术的空白，本发明为Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用提供了可能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用，该药物包括Mas受体抑制剂。
进一步地，上述Mas受体抑制剂选自下组：靶向Mas受体蛋白的抗体或小分子抑制剂、Mas基因靶向核酸分子或基因编辑器、或其组合。
本发明的第二方面是提供一种预防和治疗急性肝衰竭的组合物，包括：
(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；
(b)gRNA或其表达载体，其中该gRNA是引导上述基因编辑蛋白特异性结合Mas基因的RNA；和
(c)其他预防和/或治疗急性肝衰竭的药物活性成分。
进一步地，上述组合物的剂型为注射剂型。
本发明的第三方面是提供上述组合物在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用。
本发明的第四方面是提供A-779在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用，该药物的有效活性成分包括A-779。
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋型剂。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明通过在LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝衰竭模型上阐明阻断Mas受体对肝细胞的保护作用及潜在分子机制，证实阻断Mas受体可应用于预防及治疗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭，有望为制备和筛选预防和治疗急性肝衰竭的药物提供基础。
附图说明
图1显示了Mas基因全身敲除可显著减轻LPS/D-GalN诱导的ALF；其中，图A显示了肝脏组织的电镜图、HE染色结果和MPO染色结果；图B显示了血清中ALT和SOD的活性的检测结果以及肝组织的坏死面积；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001；
图2显示了Mas敲除后通过抑制自噬信号通路减轻LPS/D-GalN诱导的小鼠ALF；其中，图A显示了肝脏组织中Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、LAMP1、LC3B、p62、p-ERK、p-JNK的蛋白表达水平；图B显示了Mas敲除小鼠造模前后自噬信号通路mRNA表达水平的变化；
图3显示了Mas敲除后通过下调TLR4信号通路减轻LPS/D-GalN诱导的小鼠ALF；其中，图A显示了基因功能富集分析结果；图B显示了IL-6、IL-1b、TNF-a、Mcp1、Tlr4、Myd88、Traf6的表达水平；图C显示了Mas敲除小鼠造模前后TLR4信号通路mRNA表达水平的变化；
图4显示了给予Mas受体抑制剂A-779可显著减轻LPS/D-GalN诱导的ALF；其中，图A显示了野生型ALF小鼠和给予Mas受体抑制剂的ALF小鼠的肝脏组织的电镜图、HE染色结果和MPO染色结果；图B显示了血清中ALT的检测结果以及肝组织的坏死面积；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001；
图5通过Western Blot(图A)及qPCR结果(图B)显示了Mas受体抑制剂A-779可显著减轻LPS/D-GalN诱导的ALF；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
具体实施方式
本发明提供了Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例通过体内研究评估Mas受体对ALF进程的调控作用，具体的实验分组、方法和结果如下：
a.转基因小鼠、疾病模型及实验分组：①转基因小鼠为购买的Mas基因全身敲除小鼠，Mas基因敲除小鼠及WT小鼠的基因背景均为C57BL/6。②疾病模型：腹腔注射LPS及D-GalN诱导小鼠ALF模型，腹腔注射等量PBS作为对照组。③药物治疗组：在给予WT小鼠LPS及D-GalN半小时后腹腔注射A-779(血管紧张素-(1-7))，对照组的WT小鼠腹腔注射等量PBS。
b.实验方法
(1)基因敲除鼠的构建及疾病模型
南京大学动物模式中心完全具备构建转基因小鼠的技术，可利用CRISPR/Cas9基因编辑技术顺利实现特异性的Mas基因敲除，货号为：KOAI180417LY1+KOAI180919LY3，目前已形成了成熟的商业化平台，保证了以下实验的顺利开展。采用CRISPR/Cas9技术，设计sgRNA，通过应用高通量电转受精卵方式，获得Mas基因敲除(Mas KO)小鼠，性成熟后取精子冻存基因。Mas基因(NCBI参考序列：NM_008552)位于小鼠17号染色体上。鉴定出9个外显子，ATG起始密码子位于第9外显子，TGA终止密码子位于第9外显子(转录本：ENSMUST00000089015)，将选择第9号外显子作为目标位点。Cas9和gRNA将被共注射到受精卵中，用于KO小鼠的生产。
基因鉴定的引物序列为：
正向引物(F1)：5’-TCACCCCTCAGCTGTCTCTTTCATTTC-3’(SEQ ID NO.1)；反向引物(R1)：5’-TCACATTTGGGATACTTCCTGCTAGAGC-3’(SEQ ID NO.2)。
小鼠急性肝衰竭模型的造模方法为腹腔注射LPS 25μg/kg+D-galN 250mg/kg，给药后5h收样。
(2)免疫组化及免疫荧光技术
获得小鼠肝脏样本后，进行石蜡包埋和福尔马林固定，随后进行苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin，HE)及MPO染色，用以评估肝损伤程度以及中性粒细胞浸润情况。在免疫荧光方面，冰冻肝组织切片与Ly6G抗体共同孵育，检测中性粒细胞浸润情况。
(3)ELISA
采集小鼠血清样本，血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)活性使用商业试剂盒(南京建成，中国)根据说明进行测定。
(4)Western Blot
获得小鼠肝脏组织后，用高强度RIPA裂解液提取总蛋白，按照BCA法进行定量。加入PhosSTOP检测磷酸化蛋白，用以下一抗进行蛋白质评估：Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)、LC3B、p62、p-ERK、p-JNK，使用抗GAPDH抗体作为内参对蛋白水平进行归一化处理。
(5)实时荧光定量PCR(qPCR)分析
用Trizol提取肝组织总RNA。逆转录和qPCR反应采用Prime-Script RT和SYBRRT-PCR试剂盒。根据ΔΔCt法计算mRNA的量，用GAPDH作为内参归一化。采用qPCR方法检测炎症因子(IL-6、IL-1b、TNF-a、Mcp1)及TLR4信号通路相关基因(Tlr4、Myd88、Traf6)的表达。
(6)转录组测序技术
获得小鼠肝脏组织后，用TRIzol试剂提取总RNA，并用NanoDrop 2000分光光度计进行纯度和定量评估，而后在Illumina HiSeq X Ten平台上构建数据文库和进行后续的测序分析。使用Cufflinks计算每个基因的FPKM，通过HTSeq-count计算每个基因的读计数。采用DESeq R软件包进行差异表达分析，并对差异表达基因(DEGs)进行层次聚类分析，包括GOterms和KEGG pathways富集分析等。
c.结果
1.相同基线的急性肝衰竭造模情况下，Mas基因敲除小鼠的肝损伤程度比野生型小鼠显著减轻，中性粒细胞浸润减少(图1A)，ALT降低且SOD明显升高(图1B)。
2.相同基线的急性肝衰竭造模情况下，Western Blotting及转录组测序结果提示与WT小鼠相比，Mas KO小鼠的凋亡减少(图2A)、自噬水平下调(图2A-B)。
3.转录组测序及qPCR结果提示，相同基线的急性肝衰竭造模情况下，与WT小鼠相比，Mas KO小鼠的TLR4信号通路下调(图3A-C)、炎症明显减轻(图3A-B)。
4.相同基线的急性肝衰竭造模情况下，给予Mas受体抑制剂A-779后WT小鼠的肝损伤程度比野生型小鼠显著减轻，中性粒细胞浸润减少(图4A)，ALT降低(图4B)。
5.Western Blot及qPCR结果提示，相同基线的急性肝衰竭造模情况下，给予Mas受体抑制剂A-779后WT小鼠的凋亡和自噬通量减少(图5A)、炎症明显减轻(图5B)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海市同济医院
<120> Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 1
tcacccctca gctgtctctt tcatttc 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<400> 2
tcacatttgg gatacttcct gctagagc 28

Claims (3)

1.Mas基因敲除的试剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用，其特征在于，所述试剂包括：
(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白为Cas9；和
(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA是引导所述基因编辑蛋白特异性结合Mas基因的RNA。
2.A-779在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用，其特征在于，所述药物的有效活性成分为A-779。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋型剂。
CN202210548159.1A 2022-05-12 2022-05-12 Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用 Active CN114984220B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210548159.1A CN114984220B (zh) 2022-05-12 2022-05-12 Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210548159.1A CN114984220B (zh) 2022-05-12 2022-05-12 Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114984220A CN114984220A (zh) 2022-09-02
CN114984220B true CN114984220B (zh) 2023-06-02

Family

ID=83026530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210548159.1A Active CN114984220B (zh) 2022-05-12 2022-05-12 Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114984220B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002238584A (ja) * 2000-03-17 2002-08-27 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｍａｓレセプター類似蛋白質およびそのＤＮＡ
CN104105691A (zh) * 2011-11-08 2014-10-15 艾尼纳制药公司 G蛋白偶联mas受体调节剂及对与其相关的病症的治疗

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080200491A1 (en) * 2005-06-22 2008-08-21 Thuy-Anh Tran 1,2-Dihydro-Spiro[3H-Indole-3,4'-Piperidine] Compounds, as Modulators of the Mas Receptor Novel

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002238584A (ja) * 2000-03-17 2002-08-27 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｍａｓレセプター類似蛋白質およびそのＤＮＡ
CN104105691A (zh) * 2011-11-08 2014-10-15 艾尼纳制药公司 G蛋白偶联mas受体调节剂及对与其相关的病症的治疗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mas 受体在内毒素血症急性肝损伤大鼠 肝组织中动态表达的研究;齐海宇等;《临床和实验医学杂志》;第16卷(第13期);第1249-1251页 *
The role of renin-angiotensin system modulation on treatment and prevention of liver diseases;Simone Moreira de Macêdo等;《Peptides》;第62卷;第189-196页 *
Therapeutic Targets in Liver Transplantation: Angiotensin II in Nonsteatotic Grafts and Angiotensin-(1–7) in Steatotic Grafts;Alfany-Fernandez等;《American Journal of Transplantation》;第9卷;第439-451页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114984220A (zh) 2022-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Macrophage polarization in innate immune responses contributing to pathogenesis of chronic kidney disease
Li et al. Inhibition of ACSS2-mediated H3K9 crotonylation alleviates kidney fibrosis via IL-1β-dependent macrophage activation and tubular cell senescence
Qu et al. The selective NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 alleviates cholestatic liver injury and fibrosis in mice
Landau et al. Regulated necrosis and failed repair in cisplatin-induced chronic kidney disease
Wang et al. circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA network in oxidized, low-density, lipoprotein-induced foam cells
Yang et al. Fibroblast activation protein activates macrophages and promotes parenchymal liver inflammation and fibrosis
CN112274523A (zh) 一种治疗脂肪肝的药物和治疗方法
Fazio et al. Activating transcription factor 3 promotes loss of the acinar cell phenotype in response to cerulein-induced pancreatitis in mice
Niimi et al. Minocycline suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis by increasing tissue inhibitors of metalloproteinases
Wang et al. Paeoniflorin and hydroxysafflor yellow A in Xuebijing injection attenuate sepsis-induced cardiac dysfunction and inhibit proinflammatory cytokine production
US20210161997A1 (en) Treating diseases via targeted modulation of gene signaling networks
CN111562394B (zh) 热休克因子2结合蛋白在肝脏缺血再灌注损伤、药物性肝损伤中的应用
CN107158390A (zh) 组蛋白去乙酰化酶hdac6的抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的用途
Qiu et al. BTK promotes atherosclerosis by regulating oxidative stress, mitochondrial injury, and ER stress of macrophages
Zhang et al. Glycine-Histidine-Lysine (GHK) alleviates astrocytes injury of intracerebral hemorrhage via the Akt/miR-146a-3p/AQP4 pathway
Hu et al. Long non-coding RNAs in the pathogenesis of diabetic kidney disease
Chen et al. m6A methylation-induced NR1D1 ablation disrupts the HSC circadian clock and promotes hepatic fibrosis
Liu et al. Integrative analysis of RNA expression and regulatory networks in mice liver infected by Echinococcus multilocularis
Jiang et al. Mettl3-mediated m6A modification of Fgf16 restricts cardiomyocyte proliferation during heart regeneration
CN114984220B (zh) Mas受体抑制剂在制备预防和治疗急性肝衰竭药物中的应用
Kim et al. A new murine liver fibrosis model induced by polyhexamethylene guanidine-phosphate
Hu et al. Exosome‐derived miR‐142‐5p from liver stem cells improves the progression of liver fibrosis by regulating macrophage polarization through CTSB
Chen et al. Activation of mitochondrial DNA-mediated cGAS-STING pathway contributes to chronic postsurgical pain by inducing type I interferons and A1 reactive astrocytes in the spinal cord
Liang et al. Jinhong tablet reduces damage of intestinal mucosal barrier in rats with acute biliary infection via Bcl-2/Bax mRNA and protein regulation
Busada et al. Tristetraprolin prevents gastric metaplasia in mice by suppressing pathogenic inflammation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant