CN111388476A - 双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用。本发明所述双嘧达莫可抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化；同时还可改善博来霉素诱导的肺纤维化模型大鼠的呼吸功能，减轻肺组织炎症浸润，减少肺组织中成纤维细胞增生和胶原累积等病理状态；且其与2019年新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL酶具有较强的结合强度，对冠状病毒的3CL酶及冠状病毒感染Vero E6细胞有较强的抑制活性，表明所述双嘧达莫具有防治肺纤维化和2019年新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备成为肺炎药物进行应用。

Description

双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部 炎症药物中的应用

技术领域

本发明涉及药学技术和肺部疾病技术领域，更具体地，涉及双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用。

背景技术

特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)是指病因不明的慢性、进行性的纤维化间质性肺病，临床表现为持续且进行性的呼吸困难，肺功能降低，最终引发呼吸衰竭而死亡。该疾病主要发生在55岁以上的中老年中，发病率约为4.6-16.3每十万人。我国目前尚缺乏IPF患者流行病学统计数据，但作为老龄化严重的国家，患者人数预计约50万以上且正逐年增加。IPF病因未明且诊断困难，患者初期并无症状，确诊后已属中后期，平均存活时间仅为2-3年，5年生存率小于30％，死亡率高于多种癌症，因此IPF被称为“类肿瘤疾病”。

特发性肺纤维化目前尚无理想治疗药物，现有药物仅可缓解疾病进程，改善患者生活质量，却无法根治或逆转疾病。2015年ATS/ERS/JRS/ALAT联合颁布的《IPF诊治国际循证指南》中，强烈推荐治疗方式仅包括肺移植、长程氧疗等非药物治疗。已批准的抗肺纤维药物尼达尼布、吡非尼酮和抗酸治疗为有条件推荐使用药物。因此，结合特发性肺纤维化等疾病，开发治疗药物新靶点研究成果具有重要意义。

细胞第二信使环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)浓度的提升被证实具有抗纤维化作用。磷酸二酯酶(PDE)作为cAMP和cGMP的专属性水解酶，其抑制剂可有效提升cAMP/cGMP浓度而被用于多种疾病的治疗，但其目前作为抗肺纤维化新靶点药物的研究仍非常有限，仅包含少量PDE4、PDE5抑制剂的相关研究。

双嘧达莫又名潘生丁，对磷酸二酯酶8A(PDE8A)等多种亚型具有抑制作用，是一类非选择性PDE抑制剂。上市后主要用于抗血栓形成和冠状动脉扩张。此外，双嘧达莫具有广谱抗病毒作用以及免疫调节作用，可逆转肿瘤细胞的多药耐药性。双嘧达莫作为磷酸二酯酶抑制剂，可提有效提高细胞内cAMP水平，抑制TNF-α分泌，激活与cAMP相关的炎症通路，从而发挥抗炎等作用。然而，目前尚无该药物在肺纤维化及其他肺部炎症疾病中的相关报导。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中，对于特发性肺纤维化以及2019年新型冠状病毒引起的相关肺部炎症缺乏有效药物的不足和缺陷，提供双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用。本发明所述双嘧达莫可抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化；同时还可改善博来霉素诱导的肺纤维化模型大鼠的呼吸功能，减轻肺组织炎症浸润，减少肺组织中成纤维细胞增生和胶原累积等病理状态；且其与2019年新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL酶具有较强的结合强度，并对冠状病毒 3CL酶和冠状病毒感染Vero E6细胞具有较强的抑制活性，表明所属双嘧达莫具有防治肺纤维化和2019年新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备成为肺炎药物进行应用。

本发明的第二目的在于提供双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒3CL酶抑制剂药物中的应用。

本发明的第三目的在于双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒感染Vero E6细胞抑制剂药物中的应用

本发明第四目的在于提供一种包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐的预防和/或治疗肺部炎症药物。

本发明的第五目的在于提供一种包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐的冠状病毒 3CL酶抑制剂药物。

本发明的第六目的在于提供一种包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐的冠状病毒感染Vero E6细胞抑制剂药物。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用。

所述双嘧达莫的结构如式(Ⅰ)所示：

优选地，双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部肺纤维化药物中的应用。

优选地，所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐下调正常成纤维细胞纤维化转化模型中的FN(Fibronectin，纤粘蛋白)和α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)的表达水平。

优选地，所述正常成纤维细胞纤维化转化模型为TGF-β诱导造模。

优选地，所述正常成纤维细胞为HLF-1(人胚肺成纤维细胞)或NIH/3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)。

优选地，所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐缓解博来霉素诱导的肺功能下降。

优选地，所述肺功能下降为深吸气量(IC)、肺容量(VC)和气体流速下降，吸气末期暂停(EIP)增加、呼气末期暂停(EEP)增加、呼气中期流速(EF₅₀)增加、吸气气流峰值(PIF)增加、呼气气流峰(PEF)增加和气道阻力(penH)增加。

优选地，所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐抑制冠状病毒3CL酶活性。

优选地，所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐与冠状病毒3CL酶可紧密结合。

本发明同时还保护双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒3CL酶抑制剂药物中的应用。

本发明同时还保护双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒感染Vero E6细胞抑制剂药物中的应用。

优选地，所述冠状病毒为2019新型冠状病毒。

双嘧达莫或其药学上可接受的盐对冠状病毒3CL酶的抑制活性IC₅₀为22μM，表明其对于冠状病毒3CL酶具有很好的抑制作用。

一种防和/或治疗肺部炎症药物，包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐也在本发明的保护范围之内。

一种冠状病毒3CL酶抑制剂药物，包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐也在本发明的保护范围之内。

一种冠状病毒感染Vero E6细胞抑制剂药物，包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述药物为胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。本发明通过研究发现，

优选地，所述药物还可以包括药学上可接受的载体或辅料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述双嘧达莫可抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化；同时还可改善博来霉素诱导的肺纤维化模型大鼠的呼吸功能，减轻肺组织炎症浸润，减少肺组织中成纤维细胞增生和胶原累积等病理状态；且其与2019年新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL 酶具有较强的结合强度，表明所属双嘧达莫具有防治肺纤维化和2019年新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备成为肺炎药物进行应用。

附图说明

图1为双嘧达莫对TGF-β诱导的HLF-1细胞向肌成纤维细胞转化的影响。

图2为双嘧达莫对TGF-β诱导的NIH/3T3细胞成纤维化转化的影响。

图3为双嘧达莫治疗28天对肺纤维化模型大鼠体重的影响。

图4为双嘧达莫治疗28天对模型大鼠呼吸功能的影响。

图5为双嘧达莫治疗28天对模型大鼠肺组织HE染色的影响。

图6为双嘧达莫治疗28天对模型大鼠肺组织Masson染色的影响。

图7为双嘧达莫与病毒肺炎靶点3CL酶的结合模式。

图8双嘧达莫和3CL酶(Mpro)的SPR图。

图9双嘧达莫对3CL酶(Mpro)的抑制活性图。

图10双嘧达莫对冠状病毒感染Vero E6细胞的抑制活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1双嘧达莫对TGF-β诱导HLF-1细胞向肌成纤维细胞转化的影响

(1)实验材料：HLF-1(人胚肺成纤维细胞)，购于中国科学院细胞库；DMEM培养基(美国Gibco)；胎牛血清(以色列BI)；TGF-β(美国Proteintech)；双嘧达莫 (2,2',2”,2”'-[(4,8-二哌啶基嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,6-二基)二次氮基]四乙醇,中国毕得)；PMSF(中国碧云天)；RIPA(中国碧云天)；BCA(美国thermo Fisher Scientific)； FN一抗(英国abcam)；α-SMA一抗(英国abcam)；GAPDH一抗(英国abcam)； HRP-羊抗鼠IgG(中国BOSTER)。

(2)实验方法：HFL-1细胞以5×10⁵/mL接种于细胞培养小皿中培养过夜，使细胞贴壁。将细胞分为空白对照组，模型组，给药组，除空白组外均加入5μM的TGF-β，给药组加入不同浓度的双嘧达莫(终浓度分别为1、5、10、20μM)，孵育48h后，将细胞皿置于0℃，弃去培养基，加入4℃PBS溶液冲洗三次。采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。取蛋白30μg加入上样缓冲液，100℃变性 10min，常规制备SDS-PAGE胶，上样，120V电压电泳60min，转移蛋白至PVDF膜， 5％脱脂奶粉封闭60min，分别给予一抗α-SMA(1:1 000)，FN(1:1 000)，GAPDH (1:1000)，4℃下孵育过夜，PBST洗膜3次，10min/次，加入二抗辣根过氧化物酶标记的IgG，室温孵育1h，PBST洗膜3次，10min/次，ECL显色、暗室曝光、扫描，运用Image J软件得出灰度值。

(3)实验结果：详见图1，模型组中，HLF-1细胞给予TGF-β处理后FN和SMA 蛋白表达增加，表明诱导纤维化模型成功；给药组中，双嘧达莫给药20μM和10μM 处理组中，可以下调FN的表达。与模型组比，双嘧达莫在10～20μM范围内可以抑制HLF-1细胞向肌成纤维细胞转化。

实施例2双嘧达莫对TGF-β诱导NIH/3T3细胞成纤维化转化的影响

(1)实验材料：NIH/3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)，购于中国科学院细胞库；DMEM 培养基(美国Gibco)；胎牛血清(以色列BI)；TGF-β(美国Proteintech)；双嘧达莫 (2,2',2”,2”'-[(4,8-二哌啶基嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,6-二基)二次氮基]四乙醇,毕得)；PMSF (碧云天)；RIPA(碧云天)；BCA(美国thermo Fisher Scientific)；FN一抗(英国abcam)；α-SMA一抗(英国abcam)；GAPDH一抗(英国abcam)；HRP-羊抗鼠IgG(中国BOSTER)。

(2)实验方法：NIH/3T3细胞以5×10⁵/mL接种于细胞培养小皿中培养过夜，使细胞贴壁。将细胞分为空白对照组，模型组，给药组，除空白组外均加入5μM的TGF-β，给药组加入不同浓度的双嘧达莫(终浓度分别为1、5、10、20μM)，孵育48h后，将细胞培养皿置于0℃，弃去培养基，加入4℃PBS溶液冲洗三次。采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。取蛋白30μg加入上样缓冲液，100℃变性10min，常规制备SDS-PAGE胶，上样，120V电压电泳60min，转移蛋白至PVDF 膜，5％脱脂奶粉封闭60min，分别给予一抗α-SMA(1:1000)，FN(1:1 000)，GAPDH (1:1000)，4℃下孵育过夜，PBST洗膜3次，10min/次，加入二抗辣根过氧化物酶标记的IgG，室温孵育1H，PBST洗膜3次，10min/次，ECL显色、暗室曝光、扫描，运用Image J软件得出灰度值。

(3)实验结果：详见图2所示，模型组中，NIH/3T3细胞给予TGF-β处理后FN和α-SMA蛋白表达增加，表明诱导纤维化模型成功；给药组中，双嘧达莫在1～20μM 范围内，呈剂量依赖性下调FN和α-SMA的蛋白表达水平。与模型组相比，有统计学差异。

实施例3双嘧达莫对博来霉素诱导的肺纤维化模型大鼠的影响

(1)实验材料：SPF级SD大鼠60只，6～8周龄，体重200～250g，雄性，购自于中山大学实验动物中心(许可证号：SYXK(粤)2016-0112)，环境温度：20～25℃，湿度 50～70％，自由摄食饮水。双嘧达莫(2,2',2”,2”'-[(4,8-二哌啶基嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,6- 二基)二次氮基]四乙醇,毕得)；吡非尼酮(上海麦克林生化科技有限公司)；羧甲基纤维素钠CMC-Na(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；注射用盐酸博来霉素(海正辉瑞制药有限公司)。

(2)实验方法：

动物分组：取雄性SD大鼠60只，随机分为：空白组(0.5％CMC-Na)，模型组 (0.5％CMC-Na)，吡非尼酮给药组(150mg/kg)，双嘧达莫低剂量给药组(10mg/kg)，双嘧达莫高剂量给药组(20mg/kg)，每组12只。

模型制备：腹腔注射4％戊巴比妥钠3mL/kg将大鼠麻醉后，SPF条件下颈部正中切口，分离气管，向气管内两根软骨中快速注射博莱霉素溶液5mg/kg，空白组注入等体积的生理盐水，注射后立刻缝合切口并消毒处理，将大鼠直立旋转3min，使药液在肺中分布均匀，清醒后常规饲养观察大鼠状态，次日起给药。吡非尼酮(150mg/kg) 和双嘧达莫的两个剂量给药组(10mg/kg，20mg/kg)造模次日开始给药，每日口服给药1次，连续28天。对照组和模型组给予等体积溶媒0.5％CMC-Na。观察各组大鼠在给药28天期间体质量、毛色、呼吸状态等的变化并记录。给药28天后，测试各组大鼠呼吸水平和肺部CT。随后，大鼠经4％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血5mL，在4℃，3000rpm离心15min(离心半径15cm)提取血清，置入-80℃冰箱保存。分离肺组织，右肺置于4％多聚甲醛固定后，制备4μm石蜡切片供病理学检查 (HE染色及Masson染色)及免疫组化，左肺组织投入液氮中保存以供后续免疫印迹测试。

HE和Masson染色观察肺组织病理学改变：行常规HE和Masson染色。HE 染色评定肺组织肺泡炎程度；Masson染色评定肺组织纤维化程度。Masson染色操作严格按照染色试剂盒产品说明书进行，蓝色的胶原纤维为阳性染色。使用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件系统采集染色图像，随机取染色区域6个高倍视野(×100)，测量并记录每个视野阳性染色的面积(μm2)进行半定量分析。

(3)实验结果：

1)大鼠一般状态及体重

与空白组相比，造模各组动物外观体征、粪便性状等未见明显差异。与模型组比较，吡非尼酮给药组及双嘧达莫给药组动物外观体征、行为活动、粪便性状等未见明显差异。由图3可见，与空白组比较，造模组动物体重没有明显改变，未见统计学差异(P>0.05)。与模型组比较，给药组动物体重未见统计学差异(P>0.05)。

2)双嘧达莫对博来霉素诱导的肺纤维化模型大鼠呼吸功能的影响

由图4所示，博来霉素造模后产生的肺纤维化和气道阻塞等原因使气道变狭窄，气流的阻力增加，肺阻力升高，肺表面活性物质减少，肺弹性阻力增加，肺动态顺应性(Cydn)降低；表现为吸气困难，大量胶原沉积破坏肺部正常生理结构，肺容量如深吸气量(IC)、肺容量(VC)下降，肺纤维化合并严重阻塞性病变时，气体流速下降，吸气末期暂停(EIP)增加(如图4a所示)，呼气末期暂停(EEP)增加(如图 4b所示)，呼气中期流速(EF50)增加(如图4c所示)，吸气气流峰值(PIF)增加 (如图4d所示)，呼气气流峰(PEF)增加(如图4e所示)，气道阻力(penH)增加(如图4f所示)。本实验中，博来霉素造模后，EIP、EEP、EF50、PIF、PEF及penH均增加，表明造模成功。

经双嘧达莫和吡非尼酮灌胃治疗28天后，双嘧达莫在10-20mg/kg剂量范围内，缓解肺功能下降。阳性药吡非尼酮(150mg/kg)与双嘧达莫剂量10mg/kg药效结果类似。

3)双嘧达莫对肺纤维化模型大鼠的肺组织HE染色的影响

由图5的肺组织HE染色结果所示：无染区为肺泡空腔，蓝色为细胞核，红色为细胞浆。空白组大鼠肺泡排列有序，形态大小正常均一；而模型组大鼠肺部结构排列紊乱，肺泡过度扩张导致肺泡壁破裂融合，形成肺大泡，或被聚集增生的成纤维细胞取代，气管周围有大量炎细胞浸润。与模型组相比，吡非尼酮给药组(150mg/kg,po) 和双嘧达莫(10mg/kg,po；20mg/kg,po)给药组均可显著改善大鼠肺组织的病理状况，大鼠肺泡结构比较完整，且间隔增厚不明显，炎症程度减轻，且双嘧达莫两组效果优于吡非尼酮组。

4)双嘧达莫对肺纤维化模型大鼠的肺组织Masson染色的影响

由图6的肺组织Masson染色结果所示：无染区为肺泡腔，深蓝色为胶原纤维，红染区为细胞结构。空白组大鼠肺组织有少量或者几乎未见胶原沉积；而模型组气管周围、细胞增生处有大面积蓝染。羟脯胺酸(FN)是胶原合成的主要成分之一，其含量的高低反应了胶原沉积的程度。模型组大鼠肺组织中FN含量显著升高，模型组大鼠肺组织中胶原沉积严重。根据切片结果，治疗28天后，吡非尼酮给药组(150mg/kg, po)和双嘧达莫(10mg/kg,po；20mg/kg,po)给药组均可显著改善大鼠肺组织的病理状况。大鼠肺纤维组织化程度明显减轻，肺泡成纤维细胞增生不明显，胶原累积有所减少。

5)双嘧达莫对病毒肺炎靶点3CL酶具有较强的结合强度

本实施例依托天河二号和深圳超算等超级计算机及团队自主研发的药物/靶标结合强度精准预测软件(GA-FEP)，采用分子对接、动力学模拟和绝对自由能微扰方法(具体方法参考J Med Chem，2019，62，2099-2111)预测双嘧达莫与2019年新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL酶(高分辨晶体结构，PDB ID:6LU7)的结合强度，其结合模式 (分子对接打分结果：CDOCKER-ENERGY为45.78kcal/mol)如图7所示，显示分子对接后双嘧达莫(如图所标，左下侧分子)与新型冠状病毒靶点3CL酶具有较强的结合强度，结合绝对自由能为-6.34kcal/mol，进一步推算该化合物对3CL酶的抑制活性IC₅₀为22μM，说明该化合物对2019年新型冠状病毒所导致肺炎具有潜在治疗作用。

实施例4双嘧达莫与新型冠状病毒靶点3CL水解酶结合

(1)实验材料：

含有3CL基因的重组质粒由普健生物公司合成，GST Beads购自SmartLifescience 公司，分子相互作用仪为美国GE Healthcare Life Sciences公司的Biacore8K，N-已基 -N-二甲基-氨丙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化试剂、醋酸钠缓冲液(pH 4.5和5.0)及传感生物芯片CM5均由美国GE Healthcare Life Sciences公司生产，双嘧达莫及其他常用试剂购自毕得。

(2)实验方法：

a.重组3CL水解酶的表达与纯化

将包含2019-nCov来源的3CL重组质粒(pGEX4T1)转化入大肠杆菌菌株BL21(codonplus)，再将菌株在LB或2x YT培养基中生长至OD₆₀₀为0.6-0.8，然后加入 0.1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在15℃继续生长24小时进行低温诱导表达，通常1L培养基可收获约8-15克湿菌。按1：5的比例加入裂解液将菌重悬，经超声、高压破碎等方式破碎菌体后，离心取上清经GST Beads按生产商的说明进行亲和层析纯化，通过牛α-凝血酶切除GST-Tag纯化标签后，用SDS-PAGE的方法对蛋白纯度进行验证。

b.偶联pH值的筛选

靶点3CL水解酶的等电点(PI值)为5.94，因此选用10mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 值分别为5.0和4.5)稀释3CL蛋白至终浓度为90μg/ml和45μg/ml，在Contro Software(控制软件)中，采用手动进样法进行pH值和蛋白浓度的筛选，选取偶联值最优的pH值和蛋白浓度进行后续实验。

c.3CL水解酶在CM5传感片表面的偶联

用上述筛选得到的最佳pH值的醋酸钠缓冲液稀释3CL水解酶至最优终浓度，通过氨基偶联的方法将3CL水解酶偶联到CM5芯片葡聚糖表面上的羧基。芯片表面用 0.2mol/LEDC和50mmol/L NHS以1:1比例配制的混合液活化，以10μL/min的流速进样，连续进样7min后注射3CL水解酶溶液，然后以1mol/L乙醇胺盐酸(pH 8.5) 封闭液进样7min，封闭活化的芯片表面。

d.3CL水解酶与双嘧达莫的动力学和亲和力分析

将双嘧达莫用10mmol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至100、80、40、20、10 和5μmol/L持续进样200s，并以10mmol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)作为再生液，采用动力学分析Wizard模板中的动力学和亲和力法进行动力学试验，分析配体与受体的相互作用，所得数据根据分析软件拟合，以时间为横坐标，响应值为纵坐标，计算动力学常数。

(3)实验结果：

a.高纯度3CL水解酶的表达纯化

经GST Beads亲和层析获得了大量的3CL水解酶，经SDS-PAGE鉴定其纯度达95％以上，用于后续的SPR测定亲和力实验。

b.双嘧达莫对3CL水解酶的结合强度和抑制活性

试验结果发现，在pH值为4.5和蛋白浓度为90μg/mL条件下偶联时效果最佳， 3CL水解酶在CM5芯片表面最终偶联量的响应值达到1800RU。SPR动力学分析数据显示(图8)，双嘧达莫与3CL水解酶的结合常数(Ka)为3.20×10³，解离常数(Kd)为 2.19×10^-1，亲和力常数(K_D,eq)为34μM。说明双嘧达莫与3CL水解酶(Mpro)具有较强的结合能力。

此外，按照文献酶学测试方法(https://doi.org/10.1101/2020.02.26.964882)，以同样条件测试双嘧达莫对3CL水解酶的抑制活性，测得结果如图9所示，其中横坐标为双嘧达莫(DIP)的浓度，纵坐标为3CL水解酶(Mpro)的酶活，计算得到双嘧达莫对3CL水解酶的抑制IC₅₀为530nM，说明双嘧达莫能通过抑制3CL水解酶来抑制病毒的复制，从而达到抗肺炎的效果。

实施例5双嘧达莫对新型冠状病毒感染Vero E6细胞具有较强的抑制活性

参考文献的测试方法(https://www.nature.com/articles/s41422-020-0282-0)。将冠状病毒感染Vero E6细胞接种于96孔板中，用不同剂量的双嘧达莫或氯喹处理1小时后感染病毒。培养24小时后，用Cytofix/Cytoperm(BD)固定和渗透细胞，用兔抗病毒核衣壳蛋白多克隆抗体(Sino-Biological)和HRP标记的山羊抗兔二级抗体(Jackson) 孵育。用TRUEBlue试剂观察病灶。用ELISPOT阅读器计数感染细胞中的病灶。病毒滴度计算为每毫升病灶形成单位(FFU)。

通过测试双嘧达莫对2019新冠病毒细胞的抑制活性，结果如图10所示，发现双嘧达莫浓度100nM时对Vero E6病毒细胞的抑制率超过50％，双嘧达莫对Vero E6病毒细胞的EC50≤100nM(图10)，与阳性药物氯喹的活性基本一致。该数据表明在细胞层面，双嘧达莫对新型冠状病毒感染细胞有较强的抑制能力，具有潜在临床应用价值。

由上述实验结果得到的结论为：双嘧达莫可以与病毒肺炎靶点3CL水解酶有较强结合，抑制冠状病毒3CL水解酶的活性，并对Vero E6病毒细胞有较强的抑制作用，表明所述双嘧达莫具有防治新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备为治疗和/或预防新型冠状病毒引发肺炎的药物进行应用。

由上述实验结果得到的结论为：在博来霉素诱导的肺纤维化实验中，双嘧达莫可以明显降低气道阻力，改善肺纤维化大鼠的呼吸功能，减轻炎症细胞浸润，减少肺组织中成纤维细胞增生和胶原累积，这表明双嘧达莫可能具有抗炎抗纤维化作用。此外，双嘧达莫对病毒肺炎靶点3CL酶(Mpro)具有较强的结合强度和抑制活性，并对冠状病毒感染Vero E6细胞有较强的抑制作用，这提示双嘧达莫具有潜在的抗新型冠状病毒肺炎作用。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (11)

1.双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部肺纤维化药物中的应用。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐下调正常成纤维细胞纤维化转化模型中的FN和α-SMA的表达水平；所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐缓解博来霉素诱导的肺功能下降。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐抑制冠状病毒3CL酶(Mpro)活性；所述双嘧达莫或其药学上可接受的盐抑制新型冠状病毒感染Vero E6细胞活性。

5.双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒3CL酶(Mpro)抑制剂药物中的应用。

6.双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒感染Vero E6细胞抑制剂药物中的应用。

7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述冠状病毒为2019新型冠状病毒。

8.一种防和/或治疗肺部炎症药物，其特征在于，包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

9.一种冠状病毒3CL酶(Mpro)抑制剂药物，其特征在于，包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

10.一种冠状病毒感染Vero E6细胞抑制剂药物，其特征在于，包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

11.根据权利要求8、9或10所述药物，其特征在于，所述药物为胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。

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