CN114053280A - 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用 - Google Patents

磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114053280A
CN114053280A CN202010769251.1A CN202010769251A CN114053280A CN 114053280 A CN114053280 A CN 114053280A CN 202010769251 A CN202010769251 A CN 202010769251A CN 114053280 A CN114053280 A CN 114053280A
Authority
CN
China
Prior art keywords
novel coronavirus
pimobendan
cells
concentration
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010769251.1A
Other languages
English (en)
Inventor
胡宇慧
赵金存
李云飞
孙静
冯若轻
赵研
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Southern University of Science and Technology
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Southern University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Southern University of Science and Technology filed Critical First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority to CN202010769251.1A priority Critical patent/CN114053280A/zh
Publication of CN114053280A publication Critical patent/CN114053280A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/501—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物的应用，本发明通过系统生物学的筛选以及细胞水平实验验证了扎达维林、匹莫苯、克立硼罗能够在细胞水平上不同程度地抑制新型冠状病毒的增殖，其中扎达维林的抗新冠病毒效果最强，匹莫苯次之，三种药物均可用于制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物。

Description

磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒 肺炎的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，尤其涉及磷酸二酯酶抑制剂扎达维林、匹莫苯、克立硼罗或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
背景技术
2020年的新型冠状病毒肺炎的全球大流行，截止7月27日全球范围内的确诊患者已超1626万例，对全世界人民的生命健康以及世界经济发展造成重要影响。在我国，尽管疫情已经总体上被遏制，但仍然存在小范围流行和反复爆发的风险。
新型冠状病毒肺炎COVID-19的全球大流行已有数月，然而依然没有发现治疗新型冠状病毒肺炎特效药物。通过计算机模拟的方法预测药物再进行实验验证的思路可以显著的缩短药物筛选的时间。目前针对新型冠状病毒肺炎的药物虚拟筛选主要是基于该病毒侵染细胞时关键组分的蛋白结构来实现的。通过收集海量的药物分子结构数据库分别与新型冠状病毒主要的蛋白酶模拟对接并打分。之后，将对接分数靠前的复合系统提交到分子力学模拟中，通过分子动力学模拟和计算在分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积水平上所有的结合自由能，可以预测这些活性化合物与病毒蛋白酶之间的结合模式以及结合的稳定性，同时寻找残基与配体相互作用位点。
诚然，这样的筛选方法已经得到了一系列的候选药物，并有部分药物正在进行临床试验。但是细胞对新型冠状病毒的反应(比如不同感染时期的免疫应激)以及由此造成的细胞损伤机理比单纯两个分子相互作用要复杂的多，可能涉及了细胞内所有转录组/蛋白组的变化。本发明目的是从转录组所有基因表达的层面分析新型冠状病毒对细胞转录组的变化，并通过整合对比化合物对细胞转录组的影响变化来筛选潜在的治疗药物，并通过对筛选所得的化合物进行细胞水平的病毒抑制实验，确定其抗新型冠状肺炎的活性强弱。
扎达维林是新型的磷酸二酯酶3和4的抑制剂。目前，还没有关于以上这种药物治疗新型冠状病毒肺炎的报道。
匹莫苯是磷酸二酯酶3的选择性抑制剂，有较强的正性肌力和较强的血管扩张作用及血小板聚集作用。目前，还没有关于以上这种药物治疗新型冠状病毒肺炎的报道。
克立硼罗是选择性的小分子磷酸二酯酶4抑制剂，具有广谱的抗炎活性。目前，还没有关于以上这种药物治疗新型冠状病毒肺炎的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，特别是提供磷酸二酯酶抑制剂扎达维林、匹莫苯、克立硼罗或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供磷酸二酯酶抑制剂在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，所述磷酸二酯酶抑制剂包括扎达维林(CAS No:101975-10-4)、匹莫苯(CAS No:74150-27-9)或克立硼罗(CAS No:906673-24-3)中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述扎达维林(化学名称6-(4-二氟甲氧基-3-甲氧基苯基)-3(2H)-哒嗪酮)、匹莫苯(化学名称6-[2-(4-甲氧基苯基)-1H-苯并咪唑-5- 基]-5-甲基-4,5-二氢-3(2H)-哒嗪酮)或克立硼罗(化学名称4-[(1,3-二氢-1-羟基 -2,1-苯并氧杂硼杂环戊烷-5-基)氧基]苯甲腈)能够在细胞水平上抑制新型冠状病毒的增殖，可以在细胞水平上抑制新型冠状病毒对正常细胞的侵染，其中扎达维林的抗新冠病毒效果最强，匹莫苯次之。三种药物均可用于制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物。
在本发明中，扎达维林的结构如式I所示：
Figure RE-GDA0002770366060000031
在本发明中，匹莫苯的结构如式II所示：
Figure RE-GDA0002770366060000032
在本发明中，克立硼罗的结构如式III所示：
Figure RE-GDA0002770366060000033
在本发明中，所述磷酸二酯酶抑制剂可以使用纯净的扎达维林、匹莫苯或克立硼罗中的任意一种或至少两种的组合。也可以由含有这三种磷酸二酯酶中至少一种的原料提供。
在本发明中，所述扎达维林的给药浓度为0.4μM-100μM，例如100μM、 33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、0.41μM。所述匹莫苯的给药浓度为 0.4μM-100μM，例如100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、1.23μM、0.41μM。所述克立硼罗的给药浓度为0.4μM-100μM，例如100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、 1.23μM、0.41μM。
优选地，所述扎达维林的给药浓度为1μM时可以抑制50％的新型冠状病毒在Huh7细胞中的复制；所述匹莫苯的给药浓度为12μM时可以抑制50％的新型冠状病毒在Vero-E6细胞中的复制；所述克立硼罗的给药浓度为100μM时可以抑制50％的新型冠状病毒在Vero-E6细胞中的复制。
在本发明中，所述药物组合物包括所述扎达维林、匹莫苯或克立硼罗中的任意一种或至少两种的组合以及药学上可接受的载体。
优选地，所述药物组合物中扎达维林的重量百分含量为1-99％，例如2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 95％或98％等，优选1-90％。
优选地，所述药物组合物中匹莫苯的重量百分含量为1-99％，例如2％、3％、 5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％等，优选1-90％。
优选地，所述药物组合物中克立硼罗的重量百分含量为1-99％，例如2％、 3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 95％或98％等，优选1-90％。
优选地，所述治疗新型冠状病毒肺炎的药物的剂型为普通压制片、分散片、肠溶片、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、乳剂、散剂、口服液或注射剂中的任意一种。
在本发明中，通过新型冠状病毒侵染人肝癌细胞系(Huh7)并从三个时间点(3小时，18小时，24小时)对样本进行RNA测序。通过计算新冠病毒造成的差异表达基因和候选药物转录组的相似程度以及相反程度来进行药物筛选。通过整合发明人前期试验积累的144个天然产物和药物的数百个转录谱的差异倍数矩阵，对每个转录谱的每个基因的差异表达倍数从大到小排序。根据病毒处理得到的转录组结果和药物转录组的“相似度”寻找和病毒作用相似以及相反的药物作为潜在的新型冠状病毒治疗药物。最后通过体外细胞实验对筛选出的药物进行细胞抗新型冠状病毒侵染实验验证，最终验证了扎达维林能够在细胞水平上抑制新型冠状病毒的增殖。又通过检测其他的磷酸二酯酶抑制剂，验证出匹莫苯和克立硼罗同样具有在细胞水平上抑制抑制新型冠状病毒的增殖的功能，但是效果较扎达维林弱。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过系统生物学的预测以及细胞水平实验验证了磷酸二酯酶抑制剂扎达维林、匹莫苯、克立硼罗能够在细胞水平上抑制新型冠状病毒的增殖，其中扎达维林的抗新冠病毒效果最强，匹莫苯次之，三种药物均可用于制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物。
附图说明
图1A为新型冠状病毒在病毒浓度0.12％时对Huh7细胞转录组的影响比例强度图。
图1B为新型冠状病毒在病毒浓度4.96％时对Huh7细胞转录组的影响比例强度图。
图1C为新型冠状病毒在病毒浓度11.09％时对Huh7细胞转录组的影响比例强度图。
图2为扎达维林与被新型冠状病毒侵染细胞的转录图谱的相关分数折线，图中所示点均为药物处理其他细胞系所得转录谱(实线代表MCF7细胞系，虚线代表SH-S5Y细胞系)和不同病毒浓度处理细胞所得转录谱对比所得相似度。
图3为检测药物对新型冠状病毒影响的体外实验免疫荧光结果示意图。
图4A为扎达维林对新型冠状病毒感染Huh7细胞的抑制率曲线图，图中所示，圆形实心点代表不同扎达维林浓度对Huh7细胞中的新型冠状病毒的抑制率，方形空心点代表该浓度下扎达维林对Huh7细胞活性的影响。
图4B为显微镜下通过免疫荧光实验观察扎达维林对感染Huh7的新型冠状病毒的抑制效果图。
图5A为匹莫苯对新型冠状病毒感染Vero-E6细胞的抑制率曲线图，图中所示，圆形实心点代表不同匹莫苯浓度对Vero-E6细胞中的新型冠状病毒的抑制率，方形空心点代表该浓度下匹莫苯对Vero-E6细胞活性的影响。
图5B为显微镜下通过免疫荧光实验观察匹莫苯对感染Vero-E6的新型冠状病毒的抑制效果图。
图6A为克立硼罗对新型冠状病毒感染Vero-E6细胞的抑制率曲线图，图中所示，圆形实心点代表不同克立硼罗浓度对Vero-E6细胞中的新型冠状病毒的抑制率，方形空心点代表该浓度下克立硼罗对Vero-E6细胞活性的影响。
图6B为显微镜下通过免疫荧光实验观察克立硼罗对感染Vero-E6的新型冠状病毒的抑制效果图。
图7A为欧来米特对新型冠状病毒感染Vero-E6细胞的抑制率曲线图，图中所示，圆形实心点代表不同欧来米特浓度对Vero-E6细胞中的新型冠状病毒的抑制率。
图7B为显微镜下通过免疫荧光实验观察欧来米特对感染Vero-E6的新型冠状病毒的抑制效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限。
实施例1
在本实施例中，对扎达维林对新型冠状病毒的效果进行初步评估，方法如下：
(一)利用如下方法来研究新型冠状病毒对宿主细胞系转录组的影响：
1.实验操作和分析过程
(1)病毒感染Huh7(人肝癌细胞)的体外实验。
Huh-7细胞使用DMEM+10％FBS培养基，37℃、5％CO2标准环境。胰酶消化后的细胞悬液铺12孔板，过夜培养。第二天弃掉孔内细胞培养基，换成含病毒培养基(0.05感染复数)，孵育1小时后弃掉含病毒培养基，PBS润洗三遍，换成标准培养基。感染后分别于3、18、24小时用TRIZOL收集裂解细胞。病毒感染后Huh7细胞的转录组测序和分析。
(2)病毒感染后Huh7细胞的转录组测序和分析。
Trizol reagent购自诺维赞生物技术有限公司，细胞样本按照其说明书标准操作流程实施。用NanoDrop测定总RNA浓度，取1ug总RNA按照翊圣生物Hieff
Figure RE-GDA0002770366060000071
MaxUp IIDual-mode mRNA Library Prep Kit for
Figure RE-GDA0002770366060000072
MaxUp II双模式mRNA建库试剂盒建库，并使用诺禾致源Illumina PE150测序平台测序。数据由本课题组计算分析。
通过HISAT2将测序所获得的转录组数据比对到人的基因组上。之后用 DESeq2计算加药组和对照组的差异倍数以及p值，从而得到每一个样本中细胞被病毒感染后表达水平改变的基因数目和变化幅度。
2.结果
通过对新型冠状病毒侵染Huh7细胞3小时(见图1A)、18小时(见图1B) 以及24小时(见图1C)的转录组测序结果进行分析。结果如图1A,B所示，发现在Huh7细胞中病毒处理3小时到18小时之间上调的基因有明显的增加，病毒处理3小时时，细胞显著上调的84个基因，显著下调13个基因，见图1A；18 小时时，细胞显著上调138个基因，显著下调基因减少到6个，见图1B。然而从18小时到24小时之间下调的基因显著增加到109个，上调的基因略微减少到94个，见图1C。
(二)通过加入药物后的转录组数据进行药物的筛选和潜在效果的评估，方法如下：
1.实验操作和分析过程
(1)候选药物对多种细胞系处理后转录组测序和分析
发明人实验室前期用144天然提纯化合物和化学合成药物不同浓度处理不同细胞系的细胞，然后提取细胞总RNA，并完成了细胞转录组mRNA测序和分析，鉴定细胞被药物处理后改变基因的数目和变化幅度。具体实验操作和分析计算方式与方法(一)类同。不同之处在于测序策略使用的是3’mRNA-Seq测序，所使用的建库试剂盒是Lexogen公司的QuantSeq 3’mRNA-Seq。后续分析过程同方法(一)。整合每个样本所有基因的变化倍数为一个基因-药物矩阵，对每个样本中的差异倍数从大到小排序，之后用顺序值代替矩阵中每个转录谱的差异表达倍数。
(2)对比病毒和药物的转录组数据完成药物筛选
通过对新型冠状病毒感染细胞后转录组测序的差异分析，提取表达差异倍数在2倍以上以及显著性检验的假定值p小于0.05的基因集。分别与候选药物矩阵的药物计算相关分数。使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验方法对上下调基因集计算“相关分数(Connectivity Score,cScore)”。相关分数的计算方法如下，其中n为每个样本的总基因数，t为病毒处理后细胞中改变基因的数量。其中V (j)为该差异基因在矩阵中的排序值，其中j＝1，2，...，t。计算以下两个值：
Figure RE-GDA0002770366060000091
Figure RE-GDA0002770366060000092
如果a>b，则设置ksi＝a。如果b>a，则设置ksi＝-b。上调分数和下调分数分别是
Figure RE-GDA0002770366060000093
和
Figure RE-GDA0002770366060000094
当
Figure RE-GDA0002770366060000095
和
Figure RE-GDA0002770366060000096
的正负性相同是,设置相关分数Si为0。否则相关分时Si设置为
Figure RE-GDA0002770366060000097
cScore数值大小在+1到-1之间。将实验中得到的数据与数据库中已有数据进行比对，当cScore趋向于+1时，实验数据的基因表达水平与相对应的已有数据相似，更有可能具有相似的作用通路或分子靶点；当cScore趋于-1时，实验数据的基因表达水平与相对应的已有数据相反，更有可能具有相互拮抗的作用通路或分子靶点；当cScore趋于0时，两组数据没有统计学意义上的相似。反映到本实验中，由于细胞在病毒感染早期的应激反应包括可以对抗病毒感染、有利于细胞清除病毒的免疫反应，而在感染后期则以细胞的病理性表现为主，希望寻找到与病毒感染早期反应正相关(cScore 趋向+1)，以及与感染后期反应相反(cScore趋向-1)的药物。
2.结果
(1)扎达维林与新型冠状病毒比对的结果。
通过将新型冠状病毒处理细胞产生的差异表达基因和扎达维林处理细胞造成的转录图谱对比，寻找和新型冠状病毒最相似以及最相反的药物。扎达维林处理乳腺癌细胞MCF7 6小时与新型冠状病毒处理人肝癌细胞株Huh7不同时间经历了从无关到相反再到无关的过程，在新型冠状病毒处理18小时的结果为 -0.633074935，3小时和24小时的相似度均为0，说明扎达维林与病毒感染中期 (中度病毒感染时期)的细胞反应相反。扎达维林处理人神经母细胞瘤细胞 (SH-S5Y)6小时与新型冠状病毒处理人肝癌细胞株Huh7不同时间经历了从正相关到相反再到近似无关的过程，三个时间点的相关分数分别为0.712490682，-0.537709123和-0.306546002，说明扎达维林与病毒感染早期的细胞反应相似，与中后期(中高度病毒感染时期)的细胞反应相反。据此，扎达维林能诱导细胞产生类似于病毒感染早期的免疫应激反应，有利于细胞清除病毒感染，同时可以抑制病毒感染程度增加(感染中后期)的细胞病理反应，具有预防以及在感染早期治疗新型冠状病毒的潜力，见图2。
实施例2
在本实施例中，通过细胞水平实验来测定扎达维林对新冠病毒的活性体外抑制作用。并且选取其他3个磷酸二酯酶抑制剂进行抗新型冠状病毒活性的验证。
1.实验操作和分析过程
将每种药物分别设置6个处理浓度(100μM、33.3μM、11.1μM、3.7μM、 1.23μM、0.41μM)并于每板设置无感染细胞对照，及无药物处理感染对照。 Huh-7细胞使用DMEM+10％FBS培养基，37℃、5％CO2标准环境。胰酶消化后的细胞悬液(Huh7细胞以2.1×104/100μL接种)铺12孔板，过夜培养。第二天弃掉孔内细胞培养基，换成含病毒培养基(0.05感染复数)，孵育1小时后弃掉含病毒培养基，PBS润洗三遍，换成含不同浓度药物的标准培养基。24小时后4％多聚甲醛固定细胞，利用针对新冠病毒N蛋白的抗体进行免疫荧光染色(绿色)。并同时对细胞核进行DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)蓝色荧光染色，DAPI 可以穿过细胞膜并跟核内DNA相结合，荧光显微镜下呈蓝色。应用Celigo扫板，计算药物对病毒感染抑制率。其中病毒感染程度用抗N蛋白抗体的免疫荧光结果计算，细胞计数以DAPI染色结果计算。免疫荧光结果如图3所示，感染率和抑制率计算公式如下：
Figure RE-GDA0002770366060000111
Figure RE-GDA0002770366060000112
为探究药物本身对细胞生长活性的影响，每种药物还设置了与病毒抑制实验平行的细胞活性对照实验。细胞操作和药物处理浓度同上，但是细胞不进行病毒感染处理，并于实验终点在细胞板每孔中进行CCK8检测试剂进行活性检测。CCK-8试剂中含有WST–8：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4- 二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。细胞活性计算公式为：取出细胞板，每孔中加入10μL CCK8溶液以及100μL培养基的混合液，37℃培养箱内孵育。之后测定在该孔样本450nm处的吸光度。细胞活性计算公式为：
Figure RE-GDA0002770366060000121
2.结果
(1)扎达维林可有效抑制病毒在人肝癌细胞Huh7中的复制。
通过6种不同浓度的扎达维林处理被病毒侵染后的人肝癌细胞Huh7，根据不同浓度扎达维林对病毒的抑制率绘制IC50曲线，如图4A所示，在1.23μM浓度时对病毒的抑制率已经超过50％。通过软件计算所得对病毒半数抑制率IC50 的药物浓度为1.0822μM。通过细胞活性检测(CCK-8试剂盒)可以看出，扎达维林对Huh7细胞毒性很低，在IC50浓度下均未观察到细胞毒性。通过显微镜观察细胞的免疫荧光反应，如图4B所示，发现在Huh7细胞中1.23μM的扎达维林可以有效减少细胞内病毒的感染滴度。
(2)匹莫苯可有效抑制病毒在非洲绿猴肾细胞Vero-E6中的复制。
通过6种不同浓度的匹莫苯处理被病毒侵染后的非洲绿猴肾细胞Vero-E6，根据不同浓度匹莫苯对病毒的抑制率绘制IC50曲线，如图5A所示，在33.3μM 浓度时对病毒的抑制率已经达到70％。通过软件计算所得对病毒半数抑制率 IC50的药物浓度为11.9217μM。通过细胞活性检测(CCK-8试剂盒)可以看出，匹莫苯在IC50病毒抑制浓度下未观察到细胞毒性，只有在100μM下对细胞生长呈现一定的抑制力。通过显微镜观察细胞的免疫荧光反应，如图5B所示，发现在Vero-E6细胞中33.3μM的匹莫苯可以有效抑制病毒对细胞的感染。
(3)克立硼罗可有效抑制病毒在非洲绿猴肾细胞Vero-E6中的复制。
通过6种不同浓度的克立硼罗处理被病毒侵染后的非洲绿猴肾细胞Vero-E6，根据不同浓度克立硼罗对病毒的抑制率绘制IC50曲线，如图6A所示，在100μM浓度时对病毒的抑制率达到50％。通过软件计算所得对病毒半数抑制率IC50的药物浓度亦为100μM。通过细胞活性检测(CCK-8试剂盒)可以看出，克立硼罗对Vero-E6细胞毒性较扎达维林和匹莫苯强，在病毒抑制IC50浓度下细胞存活率为60％。通过显微镜观察细胞的免疫荧光反应，如图6B所示，发现在Vero-E6细胞中100μM的克立硼罗可以有效抑制病毒对细胞的感染。
(4)欧来米特不能有效抑制病毒在非洲绿猴肾细胞Vero-E6中的复制。
通过6种不同浓度的欧来米特处理被病毒侵染后的非洲绿猴肾细胞 Vero-E6，根据不同浓度欧来米特对病毒的抑制率绘制IC50曲线，如图7A所示，在100M浓度时对病毒的抑制率都没有达到50％。通过显微镜观察细胞的免疫荧光反应，如图7B所示，发现在Vero-E6细胞中即使100μM的欧来米特也不能有效抑制病毒对细胞的感染。
综上所述，本发明通过转录组基因改变特征筛选出扎达维林具有抗病毒的潜力，并通过体外细胞抗病毒活性验证实验证明扎达维林能有效抑制新冠病毒 SARS-CoV-2对人肝癌细胞Huh7的感染和复制(IC50≈1μM)；匹莫苯和克立硼罗能有效抑制新冠病毒SARS-CoV-2对非洲绿猴肾细胞Vero-E6的感染和复制, IC50分别为约12μM和100μM；欧来米特不能对感染Vero-E6细胞的新型冠状病毒产生有效的抑制作用。细胞毒性方面，在最高药物试验浓度100μM上扎达维林未呈现细胞毒，匹莫苯和克立硼罗抑制不到一半细胞活力。据此，发现磷酸二酯酶抑制剂扎达维林对抗新型冠状病毒感染能力最强，且细胞毒性最低，是最有潜力的治疗新型冠状病毒肺炎的药物；其次为匹莫苯，最后为克立硼罗。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的扎达维林、匹莫苯、克立硼罗在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用，其特征在于，所述磷酸二酯酶抑制剂包括扎达维林、匹莫苯、克立硼罗中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述扎达维林为6-(4-二氟甲氧基-3-甲氧基苯基)-3(2H)-哒嗪酮；所述匹莫苯为6-[2-(4-甲氧基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基]-5-甲基-4,5-二氢-3(2H)-哒嗪酮；所述克立硼罗为4-[(1,3-二氢-1-羟基-2,1-苯并氧杂硼杂环戊烷-5-基)氧基]苯甲腈。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，扎达维林的结构如式I所示：
Figure FDA0002615897460000011
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，匹莫苯的结构如式II所示：
Figure FDA0002615897460000012
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，克立硼罗的结构如式III所示：
Figure FDA0002615897460000021
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述磷酸二酯酶抑制剂为纯净的扎达维林、匹莫苯或克立硼罗中的任意一种或至少两种的组合；或者所述磷酸二酯酶抑制剂由含有这三种磷酸二酯酶抑制剂中至少一种的原料提供。
7.根据权利要求1-6所述的应用，其特征在于，所述扎达维林的给药浓度为0.4μM-100μM；抑制50％的新型冠状病毒在Huh7细胞中复制的药物浓度为1μM；
优选地，所述匹莫苯的给药浓度为0.4μM-100μM；抑制50％的新型冠状病毒在Vero-E6细胞中复制的药物浓度为12μM；
优选地，所述克立硼罗的给药浓度为0.4μM-100μM；抑制50％的新型冠状病毒在Vero-E6细胞中复制的药物浓度为100μM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括所述扎达维林、匹莫苯或克立硼罗中的任意一种或至少两种的组合以及药学上可接受的载体。
9.根据权利要求1-8所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中扎达维林的重量百分含量为1-99％，优选1-90％；
优选地，所述药物组合物中匹莫苯的重量百分含量为1-99％，优选1-90％；
优选地，所述药物组合物中克立硼罗的重量百分含量为1-99％，优选1-90％。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗新型冠状病毒肺炎的药物的剂型为普通压制片、分散片、肠溶片、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、乳剂、散剂、口服液或注射剂中的任意一种。
CN202010769251.1A 2020-08-03 2020-08-03 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用 Pending CN114053280A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010769251.1A CN114053280A (zh) 2020-08-03 2020-08-03 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010769251.1A CN114053280A (zh) 2020-08-03 2020-08-03 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114053280A true CN114053280A (zh) 2022-02-18

Family

ID=80231791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010769251.1A Pending CN114053280A (zh) 2020-08-03 2020-08-03 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114053280A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111388476A (zh) * 2020-02-03 2020-07-10 中山大学 双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111388476A (zh) * 2020-02-03 2020-07-10 中山大学 双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肺部炎症药物中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAURO GIORGI等: "Phosphodiesterase Inhibitors: Could They Be Beneficial for the Treatment of COVID-19？", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》, no. 21, pages 1 - 11 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Azvudine is a thymus-homing anti-SARS-CoV-2 drug effective in treating COVID-19 patients
Meyer-Almes Repurposing approved drugs as potential inhibitors of 3CL-protease of SARS-CoV-2: Virtual screening and structure based drug design
Sun et al. SARS-CoV-2 quasispecies provides an advantage mutation pool for the epidemic variants
Radford et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology
Tan et al. Systems biology and the host response to viral infection
Day et al. Multidisciplinary approaches identify compounds that bind to human ACE2 or SARS-CoV-2 spike protein as candidates to block SARS-CoV-2–ACE2 receptor interactions
Deng et al. Identification of novel antipoxviral agents: mitoxantrone inhibits vaccinia virus replication by blocking virion assembly
CN111402968B (zh) 基于分子模拟发现山柰酚在covid-19病毒中的新用途
CN114053290A (zh) 人参皂苷或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用
Kamau et al. A novel benzodioxole-containing inhibitor of Toxoplasma gondii growth alters the parasite cell cycle
CN113289018A (zh) 金诺芬等老药及其组合物在抗单正链rna病毒中的应用
Luo et al. Identification of potential drugs for diffuse large b-cell lymphoma based on bioinformatics and Connectivity Map database
Ayyar et al. Repurposing–second life for drugs
Hersi et al. Discovery of novel papain-like protease inhibitors for potential treatment of COVID-19
Valipour et al. An overview on anti-COVID-19 drug achievements and challenges ahead
Teulière et al. Interactomics: dozens of viruses, co-evolving with humans, including the influenza A virus, may actively distort human aging
Hojka-Osinska et al. RNA-Seq-based analysis of differential gene expression associated with hepatitis C virus infection in a cell culture
CN114053280A (zh) 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用
Xing et al. Deciphering COVID-19 host transcriptomic complexity and variations for therapeutic discovery against new variants
CN111568909A (zh) 维生素D2在制备SARS-CoV-2新型冠状病毒抑制剂中的应用
WO2022027180A1 (zh) 磷酸二酯酶抑制剂或其药物组合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用
Zhu et al. Semen Cuscutae-Fructus Lycii improves spermatogenic dysfunction by repairing the blood-testis barrier in rats according to in silico and in vitro methods
Chen et al. Insights into targeting cellular senescence with senolytic therapy: the journey from preclinical trials to clinical practice
Sharma et al. Computational approaches for drug discovery against COVID-19
CN113855677A (zh) 奥西替尼在抗新冠病毒感染抑制剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination