CN113633640A

CN113633640A - 双嘧达莫或其药学上可接受的盐的新应用

Info

Publication number: CN113633640A
Application number: CN202110815757.6A
Authority: CN
Inventors: 姚兵; 薛同敏; 郑露; 赵山美子; 唐婷; 张红; 陈莉
Original assignee: Nanjing University; Nanjing Normal University; Nanjing Medical University; Eastern Theater General Hospital of PLA
Current assignee: Nanjing University; Nanjing Normal University; Nanjing Medical University; Eastern Theater General Hospital of PLA
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2021-11-12

Abstract

本发明公开了双嘧达莫或其药学上可接受的盐的新应用，包括双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备治疗PCOS药物中的应用、在体外非治疗性地改善哺乳动物生育能力方面的应用以及在IVM中的应用。实验结果表明双嘧达莫或其药学上可接受的盐能够显著改善PCOS模型小鼠的高雄激素血症、卵巢多囊改变、排卵异常和早期胚胎发育不良等相关症状，还能够促进卵母细胞成熟的生物学功能。

Description

双嘧达莫或其药学上可接受的盐的新应用

技术领域

本发明属于医药领域和辅助生殖-体外胚胎培养技术领域，具体涉及双嘧达莫或其药学上可接受的盐改善多囊卵巢综合征的高雄激素血症、卵巢多囊改变、排卵异常以及早期胚胎发育不良等相关症状的新应用。

背景技术

生育力下降目前已成为严重的社会问题，全球的不孕不育率达到10％-15％，生殖内分泌紊乱是目前导致女性不孕的首位病因。多囊卵巢综合征是育龄妇女常见的内分泌系统疾病，患者多表现为体内雄激素过多和持续无排卵状态，临床症状可见月经稀发或闭经、不孕、多毛和肥胖、双侧卵巢呈多囊样增大，在糖脂代谢方面出现胰岛素抵抗，继而引发糖尿病等并发症。

目前针对PCOS主要的药物治疗方法为通过口服避孕药、氯米芬、促性腺激素、促性腺激素释放类似物、二甲双胍等药物帮助患者改善月经周期、调节排卵异常及代谢异常。但是，口服避孕药常伴有恶心、呕吐、头晕、乳涨、白带增多等早孕反应，还会产生乏力、嗜睡、色素增加、食欲亢进、痤疮、月经过少或出血等问题；氯米芬会伴有潮热及多胎妊娠风险加大的问题；促性腺激素及促性腺激素释放类似物会增加多胎妊娠和卵巢过度刺激的风险；二甲双胍会产生胃肠道反应甚至乳酸性酸中毒。因此，如何提供一种可有效治疗PCOS的药物成为本领域亟需解决的技术难题。

双嘧达莫(dipyridamole)又名潘生丁，化学名为{2,6-二(二乙醇氨基)-4,8-二哌啶基-嘧啶并[5,4-d]嘧啶}(化学式：C24H40N8O4，CAS号：58-32-2)是一种磷酸二酯酶非选择性抑制剂，属于抗血小板聚集药、冠状动脉扩张药。双嘧达莫在肝内代谢，与葡萄糖醛酸结合，从胆汁排泌。双嘧达莫的结构如式(Ⅰ)：

上市后目前主要用于预防和治疗慢性冠脉循环机能不全、心肌梗死及弥散性血管内凝血。目前临床较多用作抗血小板用药。随着临床药学研究的深入发展，现已发现双嘧达莫具有广谱抗病毒作用和免疫调节作用，近期研究还发现双嘧达莫可逆转肿瘤细胞的多药耐药性，与抗肿瘤药物合用有协同或增效作用。而目前未见任何关于双嘧达莫可改善或提高雌性哺乳动物生育力的相关用途。

发明内容

本发明的第一个目的在于：提供双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备治疗PCOS药物中的应用。

技术方案：本发明给出了双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备治疗PCOS药物中的应用。

进一步的，双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备治疗PCOS药物后使用时，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为20～80mg/kg/day。

进一步的，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为50mg/kg/day。

本发明的第二个目的在于：提供一种治疗PCOS药物。

技术方案：本发明给出了一种治疗PCOS药物，治疗PCOS药物中包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

进一步的，治疗PCOS药物在使用时，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为20～80mg/kg/day。

进一步的，治疗PCOS药物的连续使用周期为6-10天，优选的为8天。

进一步的，治疗PCOS药物为胶囊、片剂、丸剂、栓剂、颗粒剂、冲剂、注射药或喷剂。

进一步的，治疗PCOS药物的给药方式为口服给药、非胃肠道给药、吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或者通过植入的贮药装置给药。

进一步的，非胃肠道给药包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、损伤部位内、颅内中至少一种方式的注射或输注给药。

本发明的第三个目的在于：提供双嘧达莫或其药学上可接受的盐在体外非治疗性地改善哺乳动物生育能力方面的应用。

技术方案：本发明给出了双嘧达莫或其药学上可接受的盐在体外非治疗性地改善哺乳动物生育能力方面的应用。

进一步的，改善哺乳动物生育能力方面包括降低哺乳动物雄激素水平、提高哺乳动物雌激素水平、改善哺乳动物卵巢多囊性改变、恢复哺乳动物排卵功能、改善哺乳动物卵母细胞质量和/或促进哺乳动物胚胎早期发育。

进一步的，雄激素包括脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮和/或睾酮；雌激素包括雌酮、雌二醇和/或雌三醇；卵巢多囊性改变的指标包括卵巢组织中的黄体数目和/或囊性卵泡数目；排卵功能的指标包括动情周期；卵母细胞质量的指标包括生发泡破裂和/或第一极体排出；早期胚胎发育的指标包括囊胚形成率。

进一步的，体外非治疗性地的应用方法包括给哺乳动物施用双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

进一步的，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的施用剂量为20～80mg/kg/day，优选的为50mg/kg/day。

进一步的，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的连续施用周期为6-10天，优选的为8天。

进一步的，施用的方法包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、口服法或灌胃法。

进一步的，哺乳动物为雌性哺乳动物。

进一步的，哺乳动物为患有多囊卵巢综合征的哺乳动物。

进一步的，患有多囊卵巢综合征的哺乳动物包括DHEA诱导的多囊卵巢综合征。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明的研究表明双嘧达莫对多囊卵巢综合征小鼠模型具有治疗作用，具体表现为：降低血清雄激素水平、提高卵母细胞质量及促进胚胎早期发育等，能够为多囊卵巢综合征提供了一种新的治疗选择。

附图说明

图1为不同剂量的双嘧达莫治疗PCOS模型雌鼠后，GV期卵母细胞生发泡破裂的差异(n＝3/组)。

图2为不同剂量的双嘧达莫治疗PCOS模型雌鼠后，GV期卵母细胞体外成熟的差异(n＝3/组)。

图3为不同治疗周期的双嘧达莫(治疗剂量为50mg/kg)GV期卵母细胞生发泡破裂的差异(n＝3/组)。

图4为双嘧达莫治疗周期梯度组(治疗剂量为50mg/kg)GV期卵母细胞成熟的差异(n＝3/组)。

图5为三组模型雌鼠动情周期的差异(a、b、c图为三组模型雌鼠的典型动情周期，d图为三组模型雌鼠一个完整典型动情周期的天数，n＝8/组，*表示P<0.05)。

图6为三组模型雌鼠典型卵巢切片HE染色(其中，*表示黄体，#表示囊状卵泡，n＝3/组)。

图7为三组模型雌鼠血清雌二醇水平(n＝10/组，*表示P<0.05)。

图8为三组模型雌鼠血清睾酮水平(n＝10/组，**表示P<0.01，***表示P<0.001)。

图9为三组模型雌鼠GV期卵母细胞体外成熟的显微镜下观察图(n＝3/组)。

图10为三组模型雌鼠GV期卵母细胞生发泡破裂的差异(n＝3/组，**表示P<0.01，ns表示P>0.05)。

图11为三组模型雌鼠GV期卵母细胞体外成熟的差异(n＝3/组，*表示P<0.05，***表示P<0.001)。

图12为三组模型雌鼠体外受精后早期胚胎发育(从二细胞期到囊胚期)的显微镜下观察图。

图13为三组模型雌鼠体外受精后早期胚胎发育(从二细胞期到囊胚期)的差异(**表示P<0.01，***表示P<0.001)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、实验材料：

SPF级ICR小鼠，3周龄，雌性，购自于斯贝福(北京)生物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2019-0010)，环境温度20-25℃，湿度50-70％，昼12h夜12h，自由摄食饮水。以下实施例所用的双嘧达莫，经HPLC检测，纯度≥98％，购自美国Sigma-Aldrich公司；DHEA(脱氢表雄酮)，购自美国Sigma-Aldrich公司。

二、实验方法：

动物分组：取雌性ICR(3周龄)小鼠，并随机分为对照组、PCOS模型组以及双嘧达莫治疗组(50mg/kg)，各组模型的构建方法如下：

(1)对照组(Oil+corn-oil组)：皮下注射芝麻油200μL，连续注射21天后，连续8天灌胃玉米油200μL(88％玉米油+10％无水乙醇+2％DMSO)。

(2)PCOS模型组(DHEA+corn-oil组)：皮下注射6mg/100g的脱氢表雄酮(DHEA)(品牌：Sigma，货号：D073)200μL，连续注射21天后，连续8天灌胃玉米油200μL(88％玉米油+10％无水乙醇+2％DMSO)。

(3)双嘧达莫治疗剂量梯度组(DHEA+DIP组)：皮下注射6mg/100g的脱氢表雄酮(DHEA)(品牌：Sigma，货号：D073)200μL，连续注射21天后，连续8天灌胃浓度分别为20mg/kg、35mg/kg、50mg/kg、65mg/kg、80mg/kg的双嘧达莫(品牌：Sigma，货号：D9766)200μL。

(4)双嘧达莫治疗周期梯度组(DHEA+DIP组)：皮下注射6mg/100g的脱氢表雄酮(DHEA)(品牌：Sigma，货号：D073)200μL，连续注射21天后，连续4天、6天、8天、10天灌胃50mg/kg的双嘧达莫(品牌：Sigma，货号：D9766)200μL。

三、实验例：

实验例1：将双嘧达莫不同治疗剂量的小鼠GV期卵母细胞在培养液(M2)中进行体外培养，观察卵母细胞体外成熟情况。

造模完成后即第30天18:00，小鼠经断颈处死后立即取卵巢组织，在显微镜下取得GV期卵母细胞，在M2中清洗裸卵，放置事先于37于、5％CO₂中平衡好的M2培养液中培养。于3h(即第30天21:00)及14h(即第31天8:00)观察并计数其GVBD及第一极体排出的发育情况及比例。观察其对于小鼠GV期卵母细胞体外成熟的影响，实验结果如图1和2所示：在使用剂量为20mg/kg/day、35mg/kg/day、50mg/kg/day、65mg/kg/day、80mg/kg/day的双嘧达莫治疗PCOS模型小鼠8天后，GV期卵母细胞体外成熟率均高于未使用双嘧达莫(0mg/kg/day)治疗，且以50mg/kg/day双嘧达莫治疗剂量的GV期卵母细胞体外成熟率最高，且具有统计学差异。

实验例2：将双嘧达莫不同治疗周期的小鼠的GV期卵母细胞在培养液(M2)中进行体外培养，观察卵母细胞体外成熟情况。

造模完成后即第30天18:00，小鼠经断颈处死后立即取卵巢组织，在显微镜下取得GV期卵母细胞，在M2中清洗裸卵，放置事先于37℃、5％CO₂中平衡好的M2培养液中培养。于3h(即第30天21:00)及14h(即第31天8:00)观察并计数其GVBD及第一极体排出的发育情况及比例。观察其对于小鼠GV期卵母细胞体外成熟的影响，实验结果如图3、4所示：50mg/kg/day双嘧达莫治疗PCOS模型小鼠6天、8天、10天后，GV期卵母细胞体外成熟率均高于未使用双嘧达莫(0mg/kg/day)治疗，且以50mg/kg/day双嘧达莫治疗8天时，GV期卵母细胞体外成熟率最高，且具有统计学差异。

综上实验例1、实验例2，以下所有实验中双嘧达莫治疗组均采用连续8天灌胃50mg/kg的双嘧达莫。

实验例3：观察3组小鼠的动情周期、卵巢组织形态学、血清性激素的测定分析。

(1)小鼠动情周期的观察

动情周期是评价小鼠性周期的一个重要标志，正常小鼠的动情周期为4-5天，分别为：动情前期(P)、动情期(E)、动情后期(M)和动情间期(D)。重复出现，动情周期紊乱是PCOS小鼠的一个重要特征。目前观察动情周期主要根据阴道细胞涂片的细胞学特征判断处于哪个时期。本实验例将3组实验动物中的8只小鼠从第22天开始，于每日下午同一时间取阴道细胞涂片，连续10天，用HE染色后观察细胞形态，并分别记录和统计实验结果。图5中(a)、(b)和(c)分别为对照组、PCOS模型组以及双嘧达莫治疗组的典型动情周期。其中，PCOS模型组小鼠的动情周期主要表现为周期天数的明显延长，属于动情周期紊乱的表现，表明PCOS模型构建成功。图5(d)为对照组(动情周期天数为5.75±2.18天)、PCOS模型组(动情周期天数为8.25±1.83天)以及双嘧达莫治疗组(动情周期天数为6±1.07天)中每只小鼠一个完整的典型动情周期的天数，其中PCOS模型组表现出动情周期天数的显著延长，双嘧达莫治疗后小鼠动情周期延长现象有所改善，并具有统计学差异(*表示P<0.05)。

(2)卵巢组织HE染色观察形态

造模完成后即第30天，3组实验动物中的各3只小鼠，经断颈处死后立即取得新鲜卵巢组织，进行固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片等步骤后用于HE染色，并记录实验结果。如图6所示：PCOS模型组小鼠卵巢组织与对照组相比，其黄体(*表示)数目减少，囊性卵泡(#表示)数量增多，表明PCOS模型构建成功。将PCOS模型组与双嘧达莫治疗组进行比较，可以明显看出双嘧达莫处理后小鼠卵巢组织中黄体(*表示)数目增多，囊性卵泡(#表示)数目降低。

(3)血清性激素的测定分析

造模完成后即第30天，3组实验动物中的各10只小鼠，分别经眼球采血法取得血液样本，采用ELISA法测定各组小鼠血液中的血清的睾酮和雌二醇水平，并记录和统计实验结果。血清性激素结果表明，PCOS模型组小鼠血清中雌二醇水平显著下调、睾酮水平显著上调。与PCOS模型组小鼠相比，双嘧达莫处理后血清雌二醇水平上升，睾酮水平显著下降，如图7、8所示：在PCOS模型组血清雌二醇平均水平为815±135.92pmol/L(n＝10只)，与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)，睾酮平均水平为54.94±15.84nmol/L(n＝10只)，与对照组相比具有统计学差异(P<0.001)，表明PCOS模型构建成功。双嘧达莫治疗组的小鼠的血清雌二醇平均水平为957.50±130.77pmol/L(n＝10只)，与PCOS模型组相比具有统计学差异(P<0.05)，睾酮平均水平为36.60±9.10nmol/L(n＝10只)，与PCOS模型组相比具有统计学差异(P<0.01)。表明双嘧达莫治疗PCOS模型小鼠后，可显著改善PCOS模型小鼠雌二醇水平降低、睾酮水平升高的症状。

实验例4：将3组小鼠的GV期卵母细胞在培养液(M2)中进行体外培养，观察卵母细胞体外成熟情况。

造模完成后即第30天18:00，小鼠经断颈处死后立即取卵巢组织，在显微镜下取得GV期卵母细胞，在M2中清洗裸卵，放置事先于37℃、5％CO₂中平衡好的M2培养液中培养。于3h(即第30天21:00)及14h(即第31天8:00)观察并计数其GVBD及第一极体排出的发育情况及比例。观察其对于小鼠GV期卵母细胞体外成熟的影响，实验结果表明：双嘧达莫治疗后可显著提高PCOS模型小鼠GV期卵母细胞体外成熟率，如图9、10和11所示。

图9为三组模型雌鼠GV期卵母细胞体外发育的显微镜下观察图，图10表示PCOS模型组小鼠的GV期卵母细胞的GVBD发生率平均为69.46±5.87％，与对照组相比，PCOS模型组小鼠的GV期卵母细胞的GVBD发生率显著降低，具有统计学差异(P<0.01)；双嘧达莫治疗组小鼠的GV期卵母细胞的GVBD发生率平均为76.17±7.48％，与PCOS模型组相比有所升高。图11表示PCOS模型组小鼠的GV期卵母细胞的体外成熟率平均为47.78±2.70％，与对照组相比，PCOS模型组小鼠的GV期卵母细胞的体外成熟率显著降低，具有统计学差异(P<0.001)。双嘧达莫治疗组小鼠的GV期卵母细胞的体外成熟率平均为66.24±8.09％，与PCOS模型组相比显著提高并且具有统计学差异(P<0.05)。

实验例5：将3组模型小鼠的早期胚胎(受精卵至囊胚期)在KSOM培养液在进行体外培养，观察胚胎早期发育情况。

造模完成后即第30天18:00腹腔注射孕马血清(PMSG)，10IU/只，48h后(即第32天18:00)腹腔注射绒促性素(hCG)，10IU/只。14h后(即第33天8:00)取雄性ICR小鼠(8周龄)，经断颈处死后立即取两侧附睾尾，放置事先于37℃、5％CO₂中平衡好的获能培养液中，用一次性1mL注射器针头挑破5～6次，获能1h备用。将注射hCG 14h后的ICR雌鼠断颈处死取双侧输卵管，在显微镜下收集卵丘卵母细胞复合物，放置事先于37℃、5％CO₂中平衡好的HTF受精培养液滴中，培养0.5h。取10μL获能好的精液加入先前的HTF受精培养液滴中，继续培养8h。去除异裂和未受精的卵母细胞，将受精卵放置事先于37℃、5％CO₂中平衡好的KSOM培养液中培养。在受精卵阶段、二细胞阶段、八细胞阶段、桑葚胚阶段和囊胚阶段对早期胚胎进行观察计数。实验结果表明：双嘧达莫治疗后可显著提高PCOS模型小鼠早期胚胎的成囊率，如图12和13所示。

图12为三组模型雌鼠体外受精后早期胚胎发育(从二细胞期到囊胚期)的显微镜下观察图。图13中，双嘧达莫治疗组的小鼠二细胞率为100％，八细胞率为97.62％，桑葚胚率为91.27％，囊胚率为88.10％；而PCOS模型组的小鼠二细胞率为100％，八细胞率为94.64％，桑葚胚率为83.93％，囊胚率为67.86％。因此，与PCOS模型组小鼠相比，双嘧达莫处理后，八细胞率、桑葚胚率都有上升，但差异没有统计学意义(P>0.05)；在囊胚率这一反映胚胎远期发育的重要指标中，有明显上升且差异有统计学意义(P<0.001)。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims

1.双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备治疗PCOS药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：双嘧达莫或其药学上可接受的盐在制备治疗PCOS药物后使用时，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为20～80mg/kg/day。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为50mg/kg/day。

4.一种治疗PCOS药物，其特征在于：治疗PCOS药物中包含双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的治疗PCOS药物，其特征在于：治疗PCOS药物在使用时，双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为20～80mg/kg/day。

6.根据权利要求5所述的治疗PCOS药物，其特征在于：双嘧达莫或其药学上可接受的盐的使用剂量为50mg/kg/day。

7.根据权利要求5所述的治疗PCOS药物，其特征在于：治疗PCOS药物的连续使用周期为6～10天。

8.根据权利要求4所述的治疗PCOS药物，其特征在于：治疗PCOS药物为胶囊、片剂、丸剂、栓剂、颗粒剂、冲剂、注射药或喷剂。

9.根据权利要求4所述的治疗PCOS药物，其特征在于：治疗PCOS药物的给药方式为口服给药、非胃肠道给药、吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或者通过植入的贮药装置给药。

10.根据权利要求9所述的治疗PCOS药物，其特征在于：非胃肠道给药包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、损伤部位内、颅内中至少一种方式的注射或输注给药。

11.双嘧达莫或其药学上可接受的盐在体外非治疗性地改善哺乳动物生育能力方面的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：改善哺乳动物生育能力方面包括降低哺乳动物雄激素水平、提高哺乳动物雌激素水平、改善哺乳动物卵巢多囊性改变、恢复哺乳动物排卵功能、改善哺乳动物卵母细胞质量和/或促进哺乳动物胚胎早期发育。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：雄激素包括脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、硫酸脱氢表雄酮和/或睾酮；雌激素包括雌酮、雌二醇和/或雌三醇；卵巢多囊性改变的指标包括卵巢组织中的黄体数目和/或囊性卵泡数目；排卵功能的指标包括动情周期；卵母细胞质量的指标包括生发泡破裂和/或第一极体排出；早期胚胎发育的指标包括囊胚形成率。

14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：体外非治疗性地的应用方法包括给哺乳动物施用双嘧达莫或其药学上可接受的盐。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：双嘧达莫或其药学上可接受的盐的施用剂量为20～80mg/kg/day。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：双嘧达莫或其药学上可接受的盐的连续施用周期为6-10天。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：施用的方法包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、口服法或灌胃法。

18.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：哺乳动物为雌性哺乳动物。

19.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：哺乳动物为患有多囊卵巢综合征的哺乳动物。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：患有多囊卵巢综合征的哺乳动物包括DHEA诱导的多囊卵巢综合征。