CN112294803A - 提高反刍动物妊娠率的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高反刍动物同期排卵定时输精的妊娠率的组合物及其制备方法和应用。所述组合物的有效成分为浓度10～20mg/mL的褪黑素。本发明通过动物实验证明，在反刍动物同期排卵定时输精方案中最后一次注射GnRH的同时配合使用本发明的所述组合物，能够调节动物机体内的生殖激素分泌，提高促黄体生成素LH和妊娠母畜的孕酮含量，提高卵子质量、促进排卵，进而提高反刍动物定时输精妊娠率。

Description

提高反刍动物妊娠率的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种提高反刍动物同期排卵定时输精的妊娠率的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
近年来由于奶牛养殖业中单产量的逐步提高，经产奶牛的配种妊娠率呈下降趋势，奶牛产犊间隔长，严重影响了经济效益。如何提高奶牛繁殖效率，成为制约产业发展的当务之急。同期排卵定时输精技术(Timed Artificial Insemination，TAI)是指一群奶牛在同一时期内发情并排卵，定时进行人工授精的技术。该技术使用效果好，效率高，在许多大型牧场中都有所应用。经典的同期排卵定时输精技术包括：Ovsynch方案(GnRH-PG-GnRH)、Presynch方案(PG-PG-GnRH-PG-GnRH)、Richard Pursley方案等。但是在实际应用中，这些方案处理要求高、处理时间长，与此同时大量使用GnRH及其类似物等药物对奶牛机体会产生相应的伤害：如抑制排卵、性腺萎缩等。因此，优化奶牛同期排卵定时输精技术方案，进一步满足生产需求，迫在眉睫。
褪黑素(Melatonin,MT)化学名称为N-乙酰基-5-羟色胺，是一种主要由松果体分泌的激素，具有强抗氧化性，在动物繁殖中具有重要的调控作用。在卵母细胞体外成熟过程中添加褪黑素，可以促进卵母细胞的体外成熟，提高体外受精或孤雌激活后胚胎发育潜力，这表明褪黑素直接参与卵母细胞成熟调控。在体内的研究发现，排卵前体内LH(luteinizing hormone，促黄体生成素)峰能引起卵巢颗粒细胞中的褪黑素I型受体(MT1)的表达水平急剧上升；而同一时期，卵丘细胞中的褪黑素合成酶AANAT的表达水平也极显著上升，引起卵泡液中的褪黑素水平升高。这表明，褪黑素是LH的下游信号分子，它通过受体MT1发挥作用。在MT1受体峰前注射5mg/kg剂量褪黑素能显著提高小鼠血清中孕酮含量，并上调黄体标志基因Akr1c18、Cyp11a1的表达。
经产母牛配种妊娠率低是影响奶牛生产效益的主要因素之一。在奶牛正常排卵过程中会产生大量的活性氧(ROS)，严重影响卵母细胞质量。
因此需要寻求一种有效可行的方法，清除排卵过程中的大量活性氧，提高卵母细胞质量，进而提高奶牛配种妊娠率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高反刍动物同期排卵定时输精的妊娠率和繁殖率的组合物及其制备方法和应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种提高反刍动物同期排卵定时输精的妊娠率和繁殖率的组合物，所述组合物的有效成分包含褪黑素。优选地，所述组合物的有效成分为褪黑素。
进一步地，所述组合物中，褪黑素的浓度为10～20mg/mL，相当于4.3×10-2～8.6×10-2mol/L。
作为优选的技术方案，所述褪黑素的浓度为15mg/mL。
进一步地，所述组合物中还含有无水乙醇和生理盐水。
优选地，所述无水乙醇与生理盐水的体积比为(1～3):(1～2)，更优选为3:2。
作为优选的技术方案，所述无水乙醇为纯度99％以上乙醇；所述生理盐水为0.9％生理盐水。
作为优选的技术方案，所述组合物中，无水乙醇与0.9％生理盐水的体积比为(1～3):(1～2)，优选为3:2。
更进一步地，所述组合物为注射剂。
第二方面，本发明提供了所述组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：将褪黑素溶于无水乙醇，然后加入生理盐水，操作过程避光进行。
作为优选的技术方案，本发明进一步提供了所述组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：将褪黑素溶于无水乙醇，然后添加0.9％生理盐水，操作过程避光进行。
第三方面，本发明提供了所述组合物或由上述方法制备的组合物在提高反刍动物同期排卵定时输精的妊娠率中的用途。
作为优选的技术方案，在本发明的所述用途中，在反刍动物同期排卵定时输精的GnRH-PG-GnRH或PG-PG-GnRH-PG-GnRH过程中，在最后1针注射GnRH的同时使用本发明所述的组合物或由上述方法制备的组合物，24～48小时后进行输精，优选在24小时后进行输精。
优选地，所述组合物在每只反刍动物中的用量以褪黑素计为7.5×10-2mg/kg～11.25×10-2mg/kg。
第四方面，本发明还提供了所述组合物或由上述方法制备的组合物在提高反刍动物同期排卵定时输精的繁殖率中的用途。
作为优选的技术方案，在本发明的上述各用途中，在反刍动物同期排卵定时输精的GnRH-PG-GnRH或PG-PG-GnRH-PG-GnRH过程中，在最后1针注射GnRH的同时使用本发明所述的组合物或由上述方法制备的组合物，24～48小时后进行输精，优选在24小时后进行输精。
优选地，所述组合物在每只反刍动物中的用量以褪黑素计为7.5×10-2mg/kg～11.25×10-2mg/kg。
第五方面，本发明所述的组合物或由本发明的方法制备的组合物以注射剂的形式施用。
进一步优选地，所述施用的方式为皮下注射。
作为优选的技术方案，在反刍动物同期排卵定时输精过程中，在最后一次注射GnRH的同时通过皮下注射施用本发明的所述组合物或由本发明的方法制备的组合物，以提高反刍动物妊娠率和/或繁殖率。
作为优选的技术方案，所述组合物在每只反刍动物中的用量以褪黑素计为7.5×10-2mg/kg～11.25×10-2mg/kg，优选7.5×10-2mg/kg～9.4×10-2mg/kg，更优选7.5×10- 2mg/kg。
进一步地，所述组合物的注射剂量为2～3mL，优选的注射剂量为2mL。
本发明所述的反刍动物选自奶牛、黄牛、水牛、山羊、绵羊、骆驼、羊驼、羚羊和牛羚。
本发明的有益效果在于：
本发明出乎意料的发现，利用褪黑素能提高奶牛同期排卵定时输精的妊娠率。将褪黑素与无水乙醇和生理盐水溶解制备注射剂，在奶牛同期排卵定时输精注射GnRH的同时配合注射本发明的褪黑素制剂，可以提高奶牛的妊娠率，这也为进一步开展提高奶牛繁殖效率的研究提供有益的参考。
本发明通过动物实验发现，以优选的实施方案为例，含有浓度为15mg/mL褪黑素的制剂能够使奶牛同期排卵定时输精的情期妊娠率提高11个百分点。这对于奶牛养殖业而言具有非常重要的意义和经济价值。
本发明在奶牛同期排卵定时输精方案中注射GnRH的同时体外注射褪黑素注射剂，能够有效降低活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)对卵子质量的损伤，促进排卵和精卵结合实现受精，排卵后形成功能黄体和孕酮的分泌。
此外，本发明通过动物实验还意外地发现，皮下注射褪黑素注射剂可以显著提高奶牛体内注射GnRH后8小时的LH和E2含量。这种激素变化在提高奶牛情期妊娠率方面有明显的促进作用。
本发明利用皮下注射褪黑素注射剂，可以清除排卵过程中的大量活性氧，提高卵母细胞质量；促进卵泡颗粒细胞黄体化，排卵后形成功能黄体。同时，褪黑素还可以调控其他生殖激素分泌，进而调控促进卵母细胞发育和精卵结合过程，最终提高奶牛配种妊娠率。该技术体系简单实用，操作性强。
附图说明
图1为本发明实验例1中荷斯坦奶牛同期排卵定时输精(PG-PG-GnRH-PG-GnRH方案)注射褪黑素注射剂示例图。
图2为本发明实验例1中荷斯坦奶牛同期排卵定时输精注射褪黑素注射剂后MT、FSH、LH含量变化图。
注射MT后MT、FSH、LH含量变化：
A：MT含量的变化：(4.3465±0.5286VS 2.986±0.3801)n＝20(单位：头)；
B：FSH含量变化：(2.482±0.24629VS 2.2096±0.11549)n＝25(单位：头)；
C：LH含量变化：(5.022±0.23237VS 4.2068±0.32362)n＝25(单位：头)。
所有数据采用平均值±标准误表示，*代表不同组别之间有显著性差异。
图3为本发明实验例1中荷斯坦奶牛同期排卵定时输精注射褪黑素注射剂后P、E2含量变化图。
注射MT后P、E2含量变化：
A：P含量变化：(0.1825±0.0235VS 0.1215±0.00898)n＝20(单位：头)；
B：E2含量变化：(11.678±0.88344VS 9.2776±0.60414)n＝25(单位：头)。
所有数据采用平均值±标准误表示，*代表不同组别之间有显著差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
褪黑素要求纯度达到99.9％。
实施例1.褪黑素注射剂制备方法
原料：褪黑素、无水乙醇。
制备方法：准确称量1.5g褪黑素，使用无水乙醇溶解于100mL容量瓶，搅拌均匀，然后再加入0.9％生理盐水，搅拌均匀，定容至100mL(无水乙醇:生理盐水＝3:2)，配制成15mg/mL的溶剂，最后分装成2mL的注射剂量，所有操作均在暗室中完成。
实施例2.奶牛同期排卵定时输精配合使用褪黑素注射剂技术体系
在奶牛同期排卵定时输精注射GnRH的同时配合注射褪黑素注射剂2-3mL(如图1)，32-35天B超妊娠检测或60天直肠把握法进行妊娠检测，统计妊娠率。
实施例3.皮下注射褪黑素对同期排卵奶牛生殖激素的调控分析
同实施例2，区别在于，在同期排卵定时输精到妊娠检测各阶段采集血液测定排卵奶牛相关生殖激素的变化。
实验例1.
1.同期排卵定时输精后奶牛体内MT的变化规律
经产荷斯坦奶牛25头(1-2胎)，奶牛的平均体重约400Kg，正常采食、饮水和挤奶。从同期排卵开始到定时输精后直至妊娠检测采集奶牛血液。用液相色谱法检测血清中MT浓度，测定结果见图2。
通过图2可知，荷斯坦奶牛采用PG-PG-GnRH-PG-GnRH方案同期排卵定时输精，注射最后一针GnRH时，注射褪黑素显著提高了血液中褪黑素含量(4.35±0.53VS 2.99±0.38)(P<0.05)。
2.同期排卵定时输精后奶牛体内其他生殖激素的变化规律
经产荷斯坦奶牛25头(1-2胎)，正常采食、饮水和挤奶。从同期排卵开始到定时输精后直至妊娠检测采集奶牛血液。检测血清中其他生殖激素含量变化，测定结果见图2、图3。
通过图2、图3可知，荷斯坦奶牛同期排卵定时输精中，注射最后一针GnRH时，注射褪黑素后，血液中LH含量显著提高(5.02±0.23VS4.21±0.32)(P<0.05)；E2含量显著增加(11.68±0.88VS 9.28±0.60)(P<0.05)；FSH含量无明显变化(2.48±0.25VS 2.21±0.12)(P>0.05)。30天妊检时，孕牛的孕酮含量显著提高(0.18±0.02VS 0.12±0.01)(P<0.05)。
3.奶牛同期排卵定时输精注射最后一次GnRH同时配合使用褪黑素注射剂对经产荷斯坦奶牛(1-3胎)产后同期排卵定时输精注射最后一次GnRH的同时注射实施例1中所制备注射剂2mL，采取随机注射的方式(隔一头注射的方式，第一头注射，第二头不注射，第三头注射，以此类推)。
4.奶牛妊娠率检测
配种50-60天后，采用直肠检查的方法对实验荷斯坦奶牛进行妊娠检查，或输精后32天利用B超、妊娠检测试剂盒统计妊娠率，发现经产奶牛同期排卵定时输精时注射本发明所述制剂，可以显著提高奶牛妊娠率36.42％(9.68/26.58)以上(见表1)，自然排卵时注射褪黑素注射剂显著提高妊娠率55.62％(14.60/26.25)以上(见表2)，统计定时输精和自然排卵配种奶牛妊娠率，注射褪黑素显著提高奶牛妊娠率44.85％(11.85/26.42)以上(见表3)。
表1注射褪黑素对定时输精荷斯坦奶牛配种妊娠率的影响
Figure BDA0002729072630000071
注：同列角标小写字母不同者表示组内差异显著(p<0.05)，字母相同表示差异组内不显著(p>0.05)；同列角标大写字母不同者表示组内差异显著(p<0.05)，字母相同表示差异组内不显著(p>0.05)。
表2注射褪黑素对自然排卵荷斯坦奶牛配种妊娠率的影响
Figure BDA0002729072630000081
注：同列角标小写字母不同者表示组内差异显著(p<0.05)，字母相同表示差异组内不显著(p>0.05)；同列角标大写字母不同者表示组内差异显著(p<0.05)，字母相同表示差异组内不显著(p>0.05)。
表3注射褪黑素对奶牛首次配种妊娠率的影响
Figure BDA0002729072630000082
注：同列角标小写字母不同者表示组内差异显著(p<0.05)，字母相同表示差异组内不显著(p>0.05)。
以上结果说明，在荷斯坦奶牛同期排卵定时输精最后一次注射GnRH时注射褪黑素后，体内褪黑素浓度显著增加。与此同时，注射GnRH后8小时体内LH与E2含量显著提高，促进奶牛发情排卵。GnRH促进FSH和LH分泌。LH促进成熟卵泡排卵。LH浓度升高后，可促进更多的成熟卵泡排卵，提高了排卵效率。与此同时，褪黑素可清除排卵过程中的活性氧，减少氧化应激损伤。褪黑素促进黄体形成，提高了妊娠母牛的孕酮含量，首次配种妊娠率显著提高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高反刍动物妊娠率和繁殖率的组合物，其特征在于，所述组合物的有效成分包含褪黑素。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的有效成分为褪黑素。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，褪黑素的浓度为10～20mg/mL。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有无水乙醇和生理盐水；
优选地，所述无水乙醇与生理盐水的体积比为(1～3):(1～2)，更优选为3:2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将褪黑素溶于无水乙醇，然后加入生理盐水，操作过程避光进行。
7.权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6所述的方法制备的组合物在提高反刍动物同期排卵定时输精的妊娠率中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，在反刍动物同期排卵定时输精的GnRH-PG-GnRH或PG-PG-GnRH-PG-GnRH过程中，在最后1针注射GnRH的同时使用权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6所述的方法制备的组合物，24～48小时后进行输精；
优选地，所述组合物在每只反刍动物中的用量以褪黑素计为7.5×10-2mg/kg～11.25×10-2mg/kg。
9.权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6所述的方法制备的组合物在提高反刍动物同期排卵定时输精的繁殖率中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，在反刍动物同期排卵定时输精的GnRH-PG-GnRH或PG-PG-GnRH-PG-GnRH过程中，在最后1针注射GnRH的同时使用权利要求1-5中任一项所述的组合物或权利要求6所述的方法制备的组合物，24～48小时后进行输精；
优选地，所述组合物在每只反刍动物中的用量以褪黑素计为7.5×10-2mg/kg～11.25×10-2mg/kg。
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