CN116036235A - 转录因子ets2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，本发明所述的药物以转录因子ETS2为活性成分，还包括在药学上可接受的辅料或辅助性成分。本发明从生化指标、免疫组织化学，基因表达水平等多个方面进行研究，发现转录因子ETS2缓解了肝衰竭的进展，可用于制备治疗肝功能衰竭的靶向药物；发现转录因子ETS2抑制了巨噬细胞炎症因子的表达，为治疗肝衰竭特别是爆发新肝衰竭提供了新途径。

Description

转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途
技术领域
本发明属于临床医学、分子医学与再生医学领域，具体地说，是一种转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途。
背景技术
肝功能衰竭是多种原因作用下的肝功能严重损害，常伴有肝内和肝外(循环，凝血，脑，肾)多器官衰竭的临床综合征，短期死亡率高，预后差。目前临床上除肝移植外，尚无有效的治疗手段。但由于供肝短缺，肝衰竭患者常常在等待移植的过程中死去。因此，寻找一种新的治疗途径具有重要的临床价值。
肝脏巨噬细胞是定植于肝脏的一类特殊细胞，是肝脏固有免疫的重要组成成分，参与了肝衰竭的发生、发展和转归。在肝衰竭早期，死亡的肝细胞通过DAMP/TLR信号通路作用于肝脏巨噬细胞启动系统性炎症反应。免疫失衡是肝衰竭的核心发病机制，强烈的系统性炎症反应及其伴随的反复败血症和多器官衰竭是患者死亡的重要原因。在疾病早期抑制系统性炎症反应被认为是有效的治疗手段。
ETS转录因子家族有一个保守的结构域，可以结合靶基因启动子的GGAA/T序列，其生物学功能包括细胞增殖、分化、凋亡等。转录因子ETS2是高度保守的转录因子ETS家族的成员，广泛表达于多种细胞，属于Ras/MAPK信号通路的核效应因子。其氨基酸序列为：
MNDFGIKNMDQVAPVANSYRGTLKRQPAFDTFDGSLFAVFPSLNEEQTLQEVPTGLDSISHDSANCELPLLTPCSKAVMSQALKATFSGFKKEQRRLGIPKNPWLWSEQQVCQWLLWATNEFSLVNVNLQRFGMNGQMLCNLGKERFLELAPDFVGDILWEHLEQMIKENQEKTEDQYEENSHLTSVPHWINSNTLGFGTEQAPYGMQTQNYPKGGLLDSMCPASTPSVLSSEQEFQMFPKSRLSSVSVTYCSVSQDFPGSNLNLLTNNSGTPKDHDSPENGADSFESSDSLLQSWNSQSSLLDVQRVPSFESFEDDCSQSLCLNKPTMSFKDYIQERSDPVEQGKPVIPAAVLAGFTGSGPIQLWQFLLELLSDKSCQSFISWTGDGWEFKLADPDEVARRWGKRKNKPKMNYEKLSRGLRYYYDKNIIHKTSGKRYVYRFVCDLQNLLGFTPEELHAILGVQPDTED
ETS2在不同的疾病，不同的组织或者细胞中发挥不同的作用。比如在滋养层细胞发育及胚胎血管形成期，ETS2可以调控上皮细胞的生长；在肿瘤发生过程中，ETS2可与p53突变体相互作用，改变p53募集的方向，影响p53的致瘤性。ETS2对巨噬细胞炎症的调控也起到重要作用。转录因子ETS2因子目前于胚胎发育、免疫和肿瘤发生等研究领域中报道较多，然而目前为止还没有ETS2在肝衰竭中的作用相关研究。同时，转录因子ETS2的氨基酸序列在本领域中的合理变形，均属于本发明技术方案要保护的范围。
发明内容
本发明正是针对现有技术存在的缺陷，提供了一种转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明公开了转录因子ETS2在制备治疗爆发性肝功能衰竭的药剂中的应用。
作为进一步地改进,本发明所述的药物以转录因子ETS2为活性成分，还包括在药学上可接受的辅料或辅助性成分。
作为进一步地改进，本发明所述的药物中转录因子ETS2的质量百分比含量为≥98％,其应用剂量为1～5000mg/kg。
作为进一步地改进，本发明所述的药剂的形式是片剂、粉剂、颗粒剂、针剂、胶囊、口服液或缓释剂。
作为进一步地改进，本发明所述的含转录因子ETS2的药剂的运输和贮存温度是2℃-8℃，湿度是45％-75％。
作为进一步地改进，本发明所述的含转录因子ETS2的药剂的应用温度是15℃-30℃，湿度是45％-75％。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明从生化指标、免疫组织化学，基因表达水平等多个方面进行研究，发现转录因子ETS2缓解了肝衰竭的进展，可用于制备治疗肝功能衰竭的靶向药物；发现转录因子ETS2抑制了巨噬细胞炎症因子的表达，为治疗肝衰竭特别是爆发新肝衰竭提供了新途径。
附图说明
图1为尾静脉注射AAV9-ETS2-shRNA调控小鼠肝衰竭动物实验示意图；
图2为实验组和对照组小鼠肝功能相关生化指标；
图3为H&E染色检测肝衰竭模型小鼠肝脏炎症细胞浸润和TUNEL染色检测肝细胞凋亡；
图4为qPCR检测实验组和对照组肝细胞炎症因子表达量。
图5为WB检测细胞ETS2表达量。
图6为qPCR检测巨噬细胞炎症因子基因表达。
图7为ELISA检测细胞上清炎症因子IL-6蛋白表达。
具体实施方式
本发明公开了一种转录因子ETS2系列药物治疗肝功能衰竭的新技术，下面结合附图和实施例来对本发明的技术方案作进一步地说明：
实施例1：敲降肝脏转录因子ETS2对小鼠肝衰竭进程的调控作用
动物模型：30只雄性C57BL/6小鼠(18-22g)随机分成两组，每组15只。每只小鼠腹腔注射800mg/kg D-GalN和20ug/kg LPS，造成爆发性肝功能衰竭模型。图1为尾静脉注射AAV9-ETS2-shRNA调控小鼠肝衰竭动物实验示意图。实验包括以下机组：
实验组1(对照组)：经尾静脉注射2*1012对照腺相关病毒AAV9-Ctrl TU/只，三周后，小鼠腹腔注射500ul D-GalN和LPS的生理盐水混合溶液。
实验组2(实验组)：经尾静脉注射2*1012腺相关病毒AAV9-ETS2-shRNA TU/只，三周后，小鼠腹腔注射500ul D-GalN和LPS的生理盐水混合溶液。
处死小鼠后，留取小鼠血清标本和肝组织。其中肝组织取相同部位多聚甲醛固定，备做石蜡切片，其余液氮冻存。
ELISA(试剂盒，南京建成生物研究所)检测小鼠血清肝功能指标ALT、AST，按照试剂盒说明进行操作。图2为实验组和对照组的ALT、AST水平，结果显示敲降肝脏转录因子ETS2后，肝衰竭小鼠的肝功能损伤加重。
肝组织石蜡切片分别进行苏木精-伊红染色和TUNEL染色，检测肝细胞损伤情况和炎症浸润情况。图3为实验组和对照组小鼠肝组织病理染色结果，结果显示，敲降肝脏转录因子ETS2后，肝衰竭小鼠的肝细胞凋亡增加，炎症细胞浸润增加。
取20mg肝组织于匀浆管中，加入1ml Trizol裂解液和磁珠研磨组织，Trizol法提取小鼠肝组织mRNA，取2μL RNA溶液于Nanodrop仪器定量。根据Nanodrop仪器定量结果，1％琼脂糖凝胶电泳检测。反转录采用诺唯赞公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒，按照试剂盒说明进行操作，得到cDNA。取上述cDNA模板进行PCR扩增，PCR试剂采用诺唯赞公司Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂，操作按照试剂盒说明。图4为实验组和对照组肝细胞炎症因子表达量，结果显示，敲降肝脏转录因子ETS2后，肝衰竭小鼠的肝组织炎症因子表达增加。
实施例2：转录因子ETS2影响肝脏巨噬细胞炎症因子表达的验证
1.利用Crispr-Cas9技术构建ETS2-/-的RAW264.7单克隆细胞株，
合成sgRNA寡核苷酸序列，构建重组真核表达质粒sgRNA-lentiCRISPRv2。转化至Tran5a感受态大肠杆菌，挑取单菌落，测序鉴定。sgRNA的序列如下
1-FCACCGCCAGCCTTTGACACCTTCGA
1-RAAACTCGAAGGTGTCAAAGGCTGGC
2-FCACCGCAAAAGGAGCAACGACGTCT
2-RAAACAGACGTCGTTGCTCCTTTTGC
将构建好的sgRNA-lentiCRISPRv2质粒和慢病毒包装辅助载体pH1、pH2质粒按照sgRNA-lentiCRISPRv2∶pH1∶pH2为9∶3∶1的比例混合，转染至293T细胞，48小时后收集细胞上清，纯化病毒。
感染前将RAW264.7巨噬细胞接种至12孔板，当细胞密度生长为80％左右，每孔加入sgRNA-Cas9慢病毒100ul、Polybrene(聚凝胺)6μg/mL，加入含10％血清的DMEM培养基补足至1mL，感染24小时后换液，用适浓度的嘌呤霉素筛选一周后，进行流式分选并培养，得到单克隆细胞株进行WB鉴定。图5为ETS2敲除细胞株的鉴定结果，结果显示成功构建了ETS2敲除的RAW264.7单克隆细胞株。
2.用LPS 100ng/ml干预野生株细胞和ETS2敲除的RAW264.7细胞株，6小时后qPCR检测炎症因子IL-1b，IL-6，TNF-a，CXCL1,CXCL2在mRNA水平的表达。同实施例一方法进行总RNA抽提，RNA经浓度测试后进行采用两步法qRT-PCR。图6为对照组和ETS2敲除细胞LPS干预后炎症因子的基因表达情况，结果显示敲除转录因子ETS2促进了巨噬细胞炎症因子mRNA水平的表达。
3.用LPS 100ng/ml干预野生株细胞和ETS2敲除的RAW264.7细胞株，12小时后ELISA(Raybiotech，US)检测细胞上清炎症因子IL-6的表达水平，按照试剂盒说明进行操作，图7为对照组和ETS2敲除细胞LPS干预后IL-6的在细胞上清的蛋白表达情况，结果显示敲除转录因子ETS2促进了巨噬细胞炎症因子蛋白水平的表达。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (6)

1.转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，其特征在于，所述的药物以转录因子ETS2为活性成分，还包括在药学上可接受的辅料或辅助性成分。
3.根据权利要求1所述的转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，其特征在于，所述的药物中转录因子ETS2的质量百分比含量为≥98％,其应用剂量为1～5000mg/kg。
4.根据权利要求2所述的转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，其特征在于，所述的药剂的形式是片剂、粉剂、颗粒剂、针剂、胶囊、口服液或缓释剂。
5.根据权利要求1或2或3所述的转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，其特征在于，所述的含转录因子ETS2的药剂的运输和贮存温度是2℃-8℃，湿度是45％-75％。
6.根据权利要求1或2或3所述的转录因子ETS2在制备治疗肝功能衰竭药物中的用途，其特征在于，所述的含转录因子ETS2的药剂的应用温度是15℃-30℃，湿度是45％-75％。
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