CN110840906A - 淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用 - Google Patents

Abstract

淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用。本发明提供了淫羊藿苷(ICA)在制备治疗缺氧性肺动脉高压(HPH)药物中的应用，涉及肺动脉高压的防治技术领域。在本发明实施例中，20mg·kg^‑1ICA在缓解HPH的同时可以明显缓解低氧诱导的HIF‑1α蛋白水平的增加，并且与HIF‑1α抑制剂Acr具有相同的效应。因此ICA可以通过抑制HIF‑1α介导的炎症反应缓解HPH；HPH小鼠肺内TNF‑α和p‑NF‑κB蛋白表达剧增，提示HPH小鼠肺组织炎症水平升高。ICA在改善HPH病理特征的同时能够降低TNF‑α和p‑NF‑κB蛋白的表达量，说明ICA可能通过抑制TNF‑α/NF‑KB信号通路降低小鼠肺组织炎症水平，从而缓解HPH。

Description

淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用

技术领域

本发明属于肺动脉高压的防治技术领域，具体涉及淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用。

背景技术

氧性肺动脉高压(HPH)可分为急性和慢性两种，急性缺氧性肺动脉高压以肺血管收缩为主要病理特征，肺小动脉最为明显。慢性缺氧性肺动脉高压除血管收缩外，伴有显著的肺血管重构和纤维化改变。急、慢性缺氧性肺动脉高压病程中，在病变血管区可见明显的炎症反应。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是介导低氧性炎症的重要信号分子。巨噬细胞和中性粒细胞中的HIF-1在低氧条件下被激活，它的过度表达可增强NF-κB p65核定位与转录活性，促进上皮细胞分泌大量的趋化因子和肿瘤坏死因子(TNF-α)，TNF-α可促进成纤维细胞NF-κB的表达。同时低氧诱导细胞分泌的炎症因子又可诱导NF-κB活化，增加HIF-1表达，加剧了细胞缺氧，形成了低氧性炎症、炎症性低氧与HPH的恶性循环。

近二十年来，随着对肺动脉高压的病理及各种药物作用通路的认识和理解，药物治疗有了很大的进展。在阻止HPH的发生发展过程中，现有的药物治疗主要涉及三种途径，前列环素途径、内皮素途径及一氧化氮(NO)-鸟苷酸环化酶(SGC)-环磷酸鸟苷(cGMP)途径。针对这3种途径所开发的药物包括前列环素及其类似物、内皮素受体拮抗剂和磷酸二酯酶-5抑制剂等，这些药物的开发和应用在当前HPH的治疗中发挥了重要的作用。但由于无法克服的副作用和昂贵的治疗费用使得这些治疗药物的临床应用受到了极大的限制。内皮受体拮抗剂会导致男性生殖功能萎缩或不育，或伴随包括潜在的肝毒性、贫血及水肿等副作用,磷酸二酯酶抑制剂的副反应包括头痛、流鼻血、颊红及消化不良等；此外，大多数的前列腺素类药物药理性质不稳定，皮下注射后回产生疼痛及局部出现红疹。其他的副作用有头痛、恶心、皮疹和腹泻。所以这些现有的药物治疗前景很不乐观，寻找新的治疗药物是亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种淫羊藿苷(ICA)在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用，淫羊藿苷可有效改善缺氧诱导的小鼠肺动脉高压，其机制与抑制HIF-1α/TNF-α/NF-κB信号通路有关。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用。

优选的，在治疗缺氧性肺动脉高压时，所述药物的用量以淫羊藿苷计为10～20mg/kg。

本发明提供了淫羊藿苷在抑制HIF-1α/TNF-α/NF-κB信号通路中的应用。

本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用，在小鼠模型中进行验证，结果表明与空白组相比，模型组大鼠体重和肺动脉血流速度减小，RVHI显著升高，右心室功能减弱，肺小动脉重构和纤维化明显，且HIF-1α、TNF-α、p-NF-κB蛋白量显著增加。ICA 10mg/kg仅对部分指标有改善作用，ICA20mg/kg和Acr对上述指标均有明显的改善作用。因此淫羊藿苷可有效改善缺氧诱导的小鼠肺动脉高压，其机制与抑制HIF-1α/TNF-α/NF-κB信号通路有关。

附图说明

图1为ICA对HPH模型小鼠体重的影响，其中n＝6～10；

图2为ICA对肺小动脉形态学的影响，比例尺为50μm；

图3为ICA对肺血管纤维化的影响，比例尺为50μm；

图4为ICA对小鼠肺组织炎症相关蛋白的影响。

具体实施方式

本发明提供了淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用。

本发明利用所述药物治疗缺氧性肺动脉高压时，所述药物的用量优选以淫羊藿苷计为10～20mg/kg。本发明对所述淫羊藿苷(单体，分子式为C₃₃H₄₀O₁₅，分子量676.65)的来源并没有特殊限定，在本发明实施例中，优选购于南京泽朗医药科技有限公司。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规药物剂型即可。本发明对所述药物中的辅料种类和用量没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。

本发明提供了淫羊藿苷在抑制HIF-1α/TNF-α/NF-κB信号通路中的应用。

在本发明中，HIF-1的活性亚基HIF-1α是主要的氧敏感转录调节器，参与了机体炎症反应的发展过程。在低氧状态下，HIF-1的mRNA和蛋白表达剧烈增加，并且与缺氧时间和氧浓度呈正相关，它可上调血管内皮生长因子及受体的表达，增强局部血管的通透性，致使更多的炎症细胞迁移至炎症部位，引起肺血管内皮细胞的损伤。在本发明实施例中，低氧环境下，小鼠肺内HIF-1α蛋白表达明显升高，20mg·kg^-1ICA在缓解HPH的同时可以明显缓解低氧诱导的HIF-1α蛋白水平的增加，并且与HIF-1α抑制剂Acr具有相同的效应。因此ICA可以通过抑制HIF-1α介导的炎症反应缓解HPH。

同时，在本发明实施例中，检测了小鼠肺组织TNF-α和NF-κB的活化形式p-NF-κB蛋白的含量，结果表明HPH小鼠肺内TNF-α和p-NF-κB蛋白表达剧增，提示HPH小鼠肺组织炎症水平升高。ICA在改善HPH病理特征的同时能够降低TNF-α和p-NF-κB蛋白的表达量，说明ICA可能通过抑制TNF-α/NF-KB信号通路降低小鼠肺组织炎症水平，从而缓解HPH。

下面结合实施例对本发明提供的淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、药品、试剂与仪器

淫羊藿苷(纯度＞98％)购于南京泽朗医药科技有限公司(双蒸水溶解)；

Acr(吖啶黄,acriflavine，sigma公司，双蒸水溶解)；

Masson染色试剂盒(索莱宝公司)；

HIF-1α抗体、TNF-α抗体、NF-κB，和p-NF-κB抗体均购自Abcam公司，产品编号分别为ab1，ab1793，ab16502，ab86299；

β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、BCA蛋白定量试剂盒购自Beyotime；

小动物超声仪(Visualsonics INC公司，Vevo 2100)；

显微镜和图像分析系统(Nikon公司，TE2000-S)；

电泳仪凝胶成像分体系统(Bio-Rad公司，Chemi Dos Xps)；

低氧仓(Tokaihit公司，GM-8000)；

2、实验动物

C57小鼠，雄性，清洁级，体重20～25g，购买于重庆滕鑫实验动物公司，许可证号：SCXK(渝)2012-0005，实验动物饲养许可证号：SYXK(黔)2014-003。

3、小鼠分组与给药

小鼠适应性喂养一周后，随机分为空白组，模型组，ICA低剂量组(10mg·kg^-1·d^-1)，ICA高剂量组(20mg·kg^-1·d^-1)，Acr组(15mg·kg^-1·d^-1)，每组10只。空白组于常氧下饲养，其余各组于含氧量为10％低氧仓饲养，利用碱石灰吸收仓内二氧化碳，发现低氧组小鼠肺动脉血流速度明显降低，并伴有右心室肥厚、肺小血管重构和肺纤维化，超声结果显示右心室短轴缩短率升高，射血分数降低，收缩末期容积增加，每搏输出量减少，收缩直径增大，这些指标均证明小鼠收缩功能减弱，与肺动脉高压病理特点一致，提示HPH模型建立成功。

第8天开始按分组灌胃给药，空白组和模型组给予等体积双蒸水，每天固定时间给药一次，连续14天。每周称量小鼠体重，并记录死亡率(数据以

表示，采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD法，方差不齐采用Games-Howell法，P<0.05差异有显著意义，下同)。

结果如图1所示，空白组小鼠活跃，皮毛光亮，体重逐渐增加，实验过程无死亡，模型组小鼠精神萎靡，皮毛无光泽，活动减少，体重逐渐减小，死亡率为40％，给予ICA和Acr后，ICA低剂量组一般情况未见明显改善，死亡率40％。ICA高剂量组和Acr组小鼠活动增加，体重呈缓慢上升趋势，小鼠死亡率均为30％。

4、小动物超声检测小鼠肺动脉血流及右心功能

末次给药2h后腹腔注射10％水合氯醛(2mL·kg^-1)麻醉，脱毛，涂抹耦合剂，选择MS400探头(25-40HZ)，PW Mode检测小鼠肺动脉血流，M Mode检测右心室血流动力学。

分离心脏，去除心耳，分离右心室，分别称量右心室、左心室与室间隔的重量，计算右心室肥厚指数(right ventricle hypertrophy index,RVHI)；即右心室重量/(左心室+室间隔重量)×100％。

结果如表1和表2所示，模型组肺动脉血流速度明显降低，仅为空白组的51.5％，给予ICA和Acr后，肺动脉血流速度增加，其中ICA高剂量组与Acr组与模型组比较有统计学差异。模型组RVHI显著高于空白组，给药两周后，ICA高剂量组RVHI明显降低，与Acr作用相似；模型组FS、EF和SV明显低于空白组，VS和DS显著高于空白组。ICA低剂量仅对FS、EF和DS异常具有改善作用，ICA高剂量组和Acr组FS、EF和SV较模型组明显增加，VS和DS较模型组明显降低。

表1 ICA对HPH模型小鼠血流速度和右心室肥厚指数的影响(n＝6-10)

其中，表1中数据经单因素方差分析，LSD法两两比较，与对照组比较，^cP<0.01；与模型组比较，^dP＞0.05；^eP<0.05；^fP<0.01。

表2 ICA对HPH小鼠右心功能的影响(n＝6-10)

注：表2中数据经单因素方差分析，LSD法两两比较，与对照组比较，^cP<0.01；与模型组比较，^dP＞0.05；^eP<0.05。

5、H&E染色检测小鼠肺血管重构

操作步骤如下：4％多聚甲醛固定—包埋--切片—脱蜡—苏木素染色-自来水冲洗—盐酸乙醇分化—返蓝—伊红染色—脱水封片，倒置显微镜拍照，每张片子随机拍摄5个视野。

结果如图2所示，图2中A表示空白组；B表示模型组；C表示ICA低；D表示ICA高；E表示Acr组；箭头指向肺小动脉；空白组血管细胞排列有序，血管壁无增厚，血管腔无狭窄。模型组血管细胞排列紊乱，血管壁明显增厚，血管腔明显狭窄。ICA高剂量组和Acr组血管壁病理变化明显改善。

6、Masson染色检测小鼠肺血管纤维化

该操作严格按照说明书执行，步骤如下：切片--脱蜡--苏木素染色--盐酸乙醇分化--Masson蓝化液返蓝--丽春红染色--弱酸处理--磷钼酸清洗--苯胺蓝染色--无水乙醇脱水--二甲苯透明--封片，倒置显微镜拍照，每张片子随机拍摄5个视野。

结果如图3所示，图3中A表示空白组；B表示模型组；C表示ICA低；D表示ICA高；E表示Acr组；蓝色区域即为胶原纤维，可见模型组小鼠肺血管周围胶原纤维沉积较空白组明显增多，ICA和Acr干预后，胶原纤维沉积较模型组明显减少。ICA低高剂量组相比，高剂量组胶原纤维沉积少于低剂量组。

综上可知，ICA20 mg·kg^-1可明显缓解HPH小鼠体重降低，降低RVHI，增加肺动脉血流，改善肺小动脉重构以及肺血管纤维化，同时，各项心功能指标均趋于正常值，表明ICA对HPH具有良好的改善作用。ICA 10mg·kg^-1对部分指标有改善作用，证明10mg·kg^-1接近ICA治疗HPH的最低剂量。

7、Westernblot测定肺组织蛋白量

称取肺组织，每15mg组织用10μL RIPA裂解液，将组织在裂解液中剪碎，超声20min后置于4℃冰箱裂解1h，3500r/min、4℃离心5min，收集上清液，BCA试剂盒测量上清液蛋白浓度，调整蛋白浓度，并加入上样缓冲液，95℃变性5min，上样量为15μg/泳道，上样体积为10μL/泳道。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转至PVDF膜，经5％脱脂牛奶封闭2h，HIF-1α抗体(5μg/mL)、TNF-α抗体(1:100)和NF-κB抗体(0.5μg/mL)，p-NF-κB抗体(1:2000)和β-actin抗体(1：1000)4℃孵育约12h。PBS清洗3次后使用二抗室温孵育2h。ECL发光液孵育1min，经凝胶成像系统曝光成像，经Image J软件测定条带灰度值，计算目的蛋白与β-actin条带灰度值之比。

结果如图4所示，其中数据经单因素方差分析，LSD法两两比较，与对照组比较，^bP<0.05；^cP<0.01；与模型组比较，^dP＞0.05；^eP<0.05；^fP<0.01。图4中A表示各蛋白代表性条带；B表示HIF-1α条带灰度值统计图；C表示TNF-α条带灰度值统计图；D表示p-NF-κB/NF-κB条带灰度值统计图；模型组HIF-1α、TNF-α和p-NF-κB蛋白水平明显高于空白组，ICA低剂量组各蛋白水平与模型组无明显差异，ICA高剂量和Acr能显著降低各蛋白水平。

综上可知，在低氧环境下，小鼠肺内HIF-1α蛋白表达明显升高，20mg·kg-¹ICA在缓解HPH的同时可以明显缓解低氧诱导的HIF-1α蛋白水平的增加，并且与HIF-1α抑制剂Acr具有相同的效应。因此ICA可以通过抑制HIF-1α介导的炎症反应缓解HPH；HPH小鼠肺内TNF-α和p-NF-κB蛋白表达剧增，提示HPH小鼠肺组织炎症水平升高。ICA在改善HPH病理特征的同时能够降低TNF-α和p-NF-κB蛋白的表达量，说明ICA可能通过抑制TNF-α/NF-KB信号通路降低小鼠肺组织炎症水平，从而缓解HPH。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.淫羊藿苷在制备治疗缺氧性肺动脉高压药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，在治疗缺氧性肺动脉高压时，所述药物的用量以淫羊藿苷计为10～20mg/kg。

3.淫羊藿苷在抑制HIF-1α/TNF-α/NF-κB信号通路中的应用。

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