CN117159689A - 主要尿蛋白促进创伤愈合和减轻炎症的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了主要尿蛋白促进创伤愈合和减轻炎症的应用。通过在体动物及人离体细胞实验发现，主要尿蛋白能够促进血管新生、显著缩短伤口愈合时间，同时减轻炎症。实验结果表明，主要尿蛋白具有作为药物活性成分进行相关临床应用的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及MUPs制备促进创伤愈合和减轻炎症相关疾病药物的应用。
背景技术
血管新生是在原来存在的血管结构上长出新血管的生物学过程，是由于细胞－细胞、细胞－基质及细胞－细胞因子相互作用的结果。血管新生的发生可促进伤口愈合这一过程，具有非常重要的生理意义。另外，炎症是很多疾病的病理基础和临床表现，因此，寻找可改善炎症的药物为诸多疾病的防治提供新方案和策略。
主要尿蛋白(major urinary protein，MUPs)是能够结合小分子物质的一类脂质运载蛋白。中国专利CN113616777A指出MUP1为肝脏内质网应激抑制剂，并具有改善胰岛素抵抗和治疗糖尿病的作用；还有研究发现血小板因子4(PF4)和MUPs在LPS刺激后的大鼠血清中表达量均升高，且通过减少炎症反应过程中产生的PF4，可以降低炎症反应引起的高凝状态(“应用MALDI-TOF-MS技术筛选异丙酚对内毒素血症大鼠有影响的血清蛋白”，南方医科大学，2010)。但目前未见到有关MUPs本身具有加快血管新生、促进创口愈合，以及抑制炎症反应发生的作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供主要尿蛋白促进创伤愈合和减轻炎症的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
主要尿蛋白在制备用于促进创伤愈合的药物中的应用。
优选的，所述主要尿蛋白可以促进血管新生。
优选的，所述用于促进创伤愈合的药物的作用机制是通过主要尿蛋白的干预增加了血管内皮生长因子的表达水平，从而加快组织的血管新生，实现了对创伤愈合的促进作用。
优选的，所述用于促进创伤愈合的药物的作用方式包括通过增加创伤组织主要尿蛋白的水平，来实现对该创伤组织的基因水平和/或蛋白水平的调节。
优选的，所述用于促进创伤愈合的药物是由主要尿蛋白(如MUP15)和药物辅料制成。
主要尿蛋白在制备用于减轻炎症的药物中的应用。
优选的，所述主要尿蛋白可以减轻损伤局部或血管内皮炎症。
优选的，所述用于减轻炎症的药物的作用机制是通过主要尿蛋白的干预抑制了NLRP3炎症小体的激活，进一步降低白介素-18及白介素-1β等相关炎症因子的水平，从而抑制炎症反应。
优选的，所述用于减轻炎症的药物的作用方式包括通过增加损伤局部或循环系统主要尿蛋白的水平，来实现对损伤局部或血管内皮炎症因子的调节。
优选的，所述用于减轻炎症的药物是由主要尿蛋白(如MUP15)和药物辅料制成。
本发明的有益效果体现在：
本发明依据主要尿蛋白显著促进局部组织血管新生的作用，及主要尿蛋白在促进创伤愈合过程中所发挥的缩短伤口愈合时间方面的显著效果，证明主要尿蛋白(如MUP15)可以用于促进创伤愈合的药物的制备。同时本发明还利用炎症模型证明主要尿蛋白(如MUP15)具有显著抑制炎症反应的作用，从而可以用于减轻炎症的药物的制备。基于主要尿蛋白作为有效干预手段并用于制备促进创伤愈合和减轻炎症的药物，本发明还提出主要尿蛋白可以用于防治缺血性疾病的药物的制备。
附图说明
图1为MUP15蛋白检测胶图。
图2为MUP15蛋白纯化胶图。
图3为MUP15对伤口愈合的促进作用在体动物实验结果：A.两组小鼠伤口愈合的大体图像；B.伤口面积变化统计图，n＝3，*P<0.05，对照组vs.给药组，伤口面积变化＝(前一天伤口面积-后一天伤口面积)/前一天伤口面积×100％。
图4为MUP15促进组织血管新生在体动物实验结果：A.基质胶皮下埋置模型示意图(凝固后取出并记录的图像)；B.组间对比的大体图像。
图5为MUP15对内皮细胞增殖、蛋白表达、迁移、成管和出芽过程影响的体外实验验证结果：A.CCK8实验检测MUP15对内皮细胞增殖的作用，n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组相比；B.WB(Western Blot)检测MUP15对内皮细胞增殖相关蛋白表达水平的影响，n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与对照组相比；C.划痕实验检测MUP15对内皮细胞迁移能力的影响，n＝8，**P<0.01，与对照组相比，细胞迁移率＝(0小时划痕面积-12小时划痕面积)/0小时划痕面积×100％；D.成管实验检测MUP15对内皮细胞成管能力的作用，n＝8，*P<0.05，与对照组相比；E.出芽实验检测MUP15对血管环的血管出芽能力的影响，n＝6，**P<0.01，与对照组相比。
图6为MUP15对单钠尿酸盐(MSU)诱导的膝关节炎具有抑制作用的在体动物实验结果：A.24h内关节宽度变化；B.IL-1β表达水平；C.IL-18表达水平；n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例是对本发明的解释，而不是限制本发明的保护范围。
(一)MUP蛋白的制备
通过比对来源于小鼠MUPs家族所有22个MUP蛋白(MUP1\MUP2\MUP3\MUP4\MUP5\MUP6\MUP7\MUP8\MUP9\MUP10\MUP11\MUP12\MUP13\MUP14\MUP15\MUP16\MUP17\MUP18\MUP19\MUP20\MUP21\MUP22)，结果表明不同MUP蛋白之间序列高度保守。故任选其中1个MUP蛋白(具体为MUP15)为目的蛋白进行表达实验，并对所得目的蛋白表达产物进行鉴定，从而利用通过表达获得的MUP蛋白进行后续实验。
1.1MUPs家族的蛋白
MUP1：
MKMLLLLCLGLTLVCVHAEEASSTGRNFNVEKINGEWHTIILASDKREKIEDNGNFRLFLEQIHVLENSLVLKFHTVRDEECSELSMVADKTEKAGEYSVTYDGFNTFTIPKTDYDNFLMAHLINEKDGETFQLMGLYGREPDLSSDIKERFAQLCEKHGILRENIIDLSNANRCLQARE
MUP2：
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MUP3：
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MUP4：
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MUP5：
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MUP6：
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MUP7：
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MUP10：
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MUP11：
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MUP12：
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MUP13：
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MUP15：
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MUP16：
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MUP17：
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MUP18：
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MUP19：
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MUP20：
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MUP21：
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MUP22：
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1.2MUP蛋白的表达与分离鉴定
(1)MUP15蛋白表达载体来源：ABclonal公司合成。
(2)连接产物鉴定过程：蛋白表达使用HEK293 cells进行转染，转染前活细胞密度在2.5×10^6个/mL左右，转染后保证细胞活率在95％以上。24h后往培养基中添加补料继续培养，3～4天后收集培养的细胞。将收集到的细胞上清(细胞和培养基一并离心后所得上清)样本进行WB检测，以此确定目的蛋白表达情况，WB检测条件及电泳结果如图1所示(条带大小18.6kDa)，表达的MUP15为带his标签的蛋白，使用对应his标签抗体检测。
(3)使用Ni柱进行表达产物的分离纯化：
通过含有咪唑的平衡缓冲液对基质(填料)进行平衡，加入细胞上清进行孵育。孵育之后进行洗脱，将上清中非特异性的结合在Ni柱上的蛋白洗脱下来，再使用多梯度咪唑洗脱目的蛋白MUP15，目的蛋白最终在40mM、80mM、250mM、500mM的咪唑溶液中被洗脱下来，如图2所示(上：细胞上清；FT、W：<40mM低浓度咪唑以去除非特异性结合蛋白；-1：相应浓度咪唑洗脱第一遍；-2：相应浓度咪唑洗脱第二遍；基质：用所有咪唑溶液洗脱目的蛋白后，以确定将目的蛋白全部洗脱)。将洗脱得到的纯度较高的目的蛋白使用pH7.4的PBS缓冲体系对其进行透析换液和浓缩，再测定MUP15蛋白溶液浓度，并用鲎试剂检测法确定MUP15蛋白溶液内毒素含量<0.1EU/μg，此时就得到了后续实验所用的MUP蛋白。
(二)MUPs干预实验
2.1MUPs加速小鼠伤口愈合
将8周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为两组，即对照组、给药组。戊巴比妥钠(0.5％)麻醉小鼠，背部脱毛后，在背部脊柱两侧用6mm孔径的皮肤穿孔器制作2个创口，随后细心照看直至小鼠苏醒，然后正常饲养。在创口愈合的过程中，每个奇数天注射0.25mg/kg体重的MUP蛋白(在0.2mL的生理盐水中溶解稀释)，分4点注射到小鼠每个创口边缘。每隔一天对创口进行拍照(图3A)，通过Image J对创口面积大小进行量化并计算伤口面积变化。
通过统计对照组(生理盐水)与给药组(MUP蛋白)每只小鼠的创面的变化，发现与对照组相比，给药组创口愈合速度加快，在第五天出现统计学差异(P<0.05，图3B)。结果表明给予MUP蛋白，小鼠伤口愈合时间显著缩短，提示MUPs可以促进小鼠创伤愈合。
2.2MUPs增加基质胶内血管密度
将8周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为两组，即实验组与对照组。戊巴比妥钠(1％)麻醉小鼠，仰卧固定于鼠板，尾部朝向操作者，对后肢根部消毒，将生理盐水(对照组)或溶于生理盐水中的MUP蛋白(实验组，0.5mg/kg)等体积与基质胶混匀，随后用1mL注射器分别吸取冰水浴中混匀的基质胶稀释物0.5mL，迅速注入小鼠腹股沟皮下区域，保持小鼠固定约30分钟以确保基质胶稀释物完全凝固为胶体(图4A)，随后细心照看直至小鼠苏醒。然后正常饲养，一周后取出基质胶稀释物，用数码相机记录胶体大致图像(图4B)。结果发现，混合有MUP蛋白的基质胶里血管密度显著增加(n＝3，P<0.01，对照组vs.实验组)，提示MUPs可以促进血管新生。
2.3MUPs对内皮细胞的增殖、蛋白表达、迁移、成管和出芽过程的影响
(1)将人主动脉内皮细胞(购买于上海拜力生物科技有限公司)接种于96孔板，密度为0.4×104个/孔，分别作用不同浓度MUP蛋白，细胞于96孔板培养24h后，每孔内加入CCK-8 10μL孵育细胞1h，再用酶标仪读数(波长为490nm)，参照标准曲线计算出细胞数量。结果显示与未经过MUP蛋白处理(对照组)相比，MUP蛋白能够显著增加内皮细胞增殖速度(图5A)，且无毒性浓度范围为0.001μg/mL至10μg/mL。
(2)将人主动脉内皮细胞分别用0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL的MUP蛋白进行处理，处理结束后的细胞去除培养液，用PBS清洗细胞2次，并加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用细胞刮刀将细胞刮下来，并吸入离心管中，震荡离心管，冰上放置10分钟，再次震荡，在4℃、12000rpm的速度下离心15min，取出上清，进行BCA定量并调平，加入5×LoadingBuffer和RIPA裂解液，将各组蛋白调至同一浓度后，100℃条件下金属浴煮沸10min。随后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品(20μg)，并将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转印完成的膜与一抗进行孵育结合，然后将膜用5％脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物标记的二抗进一步室温孵育结合。最后使用ECL显色液显示蛋白质条带，并使用Quantity one软件通过光密度测定法定量。实验结果(图5B)显示，与未经过MUP蛋白处理(对照组)相比，MUP蛋白可以显著增加血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)以及磷酸化血管内皮生长因子受体2(p-VEGFR2)的表达水平。即实验结果提示MUPs可以促进内皮细胞表达VEGF，并增强细胞的增殖信号。
(3)将人主动脉内皮细胞接种于已在底部水平划线的6孔板中，在细胞单层长满之后，用200μL枪头在细胞板中垂直划线，0h时在培养基中给予MUP蛋白(0.1μg/mL，实验组)或不给予MUP蛋白(对照组)，使用明场倒置显微镜记录0h的划痕宽度，在接下来12h观察划痕的闭合情况并拍照，结果表明MUP蛋白增加了实验组内皮细胞的迁移能力(P<0.01，图5C)；将基质胶和含5％FBS、100μg/mL生长补充剂的ECs培养基1:1稀释，使用预冷的枪头在96孔板每孔加入50μL稀释后的基质胶，并将孔板放入37℃培养箱中30min，使基质胶固化，将预先给予MUP蛋白(0.1μg/mL)处理(实验组)或未处理(对照组)的内皮细胞使用胰酶消化后离心重悬，每孔加入10000个细胞，培养4h后，用明场倒置显微镜观察基质胶内的小管形成，结果表明MUP蛋白增加了实验组内皮细胞的成管能力(P<0.05，图5D)；大鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠安乐死之后，解剖分离胸主动脉，去除胸主动脉周围的脂肪和其它结缔组织，将主动脉剪成约0.5mm宽的血管环，将血管环放在含有MUP蛋白(0.1μg/mL，实验组)或不含有MUP蛋白(对照组)的培养基中24h，将每个主动脉血管环嵌入固化的基质胶中，再在其上覆盖30μL基质胶，通过在ECs培养基中补充5％FBS和100μg/mL生长补充剂来刺激血管的出芽，每隔一天更换一次培养基，培养4天后用明场倒置显微镜获取血管出芽的照片，结果表明MUP蛋白增加了实验组内皮细胞的出芽能力(P<0.01，图5E)。这些结果提示，上调MUPs可以显著增强血管新生能力。
以上结果提示，MUPs可以显著促进内皮细胞的血管新生作用。
2.4MUPs对单钠尿酸盐(MSU)诱导的膝关节炎具有抑制作用
在小鼠左膝关节关节腔中分别注射0.13mg/kg或1.3mg/kg的MUP蛋白进行预保护(对照组给予PBS)，30min后，左膝关节关节腔内注射MSU诱导膝关节炎(对照组给予生理盐水)，在1h、3h、6h、12h、24h测量左膝关节宽度(图6A)，同时在24h断颈处死小鼠，取出左膝关节，放置于含有200μL opti-mem(含1％双抗)的12孔板中培养1h，收集上清并检测IL-18(图6C)、IL-1β(图6B)。结果表明MUP蛋白可以抑制MSU诱导的膝关节炎，提示MUPs具有抗炎作用，有助于减轻炎症相关疾病的发生。
总之，本发明通过实验考察了MUPs对加快血管新生、促进创伤愈合起到的作用效果，同时考察了MUPs在减轻炎症方面起到的作用效果。实验结果表明，MUPs具有作为药物活性成分进行相关临床应用的前景。
Claims (10)
1.主要尿蛋白在制备用于促进创伤愈合的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述主要尿蛋白促进血管新生。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述主要尿蛋白通过增加血管内皮生长因子的表达水平加快组织的血管新生。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的作用方式包括增加创伤组织主要尿蛋白的水平。
5.主要尿蛋白在制备用于减轻炎症或防治炎症相关疾病的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述主要尿蛋白减轻损伤局部或血管内皮炎症。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述主要尿蛋白通过降低白介素-18及白介素-1β的水平抑制炎症反应。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物的作用方式包括增加损伤局部或循环系统主要尿蛋白的水平。
9.主要尿蛋白在制备用于防治缺血性疾病的药物中的应用。
10.如权利要求1、5或9所述的应用，其特征在于：所述药物是由主要尿蛋白和辅料制成。
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