CN116747306A - Yap/taz抑制剂或yap/taz拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用 - Google Patents
Yap/taz抑制剂或yap/taz拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用。本发明创造性地揭示了YAP/TAZ作为哮喘治疗的新靶点的可能性。本发明的研究发现HDM和炎症介质都是强有力的刺激物，能激活肺泡上皮细胞中的YAP/TAZ，YAP/TAZ激活后可促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞的转化；还发现以YAP/TAZ为靶点的维替泊芬可以抑制体内肺肌成纤维细胞的表达，表明YAP/TAZ可以作为哮喘新的治疗靶点，可以减轻哮喘气道重塑，在激素抵抗型哮喘的治疗中有重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用。
背景技术
哮喘是慢性炎症性疾病之一，其患病率逐年增加。尽管病因复杂，但哮喘患者普遍包括以下病理特征：慢性炎症，气道高反应性和气道重塑。长期以来，抗炎药如类固醇激素已被用作慢性炎症性气道疾病的一线治疗药物。
然而，目前的药物并不总是能有效抑制慢性气道炎症，有5-10％的哮喘患者对激素治疗不敏感，他们会发展为“激素抵抗型哮喘”或“重症哮喘”，这部分患者即使长期大量服用激素及多种药物联合治疗，仍然会出现反复的急性哮喘发作。
因此，寻找新的哮喘治疗靶点十分迫切。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用。
第二方面，本发明提供YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用。
第三方面，本发明提供YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备抑制肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的药物中的应用。
第四方面，本发明提供YAP/TAZ激动剂在制备促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的药物中的应用。
第五方面，本发明提供一种促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的方法，所述方法包括向肺成纤维细胞给予YAP/TAZ激动剂或CTGF激动剂，以促进其转化为肺肌成纤维细胞。
第六方面，本发明提供YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备CTGF(结缔组织生长因子)抑制剂中的应用。
第七方面，本发明提供一种抑制CTGF蛋白表达的方法，所述方法包括向目标细胞或目标组织给予YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂，来抑制CTGF蛋白表达。
优选地，所述目标细胞包括肺泡上皮细胞，所述目标组织包括肺。
第八方面，本发明提供YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)抑制剂中的应用。
第九方面，本发明提供一种抑制α-SMA蛋白表达的方法，所述方法包括向目标细胞或目标组织给予YAP/TAZ抑制剂、YAP/TAZ拮抗剂或CTGF抑制剂，来抑制α-SMA蛋白表达。
优选地，所述目标细胞包括肺成纤维细胞，所述目标组织包括肺。
优选地，本发明所述YAP/TAZ抑制剂包括维替泊芬(VP)。
第十方面，本发明提供一种激活YAP/TAZ的方法，所述方法包括向目标细胞或目标组织给予HDM(屋尘螨)、IL-1β(白细胞介素1β)或TNF-α(肿瘤坏死因子α)；
所述激活YAP/TAZ是指促进YAP、non-pS127 YAP(YAP的活性形式)或TAZ表达；
优选地，所述目标细胞包括肺泡上皮细胞，所述目标组织包括肺。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地揭示了YAP/TAZ作为哮喘治疗的新靶点的可能性。本发明的研究发现HDM和炎症介质都是强有力的刺激物，能激活肺泡上皮细胞(ATII细胞)中的YAP/TAZ，YAP/TAZ激活后可促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞的转化(FMT)；还发现以YAP/TAZ为靶点的维替泊芬(VP)可以抑制体内肺肌成纤维细胞的表达，表明YAP/TAZ可以作为哮喘新的治疗靶点，可以减轻哮喘气道重塑，在激素抵抗型哮喘的治疗中有重要作用。
具体地，本发明通过揭示YAP/TAZ在体外和体内II型肺泡上皮(ATII)细胞中激活促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的新作用和机制，探索YAP/TAZ作为哮喘肌成纤维细胞形成的治疗靶点的潜力。通过免疫荧光染色，本发明发现在临床哮喘患者和屋尘螨(HDM)诱导的小鼠肺标本中，支气管周围和肺泡实质中的肌成纤维细胞增多。伴随而来的是ATII细胞中YAP的过度表达和核移位，以及结缔组织生长因子(CTGF)的上调。在体外研究中，HDM可促炎介质上调和激活人原代ATII细胞和A549细胞中的YAP。用YAP/TAZ siRNA或VP(维替泊芬)抑制A549细胞中YAP/带有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)，可抑制体外成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。在体内研究中，维替泊芬可部分或完全阻止HDM诱导的小鼠支气管或肺泡肌成纤维细胞聚集，并显著抑制CTGF的表达和小鼠肺内胶原的沉积，但对呼吸道炎症没有明显影响。本发明的结果为气道重塑提供了新的机制见解，并为开发新的治疗策略提供了希望。
附图说明
图1为气道炎性细胞浸润及胶原沉积评分标准图。
图2是哮喘患者与非哮喘患者之间波形蛋白、α-SMA的表达水平、肌成纤维细胞聚集情况对比图；a是支气管中波形蛋白和α-SMA免疫荧光染色的代表性图像；b是肺泡中波形蛋白和α-SMA免疫荧光染色的代表性图像(星形标识表示肌成纤维细胞，局部放大图对应合并图中方框框出的部分)；c是非哮喘患者与哮喘患者之间波形蛋白荧光强度的统计分析结果；d是非哮喘患者与哮喘患者之间α-SMA荧光强度的统计分析结果；e是支气管周围肌成纤维细胞计数的统计分析结果；f是肺泡肌成纤维细胞计数的统计分析结果(与非哮喘患者相比，*P<0.05，哮喘样本n＝7，非哮喘样本n＝8)。
图3是非哮喘小鼠(生理盐水)与哮喘小鼠(HDM)之间波形蛋白、α-SMA的表达水平、肌成纤维细胞聚集情况对比图；a是肺切片HE染色结果(AW，呼吸道；BV，血管)；b是ELISA检测得到的血清总IgE水平；c是qPCR检测得到的炎性细胞因子转录水平；d是支气管中波形蛋白和α-SMA免疫荧光染色的代表性图像；e是肺泡中波形蛋白和α-SMA免疫荧光染色的代表性图像(星形标识表示肌成纤维细胞，局部放大图对应合并图中方框框出的部分)；f是波形蛋白荧光强度的统计分析结果；g是α-SMA荧光强度的统计分析结果；h是支气管周围肌成纤维细胞计数的统计分析结果；i是肺泡肌成纤维细胞计数的统计分析结果(n＝5只/组)。
图4是(人或小鼠)哮喘样本与非哮喘样本肺中YAP蛋白水平及行为的对比结果图；a为人样本的具有代表性的免疫荧光图像(星形标记表示ATII细胞中的YAP核移位)；为小鼠样本的具有代表性的免疫荧光图像；c为人类样本的非哮喘与哮喘组YAP表达水平的统计分析结果；d为小鼠样本的非哮喘(生理盐水)与哮喘(HDM)组YAP表达水平的统计分析结果；e为HDM组小鼠肺裂解物中YAP、non-pS127 YAP(YAP的活性形式)、pS127 YAP的免疫印迹实验结果，GAPDH为内参蛋白；f为小鼠肺裂解物中YAP、non-pS127 YAP、pS127YAP表达水平的统计分析结果(n＝5只/组，与生理盐水组比较，*P<0.05)。
图5是(人或小鼠)哮喘样本与非哮喘样本肺中CTGF蛋白水平及行为的对比结果图；a为人肺样本中CTGF和pro-SPC染色的代表性免疫荧光图像；b为小鼠肺样本中CTGF和pro-SPC染色的代表性免疫荧光图像；c为人类样本的非哮喘与哮喘组CTGF表达水平的统计分析结果；d为小鼠样本的非哮喘(生理盐水)与哮喘(HDM)组CTGF表达水平的统计分析结果；e为HDM组小鼠肺组织中CTGF的免疫印迹实验结果；f为HDM组小鼠肺组织中CTGF表达水平的统计分析结果(n＝5只/组，与生理盐水组比较，*P<0.05)。
图6是YAP在支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中调节水平的对比结果图；a为免疫荧光染色结果图；b为肺泡细胞数量的统计学分析结果；c为肺泡上皮细胞中non-pS127 YAP阳性细胞占比的统计分析结果(n＝5只/组，与生理盐水组比较，*P<0.05)；d为人原代ATII细胞中YAP、non-pS127 YAP、TAZ的免疫印迹实验结果；e为人原代ATII细胞中YAP、non-pS127YAP、TAZ表达水平的统计分析结果；f为BEAS-2B细胞中YAP、non-pS127 YAP、TAZ的免疫印迹实验结果；g为BEAS-2B细胞中YAP、non-pS127 YAP、TAZ表达水平的统计分析结果(n＝3-7，*P<0.05，与0min相比，*P<0.05)。
图7是BD不能抑制HDM或rh IL-1β诱导的A549细胞YAP/TAZ的激活的结果图；a是HDM刺激A549细胞引起YAP/TAZ的激活的免疫印迹结果；b是HDM刺激A549细胞引起YAP/TAZ的激活的统计分析结果；c是rhIL-1β联合rhTNF-α刺激A549细胞引起YAP/TAZ的激活的免疫印迹结果；d是rhIL-1β联合rhTNF-α刺激A549细胞引起YAP/TAZ的激活的统计分析结果(n＝3-6，*P<0.05，与0min相比，*P<0.05)；e是HDM或rh IL-1β诱导YAP激活的免疫细胞化学染色结果；f是HDM诱导YAP激活的统计学分析结果；g是rh IL-1β诱导YAP激活的统计学分析结果(n＝4-6，与0min相比，*P<0.05)；h是HDM或rh IL-1β诱导YAP激活的免疫印迹结果；i是YAP蛋白表达水平的统计学分析结果；j是TAZ蛋白表达水平的统计学分析结果(n＝3，*P<0.05)。
图8是HDM或rhIL-1β诱导的YAP/TAZ激活由F-actin聚合介导(BD对此反应不敏感)的结果图；a为在加或不加BD的情况下，HDM或rhIL-1β处理A549细胞15min后，其中YAP和F-actin的典型免疫细胞化学图像；b为YAP、TAZ和F-actin的免疫印迹实验结果；c为YAP蛋白表达水平的统计学分析结果；d为TAZ蛋白表达水平的统计学分析结果(n＝3，*P<0.05，与未处理组相比，#P<0.05，与HDM或rhIL-1β单独组相比)。
图9是抑制Yap/Taz显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的A549细胞CTGF上调的结果图；a是HDM或rhIL-1β诱导A549细胞中CTGF上调的免疫印迹结果图；b是HDM或rhIL-1β诱导A549细胞中CTGF上调的统计学分析结果(n＝3，*P<0.05，与未处理细胞相比)；c是有效地敲除A549细胞中的YAP和TAZ显著抑制YAP、TAZ、CTGF表达的免疫印迹结果；f是有效地敲除A549细胞中的YAP和TAZ显著抑制YAP、TAZ、CTGF表达的统计分析结果；e是有效地敲除A549细胞中的YAP和TAZ显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的YAP、TAZ、CTGF的产生的免疫印迹结果；g是有效地敲除A549细胞中的YAP/TAZ显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的YAP表达的统计分析结果；h是有效地敲除A549细胞中的YAP/TAZ显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的CTGF的产生的统计分析结果；i是有效地敲除A549细胞中的YAP/TAZ显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的TAZ表达的统计分析结果(n＝3-5，*P<0.05，与未处理细胞相比。#P<0.05，与NT siRNA处理的细胞相比)；j是HDM或rhIL-1β处理的A549细胞经VP处理前后YAP、TAZ和CTGF蛋白表达的免疫印迹结果；k是VP抑制YAP表达的统计学分析结果；l是VP抑制TAZ表达的统计学分析结果；m是VP抑制CTGF表达的统计学分析结果(n＝3-5，*P<0.05，与未经处理的细胞相比。#P<0.05，与HDM或rhIL-1β处理的细胞相比)。
图10是rhCTGF显著促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并诱导成纤维细胞中α-SMA表达上调的结果图；a是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的结果；b是α-SMA的免疫印迹结果；c是α-SMA表达水平的统计学分析结果。
图11是YAP/TAZ激活促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的结果。
图12是成纤维细胞中α-SMA表达水平的统计学分析结果；a是BD、VP及YAP/TAZsiRNA处理对由HDM刺激的A549培养液得到的成纤维细胞中α-SMA表达水平的影响结果；b是BD、VP及YAP/TAZ siRNA处理对由rhIL-1β刺激的A549培养液得到的成纤维细胞中α-SMA表达水平的影响结果(n＝3-5，*P<0.05，与未处理细胞比较。#P<0.05，与NT siRNA处理的细胞相比，§P<0.05，与BD处理的细胞相比)。
图13是靶向YAP/TAZ在哮喘中的治疗潜力结果图：a是小鼠肺内α-SMA和波形蛋白的代表性免疫荧光染色结果；b是不同组别间支气管周围肌成纤维细胞计数的统计分析结果；c是不同组别间肺泡肌成纤维细胞计数的统计分析结果；d是CTGF在小鼠肺中表达的代表性免疫荧光染色结果：e是CTGF在小鼠肺中表达的统计分析结果；f是分析小鼠肺内胶原沉积水平的马松三色染色结果；g是小鼠支气管周胶原沉积水平的统计分析结果；h是小鼠肺泡胶原沉积水平的统计分析结果(n＝5-8只/组，*P<0.05，与生理盐水组相比，#P<0.05，与HDM-DMSO组相比，§P<0.05，与BD组相比)。
图14是VP和BD对呼吸道炎症特征的不同影响的结果图；a是小鼠血清中总IgE水平的ELISA结果；b是小鼠血清中HDM特异性IgE水平的ELISA结果；c是气道炎性细胞浸润程度的代表性HE染色结果；d是气道炎性细胞浸润程度评分的统计结果；e是小鼠BALF中细胞总数；f是小鼠BALF中IL-4的表达水平；g是小鼠BALF中IL-13的表达水平；h是小鼠肺组织中IL-4转录水平的qPCR结果；i是小鼠肺组织中IL-5转录水平的qPCR结果；j是小鼠肺组织中IL-13转录水平的qPCR结果；k是小鼠肺组织中IL-10转录水平的qPCR结果；l是小鼠肺组织中IL-33转录水平的qPCR结果(n＝5-8只/组，*P<0.05,与生理盐水组相比，#P<0.05，与HDM-DMSO组相比)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，所有的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
各实施例中涉及的具体实验步骤如下：
1.病人基本信息
为了确定YAP在哮喘中的临床意义，本发明收集了哮喘和非哮喘患者的肺切片，石蜡包埋肺切片取自2019年至2021年中山大学附属第五医院肺叶切除术患者15例，其中哮喘患者7例，非哮喘患者8例。所有患者都被诊断出患有肺癌，肺样本采集自距离肿瘤至少5厘米的正常区域。所有手术均经中山大学附属第五医院伦理委员会批准(批准号：K22-1)。
2.HDM(屋尘螨)诱导的小鼠哮喘模型
本发明使用雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，购自北京生命河实验动物科技有限公司(北京，中国)，饲养于无特定病原体(SPF)环境，12/12h明暗周期。所有程序均经中山大学动物伦理委员会批准，HDM诱导的哮喘小鼠模型的建立遵循已公开的方案。分别于第0和14天以20μg HDM(XPB820D3A25，Greer Laboratories，美国)和1mg氢氧化铝(A1577，SigmaAldrich，美国)溶入0.1mL生理盐水中，腹腔注射致敏小鼠，然后在第21，23和25天将10μgHDM溶入30μL生理盐水中滴鼻致敏。对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.1mL，滴鼻生理盐水30μL。HDM致敏小鼠在每次滴鼻前1h或0.5h分别腹腔注射给予50mg/kg维替泊芬(VP，HY-B0146，MedChemExpress，美国)或滴鼻注射1mg/kg布地奈德(BD，HY-13580，MedChemExpress，美国)。以2.5％或6.7％二甲基亚砜(DMSO，Hybri-MaxTM，Sigma，美国)腹腔注射或滴鼻为对照。最后一次加药后24h，用2,2,2-三溴乙醇(500mg/kg)和盐酸右美托咪定(0.5mg/kg)混合的麻醉剂处理小鼠，然后收集血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺叶进行后续检测。
3.细胞培养与研究设计
人原代ATII细胞(肺泡上皮细胞)购自icell Bioscience Inc.(中国上海)，在iCell原代上皮细胞培养液(PriM-iCell-001，iCell)中培养。实验采用传代至2、3代的ATII细胞。A549细胞系(人肺腺癌细胞)购自ATCC(美国)，在添加10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％pen/strep(Gibco)的Dulbecco改良Eagle’s培养液(DMEM)中培养。HFL-1细胞系(人肺成纤维细胞)购自Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.(中国武汉)，在Ham’s F-12K(PM150910，Procell)中添加10％胎牛血清(Gibco)和1％pen/strep(Gibco)进行培养。BEAS-2B细胞系(肺上皮细胞)购自ATCC(美国)，在BEGM TM支气管上皮细胞生长培养液BulletKitTM(CC-3171&CC-4175,Lonza)中培养。
为确定YAP能否在体外被激活，原代ATII细胞、A549和BEAS-2B细胞饥饿24h，分别用10μg/mL HDM、或1ng/mL rhIL-1β、或1ng/mL rhIL-1β加1ng/mL rhTNF-α刺激，分别在0、15、30、60、120和240min收集细胞裂解产物。药物预处理组：用1μmol/L布地奈德(BD，HY-13580，MedChemExpress，美国)、0.25μmol/L latrunculin A(LatA，GC15671，GLPBIO，美国)或1μmol/L维替泊芬(HY-B0146，MedChemExpress，美国)处理A549细胞，再用10μg/mL HDM或1ng/mL rhIL-1β处理。
对于FMT(成纤维细胞向肌成纤维细胞转化)分析，将HFL-1细胞(人肺成纤维细胞)接种于6孔板上，细胞密度达到80％后使用无血清培养基饥饿24h，分别加入HDM(10、50、100μg/mL)，rhIL-1β(1、10、20ng/mL)和重组人转化生长因子-β1(rhTGF-β1，1、10、20ng/mL)，4h后裂解细胞。收集HDM或rhIL-1β刺激的A549细胞培养上清对HFL-1细胞进行孵育，对照组HFL-1细胞用仅含HDM或rhIL-1β的培养液孵育。48h后，在4％福尔马林中固定细胞，进行免疫荧光染色以及免疫印迹分析。
4.肺切片的免疫荧光染色
肺切片使用二甲苯脱蜡，乙醇浓度降至蒸馏水中复水，然后在柠檬酸钠溶液(P0083，Beyotime，中国，上海)里在95℃下加热20min中进行抗原修复。在水中短暂清洗后，用0.3％的Triton-X 100(P0096，Beyotime，中国)破膜20min。然后用5％的山羊血清(PH0424，Phygene，中国)、1％的牛血清白蛋白(BSA，G5001，ServiceBio，中国)和0.3％的Triton-X100封闭1h。用磷酸盐缓冲溶液(PBS，B548117，Sangon Biotech，中国)洗涤后，将切片用vimentin(波形蛋白，1:100稀释倍数，5741，CST，美国)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，1:1000稀释倍数，A2547，Sigma Aldrich，美国)，YAP(1:100稀释倍数，14074，CST，美国)，non S127 phospho-YAP(non pS127 YAP，1:100稀释倍数，ab205270，Abcam)，前表面活性蛋白C(pro-SPC，1:200稀释倍数，AB3786，Millipore，美国)或结缔组织生长因子(CTGF，1:100稀释倍数，sc-101586，Santa Cruz,美国)孵育过夜，抗体在含有1％ BSA的PBS中稀释。第2天，洗涤玻片，分别与Alexa Fluor 647goat anti-rabbit IgG(1:200稀释倍数，4414S，CST，美国)或Alexa Fluor 488goat anti-mouse IgG(1:200稀释倍数，4408S，CST，美国)孵育1h。然后用4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，1:1000稀释倍数，564907，BD Biosciences，美国)进行核染色10min。在PBS中清洗后，使用抗淬灭封片剂(PH0429-2，Phygene，中国)固定切片，并在4℃避光保存待用。
5.小鼠血清和BALF采集
用2,2,2-三溴乙醇(500mg/kg)和盐酸右美托咪定(0.5mg/kg)混合液麻醉小鼠，心脏穿刺法采血。采集后，在室温下静置2-4h后，以2400g离心10min。收集血清，并将其保存在-80℃待用。采血后，用20G静脉留置针(4253566-03，贝朗，德国)提前装好每管0.5mL预冷的PBS，连续抽吸肺叶3次，每次0.5mL，收集肺泡灌洗液。BALF在4℃下1000g离心5min，收集上清液，在-80℃下保存待用。收集肺泡灌洗液中的细胞团，再悬浮在0.85％氯化铵中(NH4Cl，cat no.213330，Sigma Aldrich，美国)，在室温下孵育5min，裂解红细胞。然后细胞在4℃下1000g离心5min，细胞再悬浮在含有1％ BSA(A1933，Sigma Aldrich，美国)的200μL的RPMI-1640培养液中。细胞与0.4％台盼蓝(JC0314，晶欣，中国)按1:1比例混合后，在显微镜下进行细胞计数。
6.总RNA的提取及实时定量即时聚合酶链式反应(RT-qPCR)
使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolated Kit V2(RC112-01，Vazyme，中国)按制造商说明从小鼠肺中提取总RNA。用Nanodrop2000型紫外-可见分光光度计(ThermoFisher，美国)测定提取RNA的浓度和质量。1μg RNA用Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(E047-01A，Novoprotein，中国)进行cDNA合成。用SYBR Green-based qPCR kit(E096-01B，Novoprotein，中国)在CFX96TM Real-Time(Bio-Rad，Hercules，California，USAA)上进行qPCR。每次qPCR，将1μL的cDNA(10ng)与19μL的含有0.8μL的5个μM的引物(正反向各5μmol/L)混合液混合后放入96孔PCR板上。qPCR程序如下：94℃，10min，40次循环：94℃，15s，60℃，1min。所有小鼠引物均购自Sangon Biotech(中国上海)，序列列于表S1。对看家基因Rpl13a进行归一化处理，用2-ΔΔCt比较法计算相对基因表达。
表S1用于qPCR的小鼠引物序列
7.苏木精伊红(HE)染色和马松三色染色
小鼠左肺在4％多聚甲醛中(PH0427，Phygene，中国)固定24h，石蜡包埋，切成5μm厚的切片。肺切片苏木精-伊红(PH0516-2，Phygene，中国)染色肺切片按照制造商的说明进行染色。具体步骤如下：将切片放于染色架上，放置在60℃恒温箱中软化石蜡，烘片1h，切片进行脱蜡复水操作，放入二甲苯中脱蜡5min，重复3次；接着放入梯度酒精中复水，无水乙醇2min，2次，95％乙醇2min，80％乙醇2min，75％乙醇2min，50％乙醇2min，最后片子放入去离子水中浸泡准备染色。将片子放入苏木素染色8min后，自来水冲洗5s，接着进入盐酸乙醇分化2s，自来水冲洗20s，接着放入蓝化液中返蓝30s，自来水冲洗30s，接着进入伊红染色液染色5min，自来水冲洗5s。后续步骤与前面相反，进入梯度酒精快速脱水，放入二甲苯中使切片透明化，最后用中性树胶封片，待片子过夜晾干后，使用Pannoramic数字扫片机(3DHistech,P250 FLASH,Budapest,Hungary)扫描获取图像其他切片使用Masson的三色染色试剂盒(G1340，Solarbio，中国)按照说明书进行胶原染色。具体步骤如下：用配制好的Weigert铁苏木素1:1现配混合，染色8min；酸性乙醇分化液分化5s，蒸馏水洗5s；Masson蓝化液返蓝5min，蒸馏水洗1min；丽春红品红染色液染色7min；弱酸工作液洗1min；磷钼酸溶液洗1min；继续弱酸工作液洗1min；直接放入苯胺蓝染色液中染色2min，继续弱酸工作液洗1min；95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5s，二甲苯透明3次，每次1min，最后中性树胶封片，待片子过夜晾干后，使用Pannoramic数字扫片机扫描获取图像，并按照以下标准(图1)进行半定量分析以确定气道炎性细胞浸润和胶原沉积分数(对每只小鼠的5个支气管和5个随机的肺泡实质区域进行评分并取其平均值)。
气道炎性细胞浸润评分标准为，评分0：支气管或血管周围未见炎性细胞浸润；评分1：支气管或血管周围为局灶性炎性细胞，未达完整一圈；评分2：支气管或血管周围有一层炎性细胞环绕；评分3：支气管或血管周围有2-4层炎性细胞环绕；评分4：支气管或血管周围有4层以上炎性细胞环绕。
肺泡胶原沉积记分标准为，评分0：肺泡组织区域中少于5％蓝色染色的胶原，相互连接的胶原纤维较少见；评分1：5-30％的肺泡组织区域存在蓝色染色的胶原，少量胶原纤维相互连接；评分2：30-60％的肺泡组织区域存在蓝色染色的胶原，具有中等水平的相互连接纤维；评分3：60-90％的肺泡组织区域存在蓝色染色的胶原，具有更高水平的互连纤维；评分4：90-100％的肺泡组织区域存在广泛的相互连接的胶原纤维。
支气管周胶原沉积评分标准为，评分1：支气管周围的基底膜上有一层蓝色染色的胶原纤维；评分2：胶原纤维穿过支气管周围浸润1-3层细胞；评分3：胶原纤维穿过支气管周围浸润3-5层细胞；评分4：胶原纤维浸润至5层以上的支气管周围细胞。
8.酶联免疫吸附试验(ELISA)
用BD OptEIATMMouse IgE ELISA kit(555248，BD Biosciences，美国)和MouseAnti-HDM IgE Antibody Assay Kit(3037，Chondrex，美国)分别检测血清中总的和HDM特异性IgE水平。用BD OptEIATMMouse IL-4Set(555232，BD Biosciences，美国)和IL-13MouseUncoated ELISA kit(88-7137-88，ThermoFisher，美国)分别测定肺泡灌洗液中IL-4和IL-13的水平。所有程序都是按照制造商的说明进行的。具体步骤如下：在空白酶标板上加入100μL稀释好的IgE抗体包被液，酶标板盖上覆膜，放置4℃过夜孵育。第二天，弃孔内溶液，洗板3次，甩干。每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1h，弃去液体，洗板3次，甩干。每孔加入100μL倍比稀释好的标准品及稀释的待测样品，加样时设置空白孔对照，待测样品做3个复孔，酶标板盖上覆膜，37℃反应2h，弃去液体，洗板5次，甩干。每孔加入100μL HRP(辣根过氧化物酶)标记的检测抗体工作液，于37℃孵育1h，弃去液体，洗板7次，每次浸泡洗30s到1min，甩干。每孔加底物溶液100μL，于37℃避光孵育30min。随后每孔加入终止液50μL。在450nm波长的酶标仪下检测每个孔的OD值，检测在加入终止液后30min内完成
9.细胞培养的免疫细胞化学染色
接种于盖玻片(BS-14-RC，Biosharp，中国)上的细胞在室温下用4％的甲醛固定20min。在PBS中洗涤后，细胞在含0.1％ Triton X-100的PBS在室温下孵育15min。然后在含有5％山羊血清和1％ BSA的PBS中于室温下封闭细胞30min。然后将细胞在4℃中孵育过夜，在缓冲液中稀释vimentin(1:100稀释倍数，5741，CST，美国)、α-SMA(1:1000稀释倍数，A2547，Sigma Aldrich，美国)和YAP(1:100稀释倍数，14074，CST)的第一抗体。用PBST(1×PBS含0.05％v/v Tween-20)洗涤3次后，分别与二抗Alexa Fluor 647goat anti-rabbitIgG(1:200稀释倍数，4414S，CST，美国)或Alexa Fluor 488goat anti-mouse IgG(1:200稀释倍数，4408S，CST，美国)溶在3％ BSA的缓冲液中孵育1h。洗涤后，用1μg/mL DAPI在PBS中稀释，染色10min。PBS清洗2次后，用抗淬灭封片剂封片，滴加指甲油固定，成像前放置4℃冰箱避光保存。另外的细胞切片用TRITC Phalloidin(MX4405，MKBio，中国)在PBS中孵育1h，染色F-actin。用Olympus FV1000 confocal microscope(Olympus，美国)在200倍放大下拍摄图像。
10.siRNA敲低实验
YAP、TAZ和阴性对照non-targeting(NT)siRNA和GP-transfect-Mate转染试剂购自GenePharma Biotechnology(中国)(siRNA测序见表S2)。A549细胞以1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板上，培养2d，达到80％细胞密度，然后分别用含有YAP和TAZ siRNA(20μmol/L)或NT siRNA(20μmol/孔)和GP-transfect-Mate转染试剂(5μL/孔)转染A549细胞。2d后，收取siRNA转染的A549细胞验证敲低效率，或者加入10μg/mL HDM和1ng/mL rhIL-1β进行细胞刺激实验。
表S2人siRNA序列
关于序列表的说明：由于WIPO ST.26软件中不允许出现“U”，符号T代表“T或U”，因此具体序列情况应以说明书为准。
11.蛋白质提取和Western blotting(蛋白质免疫印迹)
将培养的细胞或小鼠肺组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(P0013B，Beyotime，中国上海)中在冰上裂解30min。然后裂解产物在4℃下18000g离心10min，收集上清液并在-80℃下储存待用。使用BCA蛋白分析试剂盒(PH0326，Phygene，中国)按照手册的说明测定可溶性蛋白质浓度。蛋白质裂解产物(20-50μg)在10％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上变性和分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。然后用含有5％w/v脱脂牛奶的Tris-buffered生理盐水/0.05％ Tween-20(TBST)在室温下封闭1h。在用TBST洗涤3次，每次10min后，将膜在4℃下孵育过夜，主要抗体包括YAP(1:1000稀释倍数，sc-101199，Santa Cruz)，phosphor-S127 YAP(1:1000稀释倍数，13008，CST)，TAZ(1:1000稀释倍数，ab224239，Abcam)，non-pS127 YAP(1:1000稀释倍数，ab205270，Abcam)，vimentin(1:1000稀释倍数，5741，CST)，α-SMA(1:1000稀释倍数，A2547，Sigma)，CTGF(1:1000稀释倍数，ab6992，Abcam)，甘油3-脱氢酶(GAPDH，1:5000稀释倍数，2118S，CST)，或β-actin(1:100000稀释倍数，AC026，ABclonal，美国)。随后，用HRP标记的二次免疫球蛋白(1:3000稀释倍数的HRP标记的羊抗兔抗体，7074S，CST；1:5000稀释倍数的HRP标记的羊抗鼠抗体，7076S，CST)孵育1h。用TBST洗膜后，使用GenSuper ECL kit(JXE0011，晶欣，中国)进行增强化学发光(ECL)，并在iBright FL1500系统(Thermofisher，CN，USA)上显示蛋白质条带。使用ImageJ软件(1.53c，Wayne Rasband，NationalInstitutes of Health，USA)进行密度测量，并使用GAPDH或β-actin来归一化等样本量。
12.统计分析
使用GraphPad Prism软件(9.3.0版，美国)进行统计分析。Welch校正的非配对t检验用于两组间比较，临床数据一般特征用平均数(mean)±标准差(SD)表示，其他统计结果用或平均数±标准差(standard error of mean)表示，P值小于0.05被认为差异具有统计学意义。
实施例1
本实施例探究哮喘对于患者肺中波形蛋白与α-SMA的表达水平、肌成纤维细胞聚集情况的影响
(1)对比哮喘患者与非哮喘患者(均患肺癌)之间波形蛋白、α-SMA的表达水平、肌成纤维细胞聚集情况。
方法为，对患者支气管或肺泡中波形蛋白和α-SMA进行免疫荧光染色，分析荧光强度，并对支气管周围或肺泡肌成纤维细胞进行计数。
结果见图2：与非哮喘组相比，哮喘组的支气管壁和肺泡壁中波形蛋白(vimentin)和α-SMA的表达水平显著上调(P<0.05)，肌成纤维细胞在肺内的支气管和肺泡区显著聚集。
(2)对比非哮喘小鼠(生理盐水组)与哮喘小鼠(HDM组)之间波形蛋白、α-SMA的表达水平、肌成纤维细胞聚集情况。
方法为，对小鼠肺切片进行HE染色，ELISA检测小鼠血清总IgE水平，用qPCR检测炎性细胞因子转录水平，对小鼠支气管或肺泡中波形蛋白和α-SMA进行免疫荧光染色，分析荧光强度，并对支气管周围或肺泡肌成纤维细胞进行计数。
结果见图3：HDM(屋尘螨)诱导的哮喘小鼠模型，与生理盐水处理的对照组小鼠相比，表现出典型的哮喘特征，包括支气管壁和肺泡壁的结构变化和炎性细胞浸润，血清总IgE和肺组织IL-4，IL-6和IL-13的转录水平显著增加。与对照组小鼠相比，在哮喘小鼠模型中波形蛋白和α-SMA的表达水平显著增强，肌成纤维细胞在肺内的支气管和肺泡区显著聚集。
本实施例证实，哮喘会导致患者肺中波形蛋白和α-SMA的表达水平显著上调，以及肌成纤维细胞在肺内的支气管和肺泡区显著聚集。
实施例2
本实施例探究哮喘对于患者肺中YAP蛋白水平及行为的影响(人或小鼠)
方法为，对人或小鼠肺样本进行免疫荧光染色，对小鼠肺裂解物进行蛋白质免疫印迹分析。
结果见图4：与非哮喘患者相比，YAP在哮喘肺泡区细胞中的表达普遍上调，引人注目的是，YAP在ATII细胞(肺泡上皮细胞)中优先移位到细胞核，其前表面活性蛋白C(pro-SPC)染色呈阳性。这一现象与HDM诱导的哮喘小鼠模型的实验结果一致。HDM处理的小鼠蛋白质中总YAP和non-pS127 YAP(YAP的活性形式)水平的增加进一步支持了这一结果，相比之下，YAP的pS127 YAP蛋白水平保持不变。
本实施例证实，哮喘会导致患者肺中YAP的激活，而且YAP在ATII细胞中优先移位到细胞核。
实施例3
本实施例探究哮喘对于患者肺中CTGF蛋白水平及行为的影响(人或小鼠)
方法为，对人或小鼠肺样本进行免疫荧光染色，对小鼠肺裂解物进行蛋白质免疫印迹分析。
结果见图5：与非哮喘对照组相比，CTGF(结缔组织生长因子)在临床哮喘患者和HDM诱导的小鼠肺中表达均显著上调。值得注意的是，很大一部分CTGF信号被发现定位在ATII细胞周围，这可能表明ATII细胞中YAP的活化在调节CTGF的产生中发挥作用。
本实施例证实，哮喘会导致患者肺中CTGF的表达上调。而且CTGF在ATII周围聚集，结合实施例3的结果可知，ATII细胞中YAP的激活能够促进CTGF的产生。
实施例4
本实施例对比哮喘诱导的YAP激活现象在肺泡上皮细胞与支气管上皮细胞之间的差异
方法为，对细胞进行免疫荧光染色分析、细胞计数，并统计YAP活性的细胞占比，蛋白质免疫印迹分析YAP、non-pS127 YAP、TAZ表达水平。
结果见图6：与生理盐水组相比，HDM诱导的哮喘小鼠的支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞中non-pS127 YAP(YAP的活性形式)的蛋白表达水平均显著上调，其中non-pS127YAP在肺泡上皮细胞中上调程度比在支气管上皮细胞中显著更高。此外，与生理盐水组相比，在HDM诱导的小鼠肺中，肺泡细胞数量也显著增加。
体外实验中，用HDM刺激人原代ATII细胞(肺泡上皮细胞)或支气管上皮细胞BEAS-2B，发现，在不同的时间点，HDM不仅可以上调ATII细胞的总YAP蛋白水平，还可以上调non-pS127 YAP蛋白水平。在HDM刺激后30分钟和60分钟，YAP同源基因TAZ的蛋白水平也有增加的趋势，但无统计学意义。相比之下，HDM未能诱导BEAS-2B细胞中non-pS127YAP或TAZ的表达，但在240分钟时下调了活性YAP或TAZ的表达。这些体外结果与在体内(小鼠模型)观察到的HDM诱导的YAP激活在肺泡上皮细胞中比在支气管上皮细胞中更显著的结果是一致的。
本实施例证实，哮喘诱导的YAP激活现象在肺泡上皮细胞中比在支气管上皮细胞中更显著。
实施例5
本实施例探究HDM或炎症介质对肺泡上皮细胞中YAP/TAZ的激活作用，以及治疗哮喘的药物BD(布地奈德)是否能够抑制此激活
实验方法为，利用蛋白质免疫印迹和免疫荧光染色分析YAP、non-pS127 YAP和TAZ的表达水平。
结果见图7：由于人类原代ATII细胞在培养2代后会自发分化为I型肺泡上皮(ATI)细胞，因此本实施例转而使用A549细胞，这是一种广泛应用于机制研究的ATII细胞模型。通过用HDM刺激A549细胞，观察到A549细胞在15、30、60和120分钟时总YAP和non-pS127YAP的蛋白表达显著上调，在同一时间点，TAZ的表达也显著上调。
为了了解炎症介质是否也能够诱导YAP激活，本实施例用rhIL-1β和rhTNF-α联合刺激A549细胞，这两种促炎介质是哮喘发病机制中的两个关键促炎介质。值得注意的是，rhIL-1β联合rhTNF-α也能诱导A549细胞的总YAP、non-pS127 YAP和TAZ的表达，但诱导程度不同。在随后的免疫荧光染色实验中进一步证实了HDM或炎症介质对YAP的激活，观察到HDM或rhIL-1β刺激后YAP表达水平显著上调。重要的是，这种上调并没有被BD(布地奈德，一种用于哮喘治疗的临床药物)的预处理所抑制。免疫印迹分析结果也表明，BD不能抑制HDM或rhIL-1β刺激后YAP和TAZ的蛋白水平的上调。不仅如此，在BD预处理组中，TAZ的表达有增加的趋势。
本实施例证实，HDM或炎症介质能够诱导肺泡上皮细胞A549细胞中YAP/TAZ的激活，而这种激活不受治疗哮喘的药物BD的抑制。
实施例6
本实施例探究HDM或rhIL-1β诱导的YAP/TAZ激活与F-actin聚合之间的关系，以及BD对其是否有作用
实验方法为，利用蛋白质免疫印迹和免疫荧光染色分析YAP、F-actin和TAZ的表达水平。
结果见图8：首先检测了肌动蛋白F-actin水平，因为YAP和TAZ是机械感受器，可能受细胞骨架重组的调节，结果显示，在A549细胞中，HDM或rhIL-1β在15min显著诱导F-actin聚合，YAP表达上调并移位到细胞核。BD始终不抑制YAP激活或F-actin聚合。当用有效的F-actin聚合抑制剂LatA预处理细胞时，HDM和rhIL-1β处理组的YAP和TAZ的蛋白表达水平显著降低。
综上，本实施例证实，HDM或rhIL-1β诱导的YAP/TAZ激活是由F-actin聚合介导的，BD对此反应不敏感。
实施例7
本实施例探究Yap/Taz激活与CTGF上调之间的关系
实验方法为，利用蛋白质免疫印迹分析YAP、TAZ、CTGF的表达水平。
结果见图9：首先，增加HDM或rhIL-1β的浓度可促进A549细胞中CTGf的表达，这与TGF-β1诱导的作用相当。为了探讨这一效应是否由YAP激活所介导，本实施例通过siRNA敲低实验进行了功能丧失分析。与non-target(NT)siRNA转染对照相比，在A549细胞中有效地敲除YAP和TAZ，不仅显著抑制基础表达水平，而且显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的CTGF的产生。为了证实这一发现，本实施例接下来用VP(维替泊芬，一种有效的YAP/TAZ抑制剂)对细胞进行预处理，结果发现，VP显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的YAP、TAZ和CTGF的蛋白表达水平。
本实施例证实，抑制Yap/Taz能够显著抑制HDM或rhIL-1β诱导的肺泡上皮细胞中CTGF上调。
实施例8
本实施例探究YAP/TAZ激活对于成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(FMT)，以及成纤维细胞中α-SMA表达的促进作用
本实施例采用HFL-1细胞(人肺成纤维细胞)进行实验，前述实验结果证实HDM或rhIL-1β可诱导肺泡上皮细胞A549细胞YAP/TAZ激活，因此，本实施例以HDM或rhIL-1β刺激的A549细胞培养上清液培养HFL-1细胞作为YAP/TAZ激活的实验组，以含HDM或rhIL-1β的普通培养基作为对照组。
实验方法为，利用免疫荧光染色分析肺成纤维细胞的转化，利用免疫荧光染色及蛋白质免疫印迹分析α-SMA的表达水平。
结果见图10-12：首先，细胞免疫荧光染色和免疫印记分析结果显示(图10)，rhCTGF可显著促进肺成纤维细胞(HFL-1细胞)向肺肌成纤维细胞转化，并诱导HFL-1细胞α-SMA表达上调，达到与rhTGF-β1处理相当的水平。接下来，细胞免疫荧光染色结果显示，经HDM或rhIL-1β刺激的A549培养上清可显著促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(图11)，并诱导HFL-1细胞α-SMA表达上调(图12)。重要的是，用VP或YAP/TAZ siRNA预处理A549细胞后，这种转化或上调被显著抑制。相比之下，BD预处理只在一定程度上抑制了HDM组细胞的转化或α-SMA上调，且抑制作用不如VP，而对rhIL-1β组并没有抑制作用。
综上，本实施例证实，YAP/TAZ激活可促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化，还可促进肺成纤维细胞中α-SMA表达上调，YAP/TAZ基因敲除或YAP/TAZ抑制剂(VP)可显著抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并抑制成纤维细胞中α-SMA表达上调，而哮喘治疗药物BD对肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化以及肺成纤维细胞中α-SMA表达上调的抑制作用不理想。
此外，CTGF同样可促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化，还可促进肺成纤维细胞中α-SMA表达上调。
实施例9
本实施例验证靶向YAP/TAZ在哮喘中的治疗潜力
为验证靶向YAP/TAZ在哮喘中的治疗潜力，在HDM诱导的小鼠哮喘模型中使用了VP或BD作为药物治疗组。
实验方法为，对小鼠肺内α-SMA、波形蛋白、CTGF进行免疫荧光染色，分析荧光强度，对支气管周围或肺泡肌成纤维细胞进行计数，对肺组织进行马松三色染色，并对胶原蛋白沉积水平进行评分。
结果显示(图13)，与对照组相比，VP和BD均显著抑制HDM诱导的小鼠肺内支气管周围和肺泡肌成纤维细胞的聚集。此外，与BD组相比，VP对肺泡肌成纤维细胞聚集的抑制作用更强，这种抑制伴随着VP组CTGF表达的显著降低。另外，VP和BD均显著减少HDM诱导的小鼠肺泡区的胶原沉积，但VP对支气管周围胶原沉积的影响比BD弱。
综上，本实施例证实，YAP/TAZ抑制剂VP在抑制肺泡肌成纤维细胞聚集、抑制CTGF表达，以及缓解肺泡胶原沉积方面优于哮喘治疗药物BD。相比之下，VP对于支气管的作用弱于BD。
实施例10
本实施例对比VP与BD对呼吸道炎症特征的影响
方法为，利用ELISA检测小鼠血清中总IgE水平以及HDM特异性IgE水平，对肺组织进行HE染色并进行气道炎性细胞浸润程度评分，统计小鼠BALF中细胞总数，利用ELISA检测小鼠BALF中细胞因子的含量，利用qPCR分析小鼠肺组织中细胞因子的转录水平。
结果见图14：ELISA结果显示，VP和BD均降低了HDM诱导的小鼠血清中总IgE或HDM-IgE(HDM特异性IgE)水平。相应地，两种药物治疗组的气道炎性细胞浸润评分均降低。然而，当比较BALF中的炎症细胞浸润和细胞因子的分泌或小鼠肺中的细胞因子转录水平时，只有BD对所有细胞因子(白细胞介素：IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-33)都有显著的抑制作用，而VP则没有显示出任何显著的影响。
本实施例说明，BD对于哮喘的治疗可能与其对各种炎症细胞因子的抑制作用密切相关，而VP对于哮喘的治疗并不是依靠对炎症细胞因子的抑制，结合前述实施例可知，VP是通过抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(FMT)，抑制肺成纤维细胞中α-SMA及CTGF的表达，抑制肺泡肌成纤维细胞聚集，实现了缓解肺泡胶原沉积，进而治疗哮喘。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用。但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘的药物中的应用。
2.YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备治疗哮喘气道重塑的药物中的应用。
3.YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备抑制肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的药物中的应用。
4.YAP/TAZ激动剂在制备促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的药物中的应用。
5.一种促进肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的方法，其特征在于，所述方法包括向肺成纤维细胞给予YAP/TAZ激动剂，以促进其转化为肺肌成纤维细胞。
6.YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备CTGF抑制剂中的应用。
7.一种抑制CTGF蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括向目标细胞或目标组织给予YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂，来抑制CTGF蛋白表达。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标细胞包括肺泡上皮细胞，所述目标组织包括肺。
9.YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂在制备α-SMA抑制剂中的应用。
10.一种抑制α-SMA蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括向目标细胞或目标组织给予YAP/TAZ抑制剂或YAP/TAZ拮抗剂，来抑制α-SMA蛋白表达。
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| CN117482239A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-02-02 | 北京大学口腔医学院 | Yap通路干预剂在制备抑制牙根吸收的药物中的应用 |
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| CN117482239B (zh) * | 2023-12-29 | 2024-04-16 | 北京大学口腔医学院 | Yap通路干预剂在制备抑制牙根吸收的药物中的应用 |
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