CN116042860A - 一种基于ngs的实验恒河猴str遗传标记组合、引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于NGS的实验恒河猴STR遗传标记组合、引物组、试剂盒及其应用。所述实验恒河猴STR遗传标记组合具体为：D10S611、D11S2002、D13S765、D15S823、D18S537、D1S548、D3S1768、D4S2365、D5S1457、D6S1691、D6S2741、D6S276、D6S2883、D6S291、D6S2972、D6S501、D7S794、D8S1106和D9S921。所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1~38所示。本发明的方案结果准确，可快速、高通量、简便的进行实验恒河猴的个体识别、谱系鉴定和亲缘鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及实验动物遗传学技术领域，具体涉及一种基于NGS的实验恒河猴STR遗传标记组合、引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
随着医学研究和生物技术的不断进步，涉及基因修饰、基因敲除、表观遗传学、基因编辑和非人灵长类实验动物中局部基因表达的精细调控等，使得非人灵长类动物资源变得更加具有成本效益和精炼。在创新药崛起的形势下，依照《药品非临床研究质量管理规范》等条例，所有新药的研发和疾病的诊断、治疗方法的确立与改进等都必须在非人灵长类实验动物身上获得可靠结论后，才能进入临床研究。因此，预计全球对非人灵长类实验动物资源的需求将不断增加，以满足更多新应用的需求。为满足日益增长的非人灵长类实验动物资源的需要，获得准确、可靠、重复性好的实验结果，排除实验动物本身对实验研究的影响，使用遗传背景清晰的标准化实验动物是必要条件。目前国家标准及地方标准对于封闭群非人灵长类实验动物(如恒河猴)尚未制定遗传监测方法。
短串联重复(short tandem repeat，STR)是基因组中重要的一种重复序列，呈孟德尔式共显性遗传，在基因组中数量大、分布广、多态性丰富，且哺乳动物的STR位点具有高度的保守性。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，且多个STR基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点。作为分子遗传标记，STR广泛地应用于物种鉴定、个体识别、亲子鉴定等诸多领域。经研究报道发现，STR在实验恒河猴遗传监测方面也发挥着重要作用。
目前DNA分型检测主要采用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术，通过检测带有不同荧光基团的扩增片段长度而得到基因分型，这种方法易导致STR位点的一些杂合基因的碱基序列不同而长度相同被判为纯合。并且毛细管电泳法采用多荧光复合扩增技术，设计引物时一些位点会保留较长的侧翼序列，导致扩增产物长，不利于检材的分型。通常一次只能检测少量样本的数十个位点，当遇到复杂亲缘关系鉴定时，则往往还需联合使用多种试剂盒以增加检测效能，这时就会出现操作过程繁琐、模板需求量较大的问题，若检材质量较差还可能出现大片段的丢失。同时这种方法仅限于人们已经研究过的基因序列，不能反映基因组的全貌。因此，利用毛细管电泳的一代STR分型技术难以处理诸如复杂的亲缘关系鉴定或者混合复杂的样本等。
近年来逐渐发展成熟的二代测序技术(next generation sequencing，NGS)，可以同时在一个反应内完成数十万到数百万条DNA分子片段的序列测定，具有高测序深度、高并行性和高准确性的特点，能够精确分析各位点的序列差异，充分地挖掘有效的遗传信息，可以实现规模化测序。并且NGS对各位点的长度没有限制，所以可以设计适当短的核酸片段，有利于降解检材的精确分型检测，现已成为实验动物遗传监测中很有前途的一种方法，其能容纳的遗传标记数量更多、对等位基因的区分效能更高，更有助于亲缘关系的鉴定。
因此，研发基于NGS的实验恒河猴STR遗传标记检测试剂盒，减少操作步骤，节省实验时间，只需一次扩增就能获得实验恒河猴常染色体上的遗传信息，为实验恒河猴遗传监测方法提供相应技术支撑，对了解实验恒河猴的遗传背景，规模化开发实验动物产业具有重要意义。
发明内容
目前国内外关于使用二代测序技术大规模检测实验恒河猴遗传信息的研究尚少，少数报道使用二代测序技术检测以STR/SNP作为遗传标记的食蟹猴的遗传关系，大部分报道使用荧光标记PCR—毛细管电泳法检测实验恒河猴STR遗传标记信息。由于食蟹猴和恒河猴属于不同种，且形态特征、栖息环境、生活习性等均不相同，因此基于二代测序技术建立的用于食蟹猴遗传关系鉴定的方法无法和本提案建立的方法相比较。传统方法使用荧光标记PCR—毛细管电泳法检测实验动物的遗传信息，这种方法通过检测带有不同荧光基团的扩增片段长度而得到基因分型，易导致STR位点的一些杂合基因的碱基序列不同而长度相同被判为纯合。并且毛细管电泳法采用多荧光复合扩增技术，设计引物时一些位点会保留较长的侧翼序列，导致扩增产物长，不利于检材的分型。通常一次只能检测少量样本的数十个位点，当遇到复杂亲缘关系鉴定时，则往往还需联合使用多种试剂盒以增加检测效能，这时就会出现操作过程繁琐、模板需求量较大的问题，若检材质量较差还可能出现大片段的丢失。同时这种方法仅限于人们已经研究过的基因序列，不能反映基因组的全貌。因此，利用毛细管电泳的一代STR分型技术难以处理诸如复杂的亲缘关系鉴定或者混合复杂的样本等。另外，现有市面上尚未有关于非人灵长类实验动物STR遗传标记检测试剂盒的报道。有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于NGS的实验恒河猴STR遗传标记检测试剂盒及应用，拟解决如下问题：
(1)现有市面上暂无实验恒河猴STR遗传标记检测试剂盒，无法大批量、快速、高效、准确对实验恒河猴进行遗传信息检测，而本发明意在筛选一组适宜实验恒河猴遗传多态性分析的STR遗传标记，应用二代测序技术，研发一个适用于实验恒河猴的有效的遗传检测试剂盒，从而对实验恒河猴谱系及遗传多态性进行分析，对现有繁育方式作出评价，从分子遗传角度指导实验恒河猴群体开展合理、科学的遗传繁育；
(2)克服现有技术的不足，实现在单管内同时扩增、检测实验恒河猴19个STR基因座，且在基因座排布中尽量使各基因座分布于不同染色体上、相互之间不存在遗传连锁；确保在扩增过程中各条引物之间相互无干扰，无非特异峰产生，从而满足实验恒河猴的谱系鉴定、个体识别及性别辨别等多种需求。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种实验恒河猴STR遗传标记组合，其包括以下19个实验恒河猴STR遗传标记：D10S611、D11S2002、D13S765、D15S823、D18S537、D1S548、D3S1768、D4S2365、D5S1457、D6S1691、D6S2741、D6S276、D6S2883、D6S291、D6S2972、D6S501、D7S794、D8S1106和D9S921。
用于检测上述19个实验恒河猴STR遗传标记的引物组，所述引物组包括SEQ IDNO：1～38所示的引物。
用于检测上述19个实验恒河猴STR遗传标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
一种基于NGS的对实验恒河猴STR遗传标记进行检测的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测实验恒河猴个体的DNA作为模板；
2)使用SEQ ID NO：1～38所示的引物进行第一轮PCR扩增反应；以第一轮PCR扩增产物为模板，利用带有Index序列的引物，通过第二轮PCR扩增向文库末端引入和Illumina平台兼容的特异性标签序列；
3)对第二轮PCR产物进行NGS测序及基因型判定。
进一步的，上述提取实验恒河猴的DNA：是采集实验恒河猴的血液。
进一步的，上述第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；4℃彻底延伸。
进一步的，上述第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL：扩增预混液9μL，DNA聚合酶0.25μL，引物混合液2μL，模板DNA2.5μL，其余为去离子水。
优选的，在第一轮PCR扩增的反应体系中，如SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：11～24、SEQ ID NO：27～32、SEQ ID NO：35～38所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.1μM，如SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：25～26所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.15μM，如SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：33～34所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.05μM，如SEQ ID NO：7～8所示的引物在扩增体系中的终浓度为2μM。
上述的实验恒河猴STR遗传标记组合、引物组、方法在用于实验恒河猴的个体识别、谱系鉴定、亲缘鉴定方面的应用。
本发明的显著优点在于：
1)本发明所述借助多重PCR技术，利用二代平台超高通量优势，能够在单管中同时扩增、检测19个实验恒河猴的STR位点，可以对几十个STR位点和上千个样本同时检测，增加了实验的通量；通过生信分析基于序列进行STR的准确分型，提高了STR分型准确性。整个过程快速、准确，缩短了实验周期，并节约了实验成本，同时也解决了多倍体进行准确STR分型的困难。
2)本发明选用的基因座尽量分布在不同染色体上，相互之间不存在遗传连锁，从而提高了试剂盒的整体识别能力；
3)本发明所述特异性扩增引物之间相互无干扰，无非特异峰产生，且具有特异性强、分辨率高、分型准确、灵敏度高等特点，可完全满足实验恒河猴谱系鉴定、亲缘关系鉴定、个体识别等多方面需求。
附图说明
图1：DNA基因组电泳胶图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别指明，以下提供的实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。对于本领域的技术人员，依据本发明的内容，还可做出相应调整、替换和变形，调整、变形或替换等情况也应在本发明保护范围内。
本发明使用二代测序技术方法，一次性对实验恒河猴20对常染色体上的19个STR位点进行检测，从而实现对实验恒河猴的遗传背景鉴定。本发明为同时扩增实验恒河猴19个STR基因座，提供了一种复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物混合物(扩增以下19个STR基因座的特异性扩增引物，19个STR基因座为：D10S611、D11S2002、D13S765、D15S823、D18S537、D1S548、D3S1768、D4S2365、D5S1457、D6S1691、D6S2741、D6S276、D6S2883、D6S291、D6S2972、D6S501、D7S794、D8S1106、D9S921)；反应预混液(预混液包括MgCl215mM、Tris-HCl 100mM(pH8.0)、KCl500mM、dNTPs(即dATP、dTTP、dCTP和dGTP的浓度为2.5mM))、DNA聚合酶5U/μL、DNA模板＜500ng(DNA模板来源于血液)和去离子水。
实施例1
(1)基因组制备
1)使用EDTA-Na抗凝管采集12只实验恒河猴外周血各3mL体积左右；
2)使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，DP304)提取实验恒河猴全血基因组DNA；
3)样品质控
经琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，通过NanoDrop2000检测基因组DNA质量。
如图1所示，DNA基因组的电泳条带清晰可见，无明显降解，且无RNA污染；DNA浓度≥20ng/μL，总量≥(200+N×30)ng(N为panel数目)。
(2)文库构建
1)引物设计
a)单位点PCR条件优化
针对19个STR位点，设计合成引物(设计引物时需考虑特异性引物碱基分布要随机、Tm值相近、GC含量在40％-60％之间、引物自身及引物之间不应存在互补序列；同时也要保证引物扩增的特异性)，并进行评估和优化。挑选能够以标准基因组为模板，扩增获得清晰单一条带的引物(具体引物信息见表1)用于后续实验。
表1引物序列信息
b)多重PCR引物panel优化
按每个panel 19对引物的标准，将经步骤a)优化后的引物混合为多重PCR引物panel，以标准基因组为模板进行扩增。基于测序优化，我们能够判断多重体系中每对引物是否高效、特异地进行扩增，并以此调整，优化多重PCRpanel中的引物组成及浓度。
2)样本目标片段多重PCR反应
使用优化后的多重PCR引物panel，以样品基因组为模板，使用进行多重PCR扩增。经质控后，将以同一个样品基因组DNA为模板的所有多重PCR引物panel的扩增产物混合，并确保每个位点引物扩增产物的量相当。通过大量反复试验确定复合扩增中的各个参数，包括模板DNA质量、特异性引物的浓度、引物混合物的体积、反应预混液离子强度、DNA聚合酶酶量、退火温度、循环参数及复合扩增体系的体积变化等，使扩增产物达到特异、稳定等建库要求。最终确定的具体引物浓度、PCR反应体系和扩增条件分别见表2、表3和表4。
表2特异性引物浓度
表3试剂盒扩增体系
| 试剂盒组分名称 | 体积/μL |
| 反应预混液 | 9 |
| DNA聚合酶 | 0.25 |
| 特异性引物的混合物 | 2 |
| 模板DNA | 2.5 |
| 去离子水 | Add to 50 |
表4试剂盒扩增条件
3)样本添加特异性标签序列
以第一轮PCR扩增产物为模板，利用带有index序列的引物(illumina Hiseq4000的通用序列，见表5)，使用试剂HotStart Taq(购自Takara公司，R007WZ)进行PCR扩增(PCR反应体系及条件分别见表6和表7)向文库末端引入和Illumina平台兼容的特异性标签序列。反应采用12个循环数的PCR程序，尽可能降低PCR的倾向性。
表5 index接头序列信息
| 名称 | 序列(5’→3’) |
| index p5 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC |
| index p7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT |
表6添加index接头的PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 10×buffer(Takara) | 1μL |
| dNTP(2.5mM) | 0.8μL |
| <![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mM)]]> | 0.2μL |
| 上游引物 | 0.3μL |
| 下游引物 | 0.75μL |
| HotTaq 5U/μL(Takara) | 0.04μL |
| 模板 | 1μL |
| 去离子水 | 5.91μL |
| 总体积 | 10μL |
表7添加index接头的PCR反应条件
4)定量后上机测序
将所有样品Index PCR扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的FastTargetTM测序文库，文库的片段长度分布经Agilent 2100Bioanalyzer验证。文库摩尔浓度精确定量后，扩增产物通过市面上主流测序平台(如Illumina Hiseq4000、BGISEQ-500等)进行测序分析。对测序后的数据使用flash、blast+和分型算法在线软件(http://bioinfo.geneskybiotech.com/software/ssrseq_type/v1.0)等进行生物信息学分析，得到DNA分型数据(见表8)。
表8 DNA分型数据
(3)结果分析
使用本发明试剂盒对样本进行二代测序，进行亲缘关系的分析(结果如表9所示)。
表9实验猴亲缘关系结果
| 子代 | 母 | 答案 |
| A2 | A1 | √ |
| B2 | B1 | √ |
| C2 | C1 | √ |
| D2 | D1 | √ |
| E2 | E1 | √ |
| F2 | F1 | NA |
根据表5结果可以发现，将采集的12只实验恒河猴样本进行亲缘关系配对，其中5对的匹配结果和正确答案一致。F1和F2未能在此次检测中成功配对母子关系，我们推测在采样环节弄错F1和F2的母子关系，导致配对失败。同时，我们另外采用一代测序技术荧光标记PCR-毛细管电泳法对12只实验恒河猴进行亲缘关系鉴定(一代测序荧光标记PCR毛细管电泳法结果见表10)，从19个位点中随机选择17个STR位点，分型结果显示亲缘关系与二代测序结果基本相符。
表10荧光标记PCR毛细管电泳结果推测的DNA分型数据
综上表明，使用本发明对实验恒河猴进行基于二代测序对实验恒河猴STR遗传标记检测，可对大型封闭群实验恒河猴进行有效的亲缘鉴别，从而深入对实验恒河猴的遗传多样性、谱系及起源进行分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一种实验恒河猴STR遗传标记组合，其特征在于：包括以下19个实验恒河猴STR遗传标记：D10S611、D11S2002、D13S765、D15S823、D18S537、D1S548、D3S1768、D4S2365、D5S1457、D6S1691、D6S2741、D6S276、D6S2883、D6S291、D6S2972、D6S501、D7S794、D8S1106和D9S921。
2.用于检测权利要求1所述实验恒河猴STR遗传标记组合的引物组，其特征在于：包括SEQID NO：1~38所示的引物。
3.用于检测权利要求1所述实验恒河猴STR遗传标记组合的试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的引物组。
4.一种基于NGS的对实验恒河猴STR遗传标记进行检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）提取待检测实验恒河猴个体的DNA作为模板；
2）使用SEQ ID NO：1~38所示的引物进行第一轮PCR扩增反应；以第一轮PCR扩增产物为模板，利用带有Index序列的引物，通过第二轮PCR扩增向文库末端引入和Illumina平台兼容的特异性标签序列；
3）对第二轮PCR产物进行NGS测序及基因型判定。
5.根据权利要求4所述的基于NGS的对实验恒河猴STR遗传标记进行检测的方法，其特征在于：所述提取实验恒河猴的DNA：是采集实验恒河猴的血液。
6.根据权利要求4所述的基于NGS的对实验恒河猴STR遗传标记进行检测的方法，其特征在于：所述第一轮PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；4℃彻底延伸。
7.根据权利要求4所述的基于NGS的对实验恒河猴STR遗传标记进行检测的方法，其特征在于：所述第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50μL：扩增预混液9μL，DNA聚合酶0.25μL，引物混合液2μL，模板DNA2.5μL，其余为去离子水。
8.根据权利要求7所述的基于NGS的对实验恒河猴STR遗传标记进行检测的方法，其特征在于：如SEQ ID NO：1~2、SEQ ID NO：5~6、SEQ ID NO：11~24、SEQ ID NO：27~32、SEQ IDNO：35~38所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.1μM，如SEQ ID NO：3~4、SEQ ID NO：25~26所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.15μM，如SEQ ID NO：9~10、SEQ ID NO：33~34所示的引物在扩增体系中的终浓度为0.05μM，如SEQ ID NO：7~8所示的引物在扩增体系中的终浓度为2μM。
9.权利要求1所述的实验恒河猴STR遗传标记组合、权利要求2所述的引物组、权利要求4所述的方法在用于实验恒河猴的个体识别、谱系鉴定、亲缘鉴定方面的应用。
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