CN116034947A - 一种构建血管瘤动物模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种构建血管瘤动物模型的方法，属于动物模型领域。所述方法是将血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞注入动物皮下组织，5‑30天后得到血管瘤动物模型。本发明基于血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞，成功构建了血管瘤动物模型，该动物模型构建时间短，病理特征与血管瘤病理特征一致，能够模拟出体内血管瘤从增殖到消退演化的特征，为血管瘤体外机制研究及新靶向药物的筛选提供了重要的动物模型载体平台。

Description

一种构建血管瘤动物模型的方法

技术领域

本发明属于动物模型领域，具体涉及一种基于血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞构建血管瘤动物模型的方法。

背景技术

婴儿血管瘤(infantile hemangioma,IH)是婴儿最常见的皮肤肿瘤，是以内皮细胞异常活化增殖而形成的脉管肿瘤。其具有典型的生长特征：先快速增殖后缓慢消退。目前IH的确切发病机制仍然不明，但病理性血管生成与血管瘤的发病机制密切相关。血管生成是指内皮细胞在缺氧或生长因子如VEGF等刺激作用下，内皮细胞由静息状态激活成具有增殖、迁移能力的活化状态，并最终融合成新生血管的过程。目前，包括VEGF/VEGFR通路与Notch通路在内的多条信号通路均参与了对血管生成的调控，从而影响IH的发生发展过程。此外，影响HemEC血管生成也是包括普萘洛尔在内的受体阻滞剂治疗血管瘤的作用机制之一。然而，目前IH基础研究多集中在细胞水平，这极大的限制了对IH发病机制的探索与新靶向药物的开发及使用。故构建成熟且稳定的IH动物模型尤为重要。

目前，已经报道的IH动物模型的构建方法主要分为组织移植法与细胞注射法。其中组织移植法较为明显的缺点是瘤体移植后需要等待漫长的时间才能成瘤，通常移植后30天瘤体才开始出现，移植60天左右瘤体生长至最大。由于极大的增加了研究所需的时间成本，加之高失败率和无法大量建模的缺陷，目前国内外研究者已舍弃组织移植法构建IH动物模型。细胞注射法通常是将血管瘤干细胞(hemangioma-derived stem cell,HemSC)进行裸鼠皮下注射后构建的(细胞注射法建立裸鼠血管瘤模型的研究进展，临床小儿外科杂志，2014年4月，第13卷第2期)。然而，一方面，由于HemSCs所占增殖期血管瘤组织中的细胞比例极低，仅为0.2％，导致阳性分选率控制较为困难，成瘤效率低；另一方面，该方法在裸鼠皮下注射后7天才开始形成部分血管，注射后30天形成大量血管，注射后60天部分血管开始萎缩，建立模型的时间也较长，增加了研究所需的时间成本。

为了克服上述问题，亟需开发出一种成瘤效率高、建模时间短的构建IH动物模型的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞构建血管瘤动物模型的方法。

本发明提供了一种构建血管瘤动物模型的方法，所述方法是将血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞注入动物皮下组织，5-30天后得到血管瘤动物模型。

进一步地，所述血管瘤为婴儿血管瘤。

进一步地，所述血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞的数量比为1：(0.8-1.2)。

进一步地，所述血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞的数量比为1：1。

进一步地，所述血管瘤内皮细胞是CD31表达阳性的血管瘤内皮细胞。

进一步地，所述CD31表达阳性的血管瘤内皮细胞是按照以下方法制备得到的：将血管瘤组织碎块制备成单细胞悬液，培养，经CD31免疫磁珠分选纯化，得到CD31表达阳性的血管瘤内皮细。

进一步地，所述血管瘤动物模型是在将血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞注入动物皮下组织7-28天后得到的。

进一步地，所述血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞是与Matrigel基质胶混匀后注入动物皮下组织的。

进一步地，所述动物为哺乳动物，优选为裸鼠。

本发明还提供了上述方法构建得到的血管瘤动物模型。

血管瘤内皮细胞(Hemangioma-derived endothelial cell,简称HemEC),血管瘤周细胞(Hemangioma-derived pericyte cell,简称HemPC)。

本发明基于HemEC与HemPC，成功构建了婴儿血管瘤动物模型，该动物模型构建时间短，病理特征与IH病理特征一致，能够模拟出体内IH从增殖到消退演化的特征，为IH体外机制研究及新靶向药物的筛选提供了重要的动物模型载体平台。

与现有技术中将血管瘤干细胞进行裸鼠皮下注射构建裸鼠婴儿血管瘤模型的方法相比，本发明基于HemEC与HemPC的构建方法具有以下优势：一方面，本发明采用的HemEC是增殖期IH组织中细胞占比最多的细胞，阳性分选率更容易控制，成瘤效率高；另一方面，本发明的构建方法在注射14天后便能成功构建婴儿血管瘤动物模型，明显缩短了建模的时间，减少了研究所需的时间成本。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：血管瘤临床标本及组织病理学验证。A.4月女性右聂顶部增殖期IH；B.3月男性左腹壁增殖期IH；C.3月女性左前臂增殖期IH；D.病例C瘤体切开图，可见鲜红色增殖期IH组织，血供丰富；E.增殖期IH组织HE染色，可见大量的内皮细胞及血管网；F.增殖期IH组织GLUT-1染色阳性。

图2：原代HemEC的培养与鉴定结果。A-C.血管瘤原代细胞培养第3天镜下观，可见细胞形态呈长梭形；D-F.血管瘤内皮细胞具有“成管”特征性生长；G-I.细胞换液后形态更加清晰可见；J-L.第7天细胞长满皿底，呈现多层生长。图3：原代HemEC的分选与鉴定结果。A-B.分选前细胞形态，细胞呈长梭形，可多层生长，无明显接触挤压；C-F.分选后细胞形态，细胞呈短梭形(C-D)或椭圆形、类圆形(E-F)；G-I.细胞免疫荧光染色鉴定：蓝色为DAPI(G)，绿色为vWF(H)，合成图(I)；J-L.流式细胞学鉴定：对照组(J)，经CD31⁺磁珠分选后的实验组(K)，合成图(L)。

图4：婴儿血管瘤动物模型的构建及瘤体病理学特征。A.裸鼠动物模型构建流程示意图；B-C.细胞注射后裸鼠皮下形成类椭圆形“包块”；D-F.第14天取材裸鼠瘤体外观照；G-I.第14天取材裸鼠病理学染色结果：HE染色可见大量新生血管腔，内可残留红细胞(G)；CD31染色阳性(H)；GLUT1染色阳性(I)；J-L.第28天取材裸鼠瘤体外观照，瘤体外观红润程度较第14天弱；M-O.第28天取材裸鼠病理学染色结果：HE染色见新生血管腔减少，内可残留红细胞(M)；CD31染色阳性(N)与GLUT1染色阳性(O)程度均较第14天弱。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

主要材料与试剂来源：

胎牛血清、EBM-2培养基(美国Gibco公司)，兔抗人Glut-1多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，兔抗人CD31多克隆抗体(美国Abcam公司)，CD31免疫磁珠与肿瘤细胞解离试剂盒(美国Miltenyi公司)，Matrigel基质胶(美国康宁公司)。

经手术切除的增殖期IH组织标本来源于从2021.3～2021.8在四川大学华西医院小儿外科行手术切除且未经治疗的3例IH，经病理证实为增殖期IH(图1)，所有患者监护人均自愿选择手术切除治疗，并拒绝口服普萘洛尔等治疗方案。

HemPC是按照现有技术(Notch信号通路对婴幼儿血管瘤周细胞分化的调控作用，中华小儿外科杂志，2016年9月，第37卷第9期)中记载的方法分离并鉴定的。

BALB/c裸鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，共12只雌鼠并随机分为2组，由四川大学华西医院动物实验基地统一饲养。本发明实验通过四川大学华西医院伦理委员会批准(20210310)，所有患者监护人均签署知情同意书。

实施例1：基于血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞构建婴儿血管瘤动物模型的方法

1.原代HemEC的提取

即取经手术切除的增殖期IH组织标本，置于装有不含血清的EBM-2培养基的无菌离心管，转移至超净台后将组织剪成2mm×2mm×2mm的组织碎块。按照说明书方法，采用人肿瘤细胞解离试剂盒将血管瘤组织碎块进行单细胞悬液制备。随后经离心、过滤及重悬细胞沉淀后，将细胞悬液接种于6cm培养皿中培养。待细胞贴壁且密度达到皿底80％面积后，进行传代及分选鉴定。

2.原代HemEC的培养

将细胞接种于10cm细胞培养皿，加入含有10％胎牛血清的EBM-2培养基培养，随后放入37℃含5％的CO₂孵箱，每隔2～3d换液，待细胞达到培养皿80％～90％密度时进行传代。

3.原代HemEC的分选

待细胞达到培养皿80％～90％密度时，将贴壁细胞经胰酶消化后，收集细胞沉淀。按照说明书方法，采用CD31免疫磁珠法用磁力架进行HemEC分选，得到CD31表达阳性(CD31⁺)的HemEC。分选后的细胞一部分用于流式细胞学与细胞免疫荧光鉴定，其余部分继续培养用于后续动物实验。

4.裸鼠动物模型的构建

按照1:1的比例，将4×10⁶个HemPC与4×10⁶个分选后的HemEC混匀于200μLMatrigel基质胶后，采用注射器注入裸鼠皮下组织内。待植入完成后，于第7天、第14天和第28天用游标卡尺测量小鼠瘤体最大横径a与最小横径b，根据公示V＝(π/6)×a×b²估算瘤体体积变化。

植入完成后第14、28天，采用脊椎脱臼法处死裸鼠，随后将瘤体从裸鼠皮下组织中完整分离后，常规进行拍照测量大小，放入4％的甲醛中固定后经石蜡包埋及切片等步骤处理后，进行HE染色及免疫组化染色分析，并计算微血管密度(Microvessel density,MVD)，MVD计算方法为在HE切片中随机选取4个视野，对含有红细胞的微血管腔结构进行量化，以血管/mm²计算。

统计学方法：采用SPSS 23.0软件，计量资料以

表示，组间比较采用t检验或方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。所有试验均重复3次。

以下为实验结果数据。

1.原代HemEC的培养与鉴定结果

单细胞悬液接种后第3天，镜下可见呈现长梭形、椭圆形的细胞形态，密度可达约40％的皿底面积(图2A-C)；同时可观察到细胞具有“成管”特征性生长(图2D-F)。予以换液后第一天观察，细胞中漂浮物成分减少明显，细胞数量及密度继续增大，形态更加清晰可见(图2G-I)。继续生长到第6或第7天，细胞铺满整个皿底，部分细胞之间呈现重叠多层生长(图2J-L)。

2.原代HemEC的分选与鉴定结果

将生长达到80％～90％皿底面积的原代细胞用胰酶消化后进行磁珠分选。分选前，细胞长满后细胞间存在一定程度的相互挤压，可呈长梭形但不呈现出接触抑制的特点(图3A-B)。分选后，贴壁细胞主要呈现短梭形(图3C-D)、椭圆形或类圆形(图3E-F)。细胞免疫荧光可见vWF染色阳性(图3G-I)，CD31⁺的内皮细胞比例达到96.4％(图3J-L)。以上结果表明，经分选纯化后的内皮细胞鉴定为CD31⁺的HemEC，可用于后续动物实验。

3.婴儿血管瘤动物模型的验证

采用细胞注射法将HemPC与分选后的HemEC混匀于Matrigel基质胶后接种于裸鼠皮下(图4A)，当即可以观察到皮下形成类椭圆形“包块”(图4B-C)。接种第7天时，皮下瘤体形成；第14天时，瘤体体积最大。分别在第14天(图4D-F)与第28天(图4J-L)从裸鼠皮下将瘤体取下，随后进行HE染色及免疫组化染色分析。其中，第14天瘤体体积显著大于第28天(214±27vs 86±18，P＝0.0024)。

4.裸鼠瘤体病理学特征

与裸鼠瘤旁正常皮下组织对比，第14天裸鼠瘤体外观上色泽更红润(图4D-F)，HE镜下可见大量的新生血管腔，管腔内可见红细胞残留(图4G)，GLUT1与CD31染色阳性且高表达(图4H-I)。相较于第14天瘤体，第28天裸鼠瘤体外观红润程度降低，镜下可见血管腔密度与数量均减少(图4M)，GLUT1与CD31表达均减弱(图4N-O)。第14天瘤体微血管密度高于第28天瘤体，且差异显著(0.17cm³±0.02cm³ vs 0.10cm³±0.03cm³，P＝0.03)。

上述实验结果表明，本发明实施例1的方法成功构建了婴儿血管瘤动物模型，该动物模型构建时间短，病理特征与IH病理特征一致，能够模拟出体内IH从增殖到消退演化的特征，为IH体外机制研究及新靶向药物的筛选提供了重要的动物模型载体平台。

Claims (10)

1.一种构建血管瘤动物模型的方法，其特征在于：所述方法是将血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞注入动物皮下组织，5-30天后得到血管瘤动物模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血管瘤为婴儿血管瘤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞的数量比为1：(0.8-1.2)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞的数量比为1：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血管瘤内皮细胞是CD31表达阳性的血管瘤内皮细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CD31表达阳性的血管瘤内皮细胞是按照以下方法制备得到的：将血管瘤组织碎块制备成单细胞悬液，培养，经CD31免疫磁珠分选纯化，得到CD31表达阳性的血管瘤内皮细。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血管瘤动物模型是在将血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞注入动物皮下组织7-28天后得到的。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血管瘤内皮细胞与血管瘤周细胞是与Matrigel基质胶混匀后注入动物皮下组织的。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物为哺乳动物，优选为裸鼠。

10.权利要求1-9任一项所述方法构建得到的血管瘤动物模型。

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