CN110419505B - 小鼠食管癌模型及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及小鼠食管癌模型及其建立方法，建立方法包括利用化学致癌剂诱导小鼠建立原发性小鼠食管癌模型，得到食管癌原位肿瘤组织；将食管癌原位肿瘤组织移植至裸鼠皮下并进行体内培养，得到移植肿瘤组织；将移植肿瘤组织先后通过快速贴壁法去除部分纤维细胞、上皮培养法富集上皮肿瘤细胞和快速消化法去除残余纤维细胞，分离得到小鼠食管癌模型。本发明建立了一种可以用于快速构建免疫健全小鼠食管癌模型的小鼠食管癌模型，以及形成稳定可靠的小鼠食管癌模型建立方法，用于填补小鼠食管癌模型的空白，解决目前因缺少小鼠食管癌模型而产生的相关难题，为食管癌的肿瘤免疫研究提供合适的研究工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及小鼠食管癌模型及其建立方法。
背景技术
我国是世界上食管癌发病率和死亡率较高的国家，占全世界的50％以上，每年约有25万新诊断出的食管癌病例，食管癌疾病严重危害国人生命与健康；而食管鳞状细胞癌是最主要的食管癌类型。食管鳞状细胞癌的治疗目前仍以传统的化疗和放疗还有手术治疗为主，晚期病人治愈率低。免疫治疗已经在黑色素瘤、肺癌等其他癌症中证明了它的巨大潜力；但是目前在食管癌研究领域，免疫治疗的相关研究很少。这其中很重要的一个原因是目前的科研领域缺少小鼠的食管癌细胞系，从而不利于快速构建具有健全免疫微环境的食管癌肿瘤模型。
动物模型在肿瘤研究中起着重要作用，与细胞实验相比，能够更好地了解各种分子机制之间的转移和肿瘤宿主之间的相互作用，阐明各种相关疾病的病理生理学，并间接促进新型抗肿瘤干预措施的开发。目前在食管癌研究领域用到的动物肿瘤模型大多都是将人的肿瘤组织或细胞系移植到裸鼠上构成的PDX或CDX肿瘤模型，《实验动物科学》2015年第32卷第5期第59-61页报道了一篇文献“人体肿瘤PDX移植模型的优与劣”，指出动物肿瘤模型的最大缺点是肿瘤宿主的免疫系统缺失或不健全，不能用于免疫微环境相关的机理研究以及疫苗治疗、 PD1/PDL-1阻断等免疫治疗研究。虽然现在随着免疫系统人源化小鼠模型的出现，也许科学家们可以在免疫系统人源化小鼠身上建立PDX肿瘤模型，进行一些简单的肿瘤免疫研究，但是从《中国免疫学杂志》2016年第32卷第3期第289-297页报道的文献“免疫系统人源化小鼠的构建及其应用进展”，可以看出免疫系统人源化小鼠模型目前还不够成熟，建立过程复杂而且容易失败，关键是重建的免疫系统是否完善，重建的免疫系统是否可以产生足够强的功能效应都存在很大的疑问；目前免疫系统人源化小鼠模型较少应用于肿瘤免疫研究，而应用于食管癌免疫研究的人源化小鼠模型截至目前尚未有报道。另外，免疫系统人源化小鼠模型的费用相当高昂。所以，从目前来看，免疫系统人源化小鼠尚未能很好地应用于食管癌的肿瘤免疫研究。
除了异种移植的PDX肿瘤模型，目前也已经有报道建立了小鼠的原发食管癌模型。国内外，现在已经有科学家通过化学致癌剂或基因缺陷等方法建立了小鼠食管癌的原发癌模型，例如，《苏州大学学报》医学版2010年第30卷第5期中报道的“4NQO诱发C57BL/6小鼠舌癌及食管鳞状细胞癌模型的建立”，《世界华人消化杂志》2013年第21卷第2期第116-121 页报道的“C57BL/6小鼠食管鳞状细胞癌早期病变的形态学改变”，《国际肿瘤学杂志》2013 年第40卷12期915-918页报道的“食管癌小鼠模型研究进展”，以及国外的《Mol Cancer Res》2006年第4卷第6期第401-410页报道的“p53 Transgenic Mice Are Highly Susceptibleto 4-Nitroquinoline-1-Oxide-Induced Oral Cancer”。但是无论是通过化学致癌剂的方法还是基因缺陷等其他的方法，建立一次小鼠食管原发癌模型一般都需要耗费六个月甚至更长的时间。比较典型的通过化学致癌剂诱导小鼠食管癌形成的模型如下：让小鼠饮用含化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)的水16个星期后，改用无菌水继续喂养12～16个星期，可以诱导明显的食管癌肿瘤组织的形成。这样，每次需要建立小鼠食管癌动物模型时，都需要从化学致癌剂诱导肿瘤开始，这样耗费时间过长，对研究很不利；可能正是由于此原因，通过化学致癌剂或基因缺陷的方法建立的小鼠原位食管癌模型，并没有广泛被应用于肿瘤学的功能研究。目前尚未有基于原位性小鼠食管癌模型进一步建立小鼠食管癌细胞系的报道。
目前得到广泛应用的食管癌肿瘤细胞系基本都是人的肿瘤细胞系；虽然《Anticancer Research》2007年第27期175-182页报道的文献“Association BetweenDuodenal Contents Reflux and Squamous Cell Carcinoma–Establishment of anEsophageal Cancer Cell Line Derived from the Metastatic Tumor in a Rat RefluxModel”，公开了建立的动物食管癌肿瘤细胞系，但是只有大鼠的食管癌细胞系。在构建大鼠食管癌细胞系的模型中，研究者先利用十二指肠内容物反流的模型诱导大鼠食管癌的形成，然后取胸部的转移肿瘤组织，剪碎并洗涤后置于装有DMEM培养基(含10％FBS)的培养瓶中进行培养，一星期换液两次，过程中将小克隆用无菌的棉花签刮掉，只留下最大的克隆。30天后，将克隆消化成单细胞进行培养。在该细胞系的建立体系中，采用的是转移肿瘤组织而并非食管原位组织，而且后期并没有很明确的指标可以判定所建细胞系来源于食管；因而所建细胞系很难明确为食管癌细胞系。同时，该模型采用的细胞建系方法，只保留最大的克隆，这样可能无法最大程度呈现肿瘤细胞的异质性。另外，组织培养法得到的最大克隆中，可能细胞成分比较复杂，后期仍要培养较长时间才能达到纯化和富集肿瘤上皮细胞的目的。虽然该模型在2007年就建立了大鼠的食管癌细胞系，但是到目前为止，这些大鼠食管癌细胞系在研究中很少被应用。除了上述的一些不足外，大鼠肿瘤细胞系本身的应用性不如小鼠肿瘤细胞系更好。首先，在实验中,大鼠往往比小鼠更难操作；同时，相对于大鼠，小鼠的亲缘性更接近于人类。因而，小鼠模型在肿瘤研究中的应用往往要比大鼠模型多。而更重要的是，在肿瘤免疫研究的实验中，往往需要免疫缺陷动物模型作为免疫健全动物模型的对照；而免疫缺陷的大鼠目前在市面上品种少，供应也少，不容易购买；相比于大鼠，小鼠的免疫缺陷技术更加成熟，免疫缺陷的小鼠供应更方便，种类也明显更多。因而小鼠肿瘤细胞系相对于大鼠肿瘤细胞系在肿瘤免疫研究中更有优势。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的是建立一种可以用于快速构建免疫健全小鼠食管癌模型的小鼠食管癌细胞系，以及形成稳定可靠的小鼠食管癌细胞系建立方法，用于填补小鼠食管癌细胞系的空白，解决目前因缺少小鼠食管癌细胞系而产生的相关难题，为食管癌的肿瘤免疫研究提供合适的研究工具。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
本发明一方面在于提供了一种小鼠食管癌模型，所述小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系命名为mEC25，所述小鼠食管癌细胞系于2019年7月5日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2019158。
命名缘由为m意指小鼠(mouse)来源，EC为食管癌Esophageal Cancer的首字母缩写， 25中的“2”意指通过裸鼠移植两代，“5”意指通过上皮培养基选择培养5代。
本发明的另一方面在于提供了上述小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系的子代细胞。
本发明的还提供了上述小鼠食管癌模型的建立方法，包括以下步骤：
S1.通过饮水法，利用化学致癌剂诱导小鼠建立原发性小鼠食管癌模型，得到食管癌原位肿瘤组织；
S2.将S1得到的食管癌原位肿瘤组织移植至裸鼠皮下并进行体内培养，得到移植肿瘤组织；
S3.将S2得到的移植肿瘤组织解离成单细胞，先后通过快速贴壁法去除部分纤维细胞、上皮培养法富集上皮肿瘤细胞和快速消化法去除残余纤维细胞，分离得到小鼠食管癌细胞系。
进一步，所述S3步骤具体操作如下：将S2步骤得到的移植肿瘤组织剪碎在培养箱中进行第一次孵育消化成单细胞，得到的单细胞悬液先通过过滤网进行过滤，后对过滤后的细胞悬液进行离心分离，此处的离心分离的条件为转速1000～1200rpm、离心时间3～5min，随后用 10％FBS-DMEM培养基进行重悬，并调节细胞浓度至1x106细胞/mL，置于培养皿中于温度 37℃、5％CO2进行贴壁培养，30min后吸出未贴壁的细胞悬液至离心管中离心，此处的离心分离的条件为转速1000～1200rpm、离心时间3～5min，吸弃上清，沉淀的细胞用上皮培养基重悬，并置于新的培养皿中培养，培养过程中隔天更换上皮培养基，培养至细胞融合率达 80％±0.5％后，用胰酶消化后传代，通过连续传代培养直至得到小鼠食管癌细胞系。
将S1步骤得到的原发性小鼠食管癌组织移植至免疫缺陷小鼠中以使肿瘤细胞获得稳定增殖能力，本发明的建立方法中，移植代数不限定，至少在两代以上。通过快速贴壁培养去除部分纤维细胞后，离心得到的细胞用上皮培养基培养，用于富集上皮肿瘤细胞，富集培养代数不限定，至少5代。利用上皮培养基富集上皮肿瘤细胞后，通过胰酶快速消化的方法去除残余纤维细胞，快速消化的重复次数不限定，至少2次。
进一步，所述S3步骤中，先用上皮培养基培养5代或5代以上，再用10％FBS-DMEM培养10代或10代以上，使用10％FBS-DMEM培养时，前两次传代中，每次传代先用0.25％胰酶消化0.5～2min，吸除已经消化下来的细胞，PBS洗涤两次后继续用0.25％胰酶消化5～6min，利用10％FBS-DMEM终止消化后离心，离心得到的细胞用PBS至少洗涤一遍后，用 10％FBS-DMEM重悬继续培养。
进一步，所述胰酶消化的条件为温度37℃，CO2浓度5％。
进一步，所述第一次孵育消化具体为将S2步骤得到的移植肿瘤组织剪碎后，置于含 1mg/ml胶原蛋白酶的无血清DMEM培养基中，置于培养箱中于37℃、5％CO2的条件下孵育30min消化成单细胞。
进一步，所述S1步骤中的化学致癌剂为4-硝基喹啉-1-氧化物，以下简称4NQO，使用的小鼠为C57BL/6小鼠。
进一步，所述化学致癌剂使用时，利用1,2-丙二醇将4-硝基喹啉-1-氧化物配制成5mg/ml 的储存液，再利用无菌水配制成100ug/ml的4NQO水溶液。
进一步，所述S2步骤具体为将食管癌原位肿瘤组织剪成小块，用PBS清洗后，即刻移植至麻醉好的4～6周龄的Balb/C裸鼠皮下，3～4个星期后，取下瘤体剪成小块再次移植至Balb/C 裸鼠皮下，4个星期后，便能得到能够用于分离食管癌细胞系的移植肿瘤组织。
本发明得到的小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系具有一定的形态异质性，标志物表达具有上皮特性、鳞状特性以及一定的免疫抑制特性；还具有比较好的增殖、迁移能力以及体内成瘤能力，可将其用于建立免疫健全的小鼠食管癌模型。该小鼠食管癌细胞系高表达 cytokeratin、E-cadherin和β-catenin等上皮细胞的特征分子以及p63和SOX2等鳞状癌相关的特征分子；另外，该小鼠食管癌细胞系低表达MHCI分子，表明具有免疫逃逸潜力。
在本发明提供的小鼠食管癌模型的建立方法中，4NQO诱导形成的原位癌组织需要通过移植至免疫缺陷小鼠体内以使得肿瘤细胞获得更好的成系能力，其关键点的核心在于，通过裸鼠体内生长的过渡方法，可以使肿瘤细胞获得更强的成系能力，但不限定移植的代数，两次或两次以上均可。
在本发明提供的小鼠食管癌模型的建立方法中，从肿瘤组织中解离下来的细胞通过快速贴壁法、上皮培养法、快速消化法三步法，达到分离肿瘤上皮细胞的目的。首先通过快速贴壁的方法去除部分纤维细胞，以避免因为纤维细胞太多而影响肿瘤细胞的生长和后期分离，其关键点在于利用肿瘤相关成纤维细胞可以快速贴壁，而肿瘤上皮细胞往往需要较长时间(一般超过一个小时)进行贴壁的原理，初步去除部分成纤维细胞；其次，通过上皮细胞培养基选择培养的方法富集肿瘤上皮细胞，本发明选择的上皮培养基可以促进上皮细胞的生长，而其他细胞，例如纤维细胞和单核细胞在该培养基培养条件下生长缓慢，通过一定代数的选择培养，可以达到富集肿瘤上皮细胞的目的，其关键点的核心是通过选择培养富集肿瘤上皮细胞，不限定选择培养的代数，至少5代即可；最后，通过快速消化0.5～2分钟的方法，去除残余的纤维细胞和其他杂细胞，其关键点在于利用消化过程中纤维细胞快速脱落(2分钟内)而食管癌上皮细胞则需要较长时间才能消化下来(至少5分钟)的特点，进一步纯化肿瘤上皮细胞，快速消化重复的次数不限定，至少2次。
本发明提供的小鼠食管癌模型的建立方法中，基于肿瘤组织中解离下来的全细胞，通过三步法建立肿瘤上皮细胞系是其中的核心之一。这个核心一方面可以在肿瘤上皮细胞的早期培养中保留一定的肿瘤相关成纤维细胞，这些细胞可以促进肿瘤上皮细胞的体外生存和增殖，有利于肿瘤细胞的最后成系；另一方面可以尽可能多地保留肿瘤组织中肿瘤细胞的异质性。
附图说明
图1为4NQO诱导C57BL/6小鼠形成的食管原位癌组织的图片；
图2为小鼠食管原位癌组织在裸鼠皮下移植形成实体瘤；
图3为胰酶消化后的肿瘤组织分离的细胞通过上皮培养基培养5代的形态图；
图4为建立的小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系mEC25形态图；
图5为小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系mEC25分子标志物的荧光检测；
图6为小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系mEC25的H2kb和H2kd表达水平(流式检测)；
图7为小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系mEC25的生长曲线；
图8为小鼠食管癌模型mEC25的迁移能力检测结果图；
图9为小鼠食管癌模型中的小鼠食管癌细胞系mEC25的侵袭能力检测结果图；
图10为mEC25细胞系在C57BL/6小鼠皮下形成实体瘤的图片；
图11为mEC25细胞系在C57BL/6小鼠体内成瘤的比例图。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明：
本发明公开了小鼠食管癌模型及其建立方法，需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明内。本发明的建立方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、范围内，对本文所述的制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下实施例中所用到的原始试剂和材料均可从商家购买。其中：
本发明实验用到以下动物：免疫缺陷Balb/C 4-5周龄裸鼠购自广东省实验动物中心，免疫力正常C57BL/6小鼠购自广东省实验动物中心。
本发明实验用到以下抗体：pan-cytokeratin抗体、E-cadherin抗体、β-catenin抗体、p63 抗体和SOX2抗体购自英国Abcam公司；荧光鼠二抗和荧光兔二抗均购自美国LifeTechnologies公司；AlexaFluor 488标记的H2kb和H2kd抗体购自eBioscience公司。
本发明实验用到以下制剂：1,2-丙二醇、4-硝基喹啉-1-氧化物、胶原蛋白酶、均购自Sigma，食管上皮培养基来源于ScienCell。
实施例一
本发明的小鼠食管癌模型的建立方法如下：
(1)构建原发性小鼠食管癌模型
利用1,2-丙二醇将4-硝基喹啉-1-氧化物配制成5mg/ml的储存液，再利用无菌水配制成 100ug/ml的4NQO水溶液。4NQO水溶液分装至小鼠饮水瓶中，用锡箔纸包裹水瓶，置于小鼠笼架中供小鼠饮用。定期留意水瓶中溶液余量，并随时补加100ug/ml的4NQO水溶液。小鼠持续饮用含有100ug/ml 4NQO的无菌水16个星期后，改成饮用纯无菌水；饮用纯无菌水12 个星期后按动物伦理要求处死小鼠，在安全柜内剪下食管，观察原位癌形成情况，并通过HE 染色观察组织的病理状态，结果如图1所示；另外，取其他身体特征相当的小鼠作为对照组，对照组把4NQO水溶液替换为纯无菌水按照上述操作进行，观察食管形态，结果如图1所示。
图1中的a11为对照组的食管组织形态图，a12为对照组的食管组织经HE染色后观察到的组织状态图；b11为4NQO诱导小鼠形成的食管组织形态图，b12为4NQO诱导小鼠食管组织经HE染色后观察到的组织状态图。
(2)食管癌组织移植至裸鼠皮下
对于(1)中形成原位食管癌的食管，小心将肿瘤组织取下，在预冷的PBS中快速清洗，然后用干净无菌的手术剪剪成3mm x 3mm的小块，肿瘤小块利用预冷的PBS快速清洗；提前麻醉四只4～6周龄的Balb/C雄性裸鼠，用干净无菌的手术剪在小鼠右后背部剪一个约5mm 的小口；肿瘤小块用PBS清洗后，即刻用干净无菌的手术镊小心地将肿瘤小块从剪开的小口塞进麻醉好的小鼠皮下，移植3个星期，移植块形成较大实体瘤后，如图2所示，取下瘤体并剪成小块，按上述的方法再次将肿瘤小块移植至Balb/C雄性裸鼠皮下，食管癌组织第二次移植4个星期后，处死老鼠，在超净台内取下肿瘤块即移植肿瘤组织。
(3)分离和建立小鼠食管癌细胞系mEC25
用干净的手术器械将(2)最后得到的肿瘤块剪碎，剪碎的组织置于含1mg/ml胶原蛋白酶的无血清DMEM培养基中，于温度37℃、5％CO2的培养箱中孵育30分钟消化成单细胞。消化后的细胞悬液利用70um过滤网进行过滤，对过滤后的细胞悬液于转速1200rpm离心5min，去掉上清后用无血清的细胞培养基洗涤两次，然后用3ml含10％FBS的DMEM培养基进行重悬,细胞计数，再用10％FBS的DMEM培养基将细胞浓度调至1x 106细胞/ml,并置于60mm培养皿(5ml/皿)中进行于温度37℃、5％CO2条件下贴壁培养；30分钟后，吸出未贴壁的细胞悬液至新的15ml离心管中于转速1200rpm离心5min。吸弃上清，细胞用5ml上皮培养基重悬，并置于新的60mm培养皿中，于温度37℃、5％CO2进行培养。隔天更换食管上皮培养基，待细胞融合率达80％左右，用0.25％胰酶消化后传代，用上皮培养基培养5代，其细胞形态图如图3所示。再用10％FBS-DMEM培养基培养至少10代。10％FBS-DMEM培养时，前两次传代中，每次传代先用0.25％胰酶消化1min，吸除已经消化下来的细胞，PBS 洗涤两次后继续用0.25％胰酶消化6min，利用10％FBS-DMEM终止消化后离心，离心得到的细胞液用PBS至少洗涤一遍后，随后用10％FBS-DMEM继续培养。培养10代后，细胞系中只含有不同形态的上皮细胞，没有看到明显的杂细胞形态，如图4所示，将该细胞系命名为 mEC25，提交保藏，将该小鼠食管癌细胞系于2019年7月5日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2019158。
实施例二
1.小鼠食管癌细胞系mEC25的分子生物学特性鉴定
对经过10％FBS-DMEM培养10代以上的细胞系mEC25进行上皮特性和成瘤特性的鉴定。 mEC25细胞在经过多聚赖氨酸处理的盖玻片上贴壁生长，然后在室温下，经过4％中性甲醛固定10分钟和0.01％triton X-100透化10分钟，并在室温下用10％的羊血清封闭30分钟后，分别用pan-cytokeratin、E-cadherin、β-catenin、SOX2和P63的抗体，各抗体浓度均为10ug/ml，于室温孵育2小时，洗涤后，再用Alexa Fluor 594-conjugated Goat anti-Rabbit(β-catenin、SOX2 和P63)或Alexa Fluor 594-conjugated Goat anti-mouse(pan-cytokeratin和E-cadherin)于室温孵育1个小时。细胞核用Hoechst33342进行染色(2ug/ml，10min)，其免疫荧光结果如图5 显示，其中的51对照组的免疫荧光检测结果，52为pan-cytokeratin抗体孵育后的免疫荧光检测结果，53为E-cadherin抗体孵育后的免疫荧光检测结果，54为β-catenin抗体孵育后的免疫荧光检测结果，55为SOX2抗体孵育后的免疫荧光检测结果，56为P63抗体孵育后的免疫荧光检测结果。由此可以看出，建立的细胞系高表达cytokeratin、E-cadherin和β-catenin等上皮细胞的特征分子以及P63和SOX2等鳞状癌相关的特征分子。这些结果表明建立的细胞系具有鳞状上皮细胞的特性。
另外，通过流式细胞术检测mEC25细胞表面的MHCI分子(H2kb)。消化后收集mEC25细胞，PBS洗涤一遍后用流式固定透化液对细胞于室温下进行固定和透化20分钟，细胞用流式洗涤液洗涤一遍后，用Alexa Fluor488标记的H2kb抗体(10ug/ml)或Alexa Fluor488标记的H2kd抗体(10ug/ml)于室温孵育1个小时；细胞用流式洗涤液洗涤两次，重悬于500ul的流式洗涤液中，置于冰上，避光放置。利用Beckman CytoFLEX细胞分析仪检测样品，结果如图6显示，mEC25细胞不表达Balb/C小鼠的MHCI分子(H2kd),只表达C57BL/6小鼠的MHCI 分子(H2kb)，表明mEC25细胞主要来源于C57BL/6小鼠。同时，图6表明，mEC25细胞的MHCI分子(H2kb)表达水平较低，符合肿瘤细胞的一般免疫学特性。
2.小鼠食管癌细胞系mEC25的肿瘤特性鉴定
首先，检测mEC25细胞的体外增殖能力。mEC25细胞培养于96孔板中(1000个/孔)，在不同的时间点，如图7所示，按产品说明书要求加入CCK8(Dojindo Laboratories)，置于37℃培养箱继续培养1个小时，然后检测培养液在450nm波长的吸收值，结果如图7所示。图7结果表明，mEC25细胞在体外具有良好的生长能力，倍增时间约为29小时。
其次，通过transwell实验检测mEC25细胞的迁移和侵袭能力。mEC25细胞用无血清的 DMEM培养基稀释至1x 106细胞/ml,并接种在transwell(Costar；CLS3464-48EA)的小室内： 100ul/小室；小室下方的孔内预先加入750ul含20％FBS的DMEM培养基。在不同的时间点，收集transwell小室，吸走培养基后，PBS洗涤一遍小室的PET膜；用棉花签轻轻挂掉PET膜上层的细胞；用4％中性甲醛对PET膜下层的细胞进行固定；PBS洗涤后用2ug/ml的Hoechst33342燃料对细胞进行核染色。PBS洗涤后，用刀片从transwell小室中取下PET膜，并利用防荧光淬灭的封片剂进行封片。于荧光显微镜下进行观察和拍照，结果如图8所示。在检测侵袭能力实验中，如图9所示，PET膜上方先用Matrigel(Corning；356231)进行包被：27ug/小室，37℃孵育2小时；其他实验步骤同细胞迁移实验。在细胞迁移和侵袭实验中，如果在PET膜下方检测到的细胞(蓝色荧光)信号越多，说明细胞的迁移和侵袭能力越强。图 8与图9的结果表明：mEC25细胞系具有明显的迁移和侵袭能力。
最后，检测mEC25细胞的体内成瘤能力。收集mEC25细胞，PBS洗涤后再用PBS进行重悬，细胞计数并将细胞稀释至4x 107/ml。细胞置于冰上，并与预先置于冰上的matrigel(Corning；354262)按体积1:1混合，冰上保存。利用预冷的1ml注射器将细胞悬液注射至C57BL/6小鼠(4～6周龄)皮下：200ul/小鼠。定期观察肿瘤的形成，mEC25细胞系在C57BL/6小鼠皮下形成固体瘤的图片结果如图10所示，mEC25细胞系在C57BL/6小鼠体内成瘤的比例如图11所示。结果显示，mEC25细胞可以在同种属的免疫健全小鼠(C57BL/6)体内成瘤，而且成瘤率较高：4x 106细胞/mice的注射量，10天内的成瘤率高达90％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (10)
1.小鼠食管癌细胞系，其特征在于，所述小鼠食管癌细胞系命名为mEC25，所述小鼠食管癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019158。
2.如权利要求1所述的小鼠食管癌细胞系的子代细胞。
3.如权利要求1所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.通过饮水法，利用化学致癌剂诱导小鼠建立原发性小鼠食管癌模型，得到食管癌原位肿瘤组织；
S2.将S1得到的食管癌原位肿瘤组织移植至裸鼠皮下并进行体内培养，得到移植肿瘤组织；
S3.将S2得到的移植肿瘤组织解离成单细胞，先后通过快速贴壁法去除部分纤维细胞、上皮培养法富集上皮肿瘤细胞和快速消化法去除残余纤维细胞，分离得到小鼠食管癌细胞系。
4.根据权利要求3所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述S3步骤具体操作如下：
将S2步骤得到的移植肿瘤组织剪碎，在培养箱中进行第一次孵育消化成单细胞，得到的单细胞悬液先后进行过滤、离心分离，随后用10％FBS-DMEM培养基进行重悬，并调节细胞浓度，置于培养皿中进行贴壁培养，30min后吸出未贴壁的细胞悬液至离心管中离心，吸弃上清，沉淀的细胞用上皮培养基重悬，并置于新的培养皿中培养，培养至细胞融合率达80％±0.5％后，用胰酶消化后传代，通过传代培养直至获得小鼠食管癌细胞系。
5.根据权利要求4所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述S3步骤中，通过快速贴壁的方法去除部分纤维细胞后，先用上皮培养基培养5代或5代以上，再用10％FBS-DMEM培养10代或10代以上；使用10％FBS-DMEM培养时，前两次传代中，每次传代先用0.25％胰酶消化0.5～2min，吸除已经消化下来的细胞，PBS洗涤两次后继续用0.25％胰酶消化5～6min，利用10％FBS-DMEM终止消化后离心，离心得到的细胞用PBS至少洗涤一遍后，用10％FBS-DMEM重悬继续培养。
6.根据权利要求5所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述胰酶消化的条件为温度37℃，CO2浓度5％。
7.根据权利要求6所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述第一次孵育消化具体为将S2步骤得到的移植肿瘤组织剪碎后，置于含1mg/ml胶原蛋白酶的无血清DMEM培养基中，置于培养箱中于37℃、5％CO2的条件下孵育30min消化成单细胞。
8.根据权利要求3所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述S1步骤中的化学致癌剂为4-硝基喹啉-1-氧化物，使用的小鼠为C57BL/6小鼠。
9.根据权利要求8所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述化学致癌剂使用时，利用1,2-丙二醇将4-硝基喹啉-1-氧化物配制成5mg/ml的储存液，再利用无菌水配制成100ug/ml的4NQO水溶液。
10.根据权利要求3-9任一所述的小鼠食管癌细胞系的建立方法，其特征在于，所述S2步骤具体为将食管癌原位肿瘤组织剪成小块，用PBS清洗后，即刻移植至麻醉好的4～6周龄的Balb/C裸鼠皮下，3～4个星期后，取下瘤体剪成小块再次移植至Balb/C裸鼠皮下，4个星期后，便能得到能够用于分离食管细胞系的移植肿瘤组织。
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