CN115478049A - 一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，所述间充质干细胞外泌体由P3–P5代间充质干细胞培养获得，所述间充质干细胞外泌体由以下步骤制得：将传代至第3‑5代的间充质干细胞种植于培养皿中，当细胞融合达70～90％时，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48‑72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用超速离心法提取得到间充质干细胞外泌体。该种发明，可通过抗炎、促进组织细胞修复，调节免疫反应等方面发挥治疗作用，治疗肿瘤相关症状。

Description

一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
肿瘤免疫(tumorImmunology)是研究肿瘤的抗原性、机体的免疫功能与肿瘤发生、发展的相互关系，机体对肿瘤的免疫应答及其抗肿瘤免疫的机制、肿瘤的免疫诊断和免疫防治的科学。设想肿瘤细胞可能存在着与正常组织不同的抗原成分，通过检测这种抗原成分或用这种抗原成分诱导机体的抗肿瘤免疫应答，可以达到诊断和治疗肿瘤的目的，但这方面研究没有取得明显的进展。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，而提出的一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，所述间充质干细胞外泌体由P3–P5代间充质干细胞培养获得。
所述间充质干细胞外泌体由以下步骤制得：将传代至第3-5代的间充质干细胞种植于培养皿中，当细胞融合达70～90％时，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48-72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用超速离心法提取得到间充质干细胞外泌体。
所述传代培养间充质干细胞传至P1-P10代，培养条件为3％-8％二氧化碳、温度为36℃-39℃、湿度为85％-100％环境中恒温培养。
所述免疫细胞为RPMI1640培养基、CytoRola301培养基或KBM561培养基。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：通过细胞融合，并当细胞融合达70～90％时，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48-72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用超速离心法提取得到间充质干细胞外泌体，可通过抗炎、促进组织细胞修复，调节免疫反应等方面发挥治疗作用，治疗肿瘤相关症状。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为本发明提出的一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途的整体结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；
一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，所述间充质干细胞外泌体由P3–P5代间充质干细胞培养获得。
所述间充质干细胞外泌体由以下步骤制得：将传代至第3-5代的间充质干细胞种植于培养皿中，当细胞融合达70～90％时，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48-72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用超速离心法提取得到间充质干细胞外泌体；
在无菌条件下，取足月妊娠顺产健康胎儿的脐带，剪下约3cm长，置入含有100IU/ml青链霉素的低糖DMEM培养液中，尽量在2小时内开始分离培养。以PBS充分冲洗并去除脐带动静脉，随后将组织剪成直径约1.5mm大小的块状。将小块均匀涂布于培养皿(BDFalcon，货号：353002)底部，加入含10％胎牛血清基(Gibco，货号：10099-141)和100IU/ml青链双抗的低糖DMEM培养液，轻轻翻转培养皿，使培养皿底朝上轻轻放置在CO2培养箱内(Thermo，ORMA3111)。2-4小时后，待小块贴附于皿底，将培养皿缓慢翻转地平放，加入少量培养基，静置培养，过程中动作要轻，严禁摇动。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，于培养24小时后再补液。在3天内观察时移动和观察时要轻拿轻放，尽量不去移动培养皿，以利于组织块的贴壁和生长。培养3-5天时可换液，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用，一方面补充细胞生长所需营养。待间充质干细胞融合达70-80％后，用胰酶(Gibco，货号：25200-056)消化，进行传代培养。
取传代在3代的细胞进行后续操作，脐带间充质干细胞鉴定如图1所示，将P4代MSC置于光学显微镜下观察，细胞形态呈梭形或短三角形，100％融合后，细胞呈现漩涡状生长。结果见图1，图1是实施例1中脐带间充质干细胞(UMSC)的光镜图。培养的第4代人脐血间充质干细胞均表达CD166、CD44、CD29、CD90，而CD45、CD34呈阴性。图1结果说明已获得纯度较高的UMSC。
所述传代培养间充质干细胞传至P1-P10代，培养条件为3％-8％二氧化碳、温度为36℃-39℃、湿度为85％-100％环境中恒温培养。
所述免疫细胞为RPMI1640培养基、CytoRola301培养基或KBM561培养基；制得的HSCs以1×106cell/mL密度接种于24孔板中培养基1mL(IMDM+10％FBS+1％PS+6ng/mlIL-3+10ng/mlSCF+10ng/mlIL-6)，加入0.5mL脐带MSCs外泌体，培养基与外泌体体积比为2:1，置于5％CO2培养箱37℃培养，3天后以1:1的体积比与0.4％的台盼蓝混合均匀，置于显微镜下观察并计数，根据染色情况计算细胞活力。
培养后的细胞以6×103的密度接种于0.3mLIMDM完全培养基中，转移至MethocultTMH4531培养基中，混匀后室温静置5分钟。将1.1mL细胞及培养基混悬液转移至35mm细胞培养皿中，置于5％CO2培养箱37℃培养，7天后观察克隆形成能力，并在光学显微镜下拍照计数。

Claims (4)

1.一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，所述间充质干细胞外泌体由P3–P5代间充质干细胞培养获得。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体由以下步骤制得：将传代至第3-5代的间充质干细胞种植于培养皿中，当细胞融合达70～90％时，用PBS清洗细胞，更换无外泌体血清的培养基，继续培养48-72h后，收集细胞上清，离心去除细胞或细胞碎片，用超速离心法提取得到间充质干细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述的一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，其特征在于，所述传代培养间充质干细胞传至P1-P10代，培养条件为3％-8％二氧化碳、温度为36℃-39℃、湿度为85％-100％环境中恒温培养。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体在免疫细胞培养的用途，其特征在于，所述免疫细胞为RPMI1640培养基、CytoRola301培养基或KBM561培养基。
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