CN116003624A - Sirt1融合蛋白及其用途 - Google Patents

Sirt1融合蛋白及其用途 Download PDF

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CN116003624A CN202210984056.XA CN202210984056A CN116003624A CN 116003624 A CN116003624 A CN 116003624A CN 202210984056 A CN202210984056 A CN 202210984056A CN 116003624 A CN116003624 A CN 116003624A
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Abstract

本申请公开了一种SIRT1融合蛋白及其用途。本申请中，所述融合蛋白具有如式I所示的结构，A‑S，式I；式I中，A为目的蛋白元件，S为SIRT蛋白或其衍生蛋白；“‑”为连接元件，所述连接元件为键或连接序列；所述目的蛋白选自抗体、抗原片段、荧光蛋白和多肽中至少一种。本申请提供的融合蛋白，由于其将目的蛋白和SIRT1蛋白或其衍生蛋白相互融合，SIRT1蛋白或其衍生蛋白作为促表达元件可促进目的蛋白的表达，提升表达效率；本申请的优选的实施方式中提供的重组慢病毒载体表达载体，应用于慢病毒生产可显著提高慢病毒滴度。

Description

SIRT1融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及SIRT1融合蛋白及其用途。
背景技术
慢病毒是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳定细胞株，用于基因的细胞功能研究。借助慢病毒改造T细胞亦可用于CAR-T等细胞治疗，具有广泛的应用前景。
发明人发现现有技术中至少存在如下问题：慢病毒主要是通过将包装质粒和表达质粒瞬时转染细胞产生，但是目前的生产工艺生产的慢病毒滴度低，需要纯化和浓缩后才能有效感染细胞，限制了其在临床或者其他相关领域的应用。因此，本领域尚需寻找一种提高慢病毒生产的滴度的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种分离的多核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种细胞。
本发明的另一目的在于提供一种试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种提高慢病毒生产滴度的方法。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有如式I所示的结构，
A-S，式I
式I中，A为目的蛋白元件，S为SIRT蛋白或其衍生蛋白；
“-”为连接元件，所述连接元件为键或连接序列；
所述目的蛋白选自抗体、抗原片段、荧光蛋白、多肽、嵌合抗原受体中至少一种。
在一些优选的方案中，所述连接元件为连接序列；更优选地，所述连接元件为2A序列。
在一些优选的方案中，所述SIRT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些优选的方案中，所述SIRT蛋白的衍生蛋白选自下组中任一种：
(i)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥90％同源性的氨基酸序列，且保持有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的活性；
(ii)SIRT1蛋白的截短体；
(iii)SIRT1蛋白的截短体拼接物，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为两个或两个以上所述SIRT1蛋白的截短体依次拼接的产物；优选地，所述截短体拼接物中，相邻两个所述SIRT1蛋白的截短体之间可操作性地插入柔性连接子；优选地，所述柔性连接子选自：SEQID NO:49(GGGSGGGS)或SEQ ID NO:25(DGGGGSGGGGSGGGGS)；
(iv)SIRT1蛋白的功能突变体，所述功能突变体由SIRT1蛋白、SIRT1蛋白的截短体或SIRT1蛋白的截短体拼接物进行突变获得。
在一些优选的方案中，所述功能突变体在SIRT1蛋白的功能区域发生突变，所述功能区域包括SIRT1蛋白的原核定位信号序列和/或原核出核信号序列。
在一些优选的方案中，所述功能突变体包括：
突变核定位信号序列，所述突变核定位信号序列由选自所述SIRT1蛋白、所述SIRT1蛋白的截短体和所述SIRT1蛋白的截短体拼接物中任一种的原核定位信号序列中一个或多个氨基酸发生突变获得；和/或
突变核出核信号序列，所述突变核出核信号序列由选自所述SIRT1蛋白、所述SIRT1蛋白的截短体或所述SIRT1蛋白的截短体拼接物中任一种的原核出核信号序列中一个或多个氨基酸发生突变获得。
在一些优选的方案中，所述突变的方式为一个或多个氨基酸置换、插入或缺失。
在一些优选的方案中，所述突变的方式为一个或多个氨基酸置换为A或缺失。
在一些优选的方案中，所述原核定位信号序列包括SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27中至少一种。
在一些优选的方案中，所述原核定位信号序列包括第一原核定位信号序列SEQ IDNO:25和第二原核定位信号序列SEQ ID NO:27。
在一些优选的方案中，所述原核出核信号序列包括SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35中至少一种。
在一些优选的方案中，所述原核出核信号序列包括第一原核出核信号序列SEQ IDNO:33和第二原核出核信号序列SEQ ID NO:35。
在一些优选的方案中，所述功能突变体包括：
第一突变核定位信号序列，所述第一突变核定位信号序列由所述第一原核定位信号序列突变获得；和/或
第二突变核定位信号序列，所述第二突变核定位信号序列由所述第二原核定位信号序列突变获得；和/或
第一突变核出核信号序列，所述第一突变核出核信号序列由所述第一原核出核信号序列突变获得；和/或
第二突变核出核信号序列，所述第二突变核出核信号序列由所述第二原核出核信号序列突变获得。
在一些优选的方案中，所述第一突变核定位信号序列如SEQ ID NO:29所示。
在一些优选的方案中，所述第二突变核定位信号序列如SEQ ID NO:31所示。
在一些优选的方案中，所述第一突变核出核信号序列如SEQ ID NO:37所示。
在一些优选的方案中，所述第二突变核出核信号序列如SEQ ID NO:39所示。
在一些优选的方案中，所述功能突变体中，所述第一原核定位信号序列缺失。
在一些优选的方案中，所述功能突变体中，所述第二原核定位信号序列缺失。
在一些优选的方案中，所述功能突变体中，所述第一原核出核信号序列缺失。
在一些优选的方案中，所述功能突变体中，所述第二原核出核信号序列缺失。
在一些优选的方案中，所述突变的方式为：所述SIRT1蛋白的氨基酸序列中第32至39个氨基酸(SEQ ID NO:25)、第231至238个氨基酸(SEQ ID NO:27)、第146至153个氨基酸(SEQ ID NO:33)和第433至439个氨基酸(SEQ ID NO:35)中至少一个氨基酸发生突变。
在一些优选的方案中，所述突变的方式为：所述SIRT1蛋白的氨基酸序列中第32至39个氨基酸(SEQ ID NO:25)、第231至238个氨基酸(SEQ ID NO:27)、第146至153个氨基酸(SEQ ID NO:33)、和第433至439个氨基酸(SEQ ID NO:35)中的至少一个氨基酸置换为A或缺失。
在一些优选的方案中，所述目的蛋白元件为嵌合抗原受体(CAR)或EGFP。
在一些优选的方案中，所述目的蛋白元件的氨基酸序列选自下组中任一种：
(a)如SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO.45所示氨基酸序列≥90％同源性的氨基酸序列，且保持有与SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列的活性；
(c)如SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列；
(d)具有与SEQ ID NO.47所示氨基酸序列≥90％同源性的氨基酸序列，且保持有与SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列的活性。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体包括第一肽段，所述第一肽段包括SEQ ID NO:1的第183至229位氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体包括第二肽段，所述第二肽段包括SEQ ID NO:1的第229至516位氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体包括第三肽段，所述第三肽段包括SEQ ID NO:1的第641至665位氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物包括第一肽段和第二肽段。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为第一肽段和第二肽段。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物还包括第三肽段。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为第一肽段、第二肽段和第三肽段依次拼接的产物。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物还包括先导肽段，所述先导肽段包括SEQ ID NO:1的第1至39位氨基酸序列。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为先导肽段、第一肽段、第二肽段依次拼接的产物。
在一些优选的方案中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为先导肽段、第一肽段、第二肽段和第三肽段依次拼接的产物。
本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。
在一些优选的方案中，所述多核苷酸选自下组中任一种：
(A1)序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列；
(A2)序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸序列；
(A3)序列如SEQ ID NO:6所示的多核苷酸序列；
(A4)序列如SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列；
(A5)序列如SEQ ID NO:10所示的多核苷酸序列；
(A6)序列如SEQ ID NO:12所示的多核苷酸序列；
(A7)序列如SEQ ID NO:14所示的多核苷酸序列；
(A8)序列如SEQ ID NO:16所示的多核苷酸序列；
(A9)序列如SEQ ID NO:18所示的多核苷酸序列；
(A10)序列如SEQ ID NO:20所示的多核苷酸序列；
(A11)序列如SEQ ID NO:22所示的多核苷酸序列；
(A12)序列如SEQ ID NO:24所示的多核苷酸序列；
(B)与(A)至(A12)中任一项所述多核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；和
(C)与(A)至(A12)和(B)中任一项所述多核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体为重组慢病毒载体。
在一些优选的方案中，所述重组慢病毒载体包括：
慢病毒载体骨架模块和外源基因模块；
其中，所述外源基因模块包括本发明第二方面所述的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述重组慢病毒载体不是中国专利申请202111655065.6或PCT国际专利申请PCT/CN2021/143151中公开的重组慢病毒载体。
本发明的第四方面，提供了一种细胞，所述的细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合本发明第二方面所述的多核苷酸。
本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的细胞。
本发明的第六方面，提供了一种提高慢病毒滴度的方法，所述方法包括步骤：使包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升，从而提高慢病毒滴度。
在一些优选的方案中，所述包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升的方式选自以下至少一种：
(i)使用本发明所述的重组慢病毒载体和辅助载体共转染所述包装细胞系，培养所述包装细胞系，收集上清液；
(ii)在所述包装细胞系的培养介质中添加SIRT蛋白激活剂，培养所述包装细胞系，收集上清液；和
(iii)在所述包装细胞系的培养介质中添加SIRT蛋白或其衍生蛋白，培养所述包装细胞系，收集上清液。
在一些优选的方案中，所述SIRT蛋白激活剂为SRT1720和/或SRT2104。
在一些优选的方案中，所述培养介质中，所述激活剂的浓度为0.05至10uM。在一些优选的方案中，所述包装细胞系为293T细胞系。
在一些优选的方案中，培养所述包装细胞系时，所用的培养介质中包含SIRT1蛋白激活剂。
在一些优选的方案中，所述辅助载体包括包装质粒和包膜质粒。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明提供的融合蛋白，由于其将目的蛋白和SIRT1蛋白或其衍生蛋白相互融合，SIRT1蛋白或其衍生蛋白作为促表达元件可促进目的蛋白的表达，提升表达效率；
(2)本发明的优选的实施方式中提供的重组慢病毒载体表达载体，应用于慢病毒生产可显著提高慢病毒滴度。
(3)本发明还提供了提高慢病毒滴度的方法，通过上调包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达量来提升慢病毒滴度。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中293T细胞荧光强度示意图；
图2是根据本发明实施例中慢病毒相对滴度统计图。
具体实施方式
现有的慢病毒生产工艺中存在所得产品滴度低的缺陷。本发明人经过广泛而深入的研究，将SIRT1蛋白或其衍生蛋白和目的蛋白融合获得融合蛋白，通过分析获得编码该融合蛋白的多核苷酸序列，并将其组装在慢病毒表达载体中，获得了一种重组慢病毒载体，其应用于慢病毒生产时可使所得产品滴度大幅提升。
融合蛋白及其制备在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式I所述结构，即含有目的蛋白和SIRT蛋白或其衍生蛋白的融合蛋白。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
本发明融合蛋白或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
多核苷酸的载体
本发明中，还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。在本发明的优选的实施方式中，所述载体为表达载体，更优选为重组慢病毒载体。
重组慢病毒载体
本发明中，术语“慢病毒载体”是指HIV-1或HIV-2或猿猴免疫缺陷病毒，猫免疫缺陷病毒，马免疫缺陷病毒或牛免疫缺陷病毒或其它哺乳动物，和能够感染动物物种的慢病毒载体。该载体通常是复制缺陷的。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
本发明中，“重组慢病毒载体”包括慢病毒载体骨架模块和外源基因模块。
本发明中，“慢病毒载体骨架模块”指的是慢病毒载体中非外源基因的部分。这些非外源基因的部分通常已经包含在市售的慢病毒载体中。在本发明的一个非限制的实施例中，慢病毒载体骨架模块包括：LTR元件(3’LTR和5’LTR)和辅助元件；辅助元件选自功能标签、RRE元件、CPPT元件、Kozak元件、WPRE元件、T2a元件和SV40 early pA元件中的一种或几种。本发明中功能标签非限制地为3xFLAG，6xHis，HA，Myc，OLLAS，GST等。
本发明中，“外源基因模块”指的是所插入慢病毒骨架模块中的多核苷酸序列。在本发明的一个实施方式中，所述外源基因模块包括本发明中的编码本发明中融合蛋白的多核苷酸序列。
本发明中的编码本发明中融合蛋白的多核苷酸序列包括：
编码目的蛋白的目的基因序列，和
编码SIRT1蛋白的多核苷酸序列、编码SIRT1蛋白截短体、编码SIRT1蛋白截短体拼接物或编码SIRT1蛋白的功能突变体的多核苷酸序列。通过在外源基因模块中引入编码SIRT1蛋白的多核苷酸序列或编码SIRT1蛋白的功能突变体的多核苷酸序列，刺激编码目的蛋白的目的基因序列的表达，从而提高生产病毒的滴度。
通过与编码SIRT1蛋白的多核苷酸序列或编码SIRT1蛋白的功能突变体的多核苷酸序列拼接实现促进表达的目的蛋白的种类不做限制。在本发明的一个优选的实施方式中，所述目的蛋白为CAR。如本领域技术人员公知，CAR包括顺次拼接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包括抗原识别结构域和铰链区；所述胞内结构域包括共刺激结构域和信号传导结构域。更优选地，所述CAR包括：抗原识别结构域-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-信号传导结构域，其中“-”为连接元件(可用于连接两个蛋白的多肽序列)或不存在。
本发明中，术语“2A”序列是指一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列。所述2A序列可以有助于转录产生两种蛋白。
在本发明优选的实施方式中，所述连接元件为2A序列，选自下列各项组成的组：T2A(优选核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示)、P2A(优选核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示)、F2A、E2A和IRES。在本发明更优选的实施方式中，所述连接元件包含SEQ ID NO:41和43所示的序列或由其组成。
SIRT1蛋白、SIRT1蛋白的截短体、SIRT1蛋白的截短体拼接物和SIRT1蛋白的功能突变体
本发明中，“SIRT1蛋白”的氨基酸序列为原始序列(UniProtKB编号：Q96EB6-1)截短体，包括小分子Sirtuin激活剂结合区(Small molecule sirtuin-activatingcompounds binding domain，SBD，原始序列第183-229位)，去乙酰化酶区(Deacetylasedomain，原始序列第229-516位)和C端调控区(C-terminal regulatory segment，CTR，原始序列第641-665位)。
在本发明的优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白具有SEQ ID NO.1所示的序列，或与其具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，或由其组成，所述同源序列仍具备SEQ ID NO:1所示序列功能。所述编码SIRT1蛋白的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.2，或与其具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，或由其组成，所述同源序列仍可编码如前所述的SIRT1蛋白或其同源序列。
本发明中，未经突变的SIRT1蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO:1)包括原核定位信号序列和原核出核信号序列，所述原核定位信号序列选自SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27中至少一种；所述原核出核信号序列选自SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35中至少一种。
在本发明中，“SIRT1蛋白的截短体”指的是SIRT1蛋白原始序列的任一片段。在本发明的一些优选的实施方式中，SIRT1蛋白的截短体包括第一肽段，所述第一肽段包括SEQID NO:1的第183至229位氨基酸序列。所述第一肽段是SIRT1蛋白中的小分子Sirtuin激活剂结合区(Small molecule sirtuin-activating compounds binding domain，SBD，原始序列第183-229位)。在另一些实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体包括与所述第一肽段具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备第一肽段的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体包括第二肽段，所述第二肽段包括SEQ ID NO:1的第229至516位氨基酸序列。所述第二肽段为SIRT1蛋白中的去乙酰化酶区(Deacetylase domain，原始序列第229-516位)。在另一些实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体包括与所述第二肽段具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备第二肽段的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体包括第三肽段，所述第三肽段包括SEQ ID NO:1的第641至665位氨基酸序列。所述第二肽段为SIRT1蛋白中的C端调控区(C-terminal regulatory segment，CTR，原始序列第641-665位)。在另一些实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体包括与所述第三肽段具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备第三肽段的序列功能。
本发明中，“SIRT1蛋白的截短体拼接物”指的是SIRT1蛋白的至少两个不连续的截短体拼接构成的新链，可选地，任意相邻两个不连续的截短体之间可操作性地插入柔性连接子，组成“截短体-柔性连接子-截短体”。
本发明中，“柔性连接子”可选本领域用于连接两段肽链所用的任何柔性的连接子，通常所述柔性连接子中包括连续的多个G。例如，如SEQ ID NO:49所示的GGGSGGGS或如SEQ ID NO:50所示的DGGGGSGGGGSGGGGS。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物包括第一肽段和第二肽段。在另一些实施方式中，前述第一肽段和第二肽段中任一个可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为第一肽段和第二肽段。在另一些实施方式中，前述第一肽段和第二肽段中任一个可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物还包括第三肽段。在另一些实施方式中，前述第三肽段可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为第一肽段、第二肽段和第三肽段依次拼接的产物。在另一些实施方式中，前述第一肽段、第二肽段和第三肽段中任一个可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物还包括先导肽段，所述先导肽段包括SEQ ID NO:1的第1至39位氨基酸序列。在另一些实施方式中，前述先导肽段可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为先导肽段、第一肽段、第二肽段依次拼接的产物。在另一些实施方式中，前述先导肽段、第一肽段和第二肽段中任一个可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为先导肽段、第一肽段、第二肽段和第三肽段依次拼接的产物。在另一些实施方式中，前述先导肽段、第一肽段、第二肽段和第三肽段中任一个可选地被其同源序列替换，其中同源序列为具备至少80％、至少85％、至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％同源性的序列，所述同源序列仍具备原始序列的序列功能。
在本发明中，“功能突变体”包括SIRT1蛋白、SIRT1蛋白的截短体或SIRT1蛋白的截短体拼接物的功能突变体，指的是SIRT1蛋白的功能区进行突变形成的突变体，可理解地，其不同于SIRT1蛋白的同源序列。
在本发明的优选的实施方式中，所述功能突变体包括：突变核定位信号序列，所述突变核定位信号序列由选自所述SIRT1蛋白、所述SIRT1蛋白的截短体和所述SIRT1蛋白的截短体拼接物中任一种的原核定位信号序列中一个或多个氨基酸发生突变获得；和/或突变核出核信号序列，所述突变核出核信号序列由选自所述SIRT1蛋白、所述SIRT1蛋白的截短体或所述SIRT1蛋白的截短体拼接物中任一种的原核出核信号序列中一个或多个氨基酸发生突变获得。因其在SIRT1蛋白原核定位信号和原核出核信号处发生突变，因此蛋白在细胞质以及细胞核的表达量有所改变，进而实现调节蛋白的功能活性。
在本发明的一些实施方式中，所述原核定位信号序列选自SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:27中至少一种。在本发明的另一些实施方式中，所述原核定位信号序列包括第一原核定位信号序列SEQ ID NO:25和第二原核定位信号序列SEQ ID NO:27。
在本发明的一些实施方式中，所述原核出核信号序列选自SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:35中至少一种。在本发明的另一些实施方式中，所述原核出核信号序列包括第一原核出核信号序列SEQ ID NO:33和第二原核出核信号序列SEQ ID NO:35。
在本发明的一些实施方式中，所述功能突变体包括：
第一突变核定位信号序列，所述第一突变核定位信号序列由第一原核定位信号序列突变获得；
第二突变和定位信号序列，所述第二突变核定位信号序列由第二原核定位信号序列突变获得；
第一突变核出核信号序列，所述第一突变核出核信号序列由第一原核出核信号序列突变获得；和/或
第二突变和出核信号序列，所述第二突变核出核信号序列由第二原核出核信号序列突变获得。
在本发明的优选的方式中，所述突变的方式为一个或多个氨基酸的置换、插入或缺失；更优选地，所述突变的方式为一个或多个氨基酸置换为A或缺失。
本发明优选的实施方式中，所述第一突变核定位信号序列如SEQ ID NO:29所示。本发明优选的实施方式中，所述第二突变核定位信号序列如SEQ ID NO:31所示。本发明优选的实施方式中，所述第一突变核出核信号序列如SEQ ID NO:37所示。本发明优选的实施方式中，所述第二突变核出核信号序列如SEQ ID NO:39所示。本发明优选的实施方式中，所述功能突变体中，所述第一原核定位信号序列缺失。本发明优选的实施方式中，所述功能突变体中，所述第二原核定位信号序列缺失。本发明优选的实施方式中，所述功能突变体中，所述第一原核出核信号序列缺失。本发明优选的实施方式中，所述功能突变体中，所述第二原核出核信号序列缺失。
在本发明的一些实施方式中，SIRT1蛋白序列中原核定位信号序列发生突变，得到经突变的核定位信号序列片段，即第32至39个氨基酸(SEQ ID NO:25)和第231至238个氨基酸(SEQ ID NO:27)中至少一个氨基酸发生突变。
在本发明的一些实施方式中，SIRT1蛋白序列中原核出核信号序列发生突变，得到经突变的核出核信号序列片段，即第146至153个氨基酸(SEQ ID NO:33)和第433至439个氨基酸(SEQ ID NO:35)中至少一个氨基酸发生突变。
在本发明的一些优选的实施方式中，SIRT1蛋白序列中原核定位信号序列和原核出核信号序列均发生突变，即第32至39个氨基酸(SEQ ID NO:25)和第231至238个氨基酸(SEQ ID NO:27)中至少一个氨基酸发生突变，并且第146至153个氨基酸(SEQ ID NO:33)和第433至439个氨基酸(SEQ ID NO:35)中至少一个氨基酸发生突变。
在本发明更优选的实施方式中，所述功能突变体的氨基酸序列选自：如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:3所示序列功能；
如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:5所示序列功能；
如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:7所示序列功能；
如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:9所示序列功能；
如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:11所示序列功能；
如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:13所示序列功能；
如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:15所示序列功能；
如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:17所示序列功能；
如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:19所示序列功能。
如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:21所示序列功能。
如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的氨基酸序列；所述同源序列仍具备SEQ ID NO:23所示序列功能。
编码SIRT1蛋白的多核苷酸和编码SIRT1蛋白的功能突变体的多核苷酸
在获取SIRT1蛋白和SIRT1蛋白的功能突变体的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域常规的方式获取编码SIRT1蛋白的多核苷酸和编码SIRT1蛋白的功能突变体的多核苷酸。但更优选地，为提高生产效率或提升产品质量，可对这些多核苷酸进行筛选或优化，从而获得生产滴度更高的载体。
在本发明的优选的实施方式中，所述编码SIRT1蛋白的多核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQ ID NO.2所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能。
在本发明的优选的实施方式中，所述编码SIRT1蛋白的功能突变体的多核苷酸序列选自：
如SEQ ID NO.4所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQ IDNO.4所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.6所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQ IDNO.6所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQ IDNO.8所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.10所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.10所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.12所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.12所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.14所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.14所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.16所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.16所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.18所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.18所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能；
如SEQ ID NO.20所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.20所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能。
如SEQ ID NO.22所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.22所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能。
如SEQ ID NO.24所示的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列同一性不低于80％，优选不低于85％，优选不低于90％，优选不低于91％，优选不低于92％，优选不低于93％，优选不低于94％，优选不低于95％，优选不低于96％，优选不低于97％，优选不低于98％，优选不低于99％的多核苷酸序列，所述同源序列翻译所得的蛋白仍具备与SEQID NO.24所示多核苷酸序列翻译所得的蛋白相同的功能。
慢病毒表达系统
本发明中，慢病毒表达系统包括本发明的重组慢病毒载体、包装子系统，所述包装子系统包括辅助载体和包装细胞系。
本发明中，术语“辅助载体”指的是可提供所有转录并包装RNA到重组慢病毒载体所需的辅助蛋白的质粒。通常，包括包装质粒和包膜质粒。
本发明中，术语“包装质粒”指的是提供病毒包装的所需结构蛋白和酶的编码质粒。在本发明的一些实施方式中，所述包装质粒为psPAX2。通常，psPAX2中含有gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。
本发明中，术语“包膜质粒”指的是蛋白质外壳的编码质粒。在本发明的一些实施方式中，所述包膜质粒为pMD2G。通常，pMD2G中含有vsvg基因，用于提供病毒包装所需要的包膜蛋白。
本发明中，术语“包装细胞系”缺乏重组病毒载体或慢病毒转移载体质粒的传染性重组病毒的生产所必需的那些元件的细胞。通常，这样的包装细胞包含一个或多个能够表达病毒结构蛋白(如gag，pol和env)但不包含包装信号的表达盒。
在本发明优选的实施方式中，所述包装细胞系293系细胞。在本发明更优选的实施方式中，所述293系细胞为293T、HEK293、293F、293FT、293E和293TN。在本发明最优选的实施方式中，所述293系细胞为293T细胞。
慢病毒的生产
发明人发现，通过使包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升，可以使生产所得的慢病毒滴度更高。本发明中还涉及提高慢病毒滴度的方法，所述方法包括步骤：使包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升，从而提高慢病毒滴度。
在本发明优选的实施方式中，所述包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升的方式选自以下(i)、(ii)和(iii)中任一种：
(i)使用本发明所述的重组慢病毒载体和辅助载体共转染所述包装细胞系，培养所述包装细胞系，收集上清液。因本发明中重组慢病毒载体中整合了编码SIRT蛋白或其衍生蛋白的多核苷酸序列，培养含有重组慢病毒载体的包装细胞即可使SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平得以提升，从而促进提高慢病毒滴度。
(ii)在所述包装细胞系的培养介质中添加SIRT蛋白激活剂，培养所述包装细胞系，收集上清液。通过添加SIRT蛋白激活剂促使包装细胞自身增加SIRT蛋白的表达，从而促进提高慢病毒滴度。优选地，所述SIRT蛋白激活剂为SRT1720和/或SRT2104(SRT1720，CAS号1001645-58-4；SRT2104，CAS号1093403-33-8)。优选地，所述培养介质中，所述激活剂的浓度为0.05至10uM。优选地，所述包装细胞系为293T细胞系。
(iii)在所述包装细胞系的培养介质中添加SIRT蛋白或其衍生蛋白，培养所述包装细胞系，收集上清液。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、EGFP-S1慢病毒载体的构建和包装
(1)EGFP-S1慢病毒载体构建
将编码融合蛋白EGFP-S1的多核苷酸序列(SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:42和SEQID NO:4依次拼接)和编码EGFP蛋白的多核苷酸序列(SEQ ID NO:46)分别构建到并构建到慢病毒载体(LV100A，System Biosciences公司)，随后依照其说明书记载的方式转染获得慢病毒，得到EGFP和EGFP-S1慢病毒。
(2)EGFP和EGFP-S1慢病毒包装
将293T细胞以9×105/ml的细胞密度接种至六孔板中，每孔2ml，放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，培养基为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基。次日观察细胞生长情况，待融合率达到80％-90％时候进行后续转染实验操作。
吸取200μL的Opti-MEM培养基加入1.5ml的EP管中，加入1μg包装质粒psPAX2、1.5μg包膜质粒pMD2G以及2μg步骤(1)中所得的EGFP-S1慢病毒载体质粒，用手指轻弹EP管底部，经过均匀混合得到质粒混合物；再逐滴加入13.5μL的转染试剂FuGENE，轻弹EP管底混匀后室温孵育15min，形成质粒-转染试剂复合物。
在孵育结束前1min，取出293T细胞，在生物安全柜中用移液器吸出600μL培养上清，再将孵育好的质粒-转染试剂复合物逐滴加入到六孔板中。添加完毕并轻微摇晃混匀后，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
转染24h后，吸弃原孔中的培养液1ml，轻缓地加入2ml提前预热的DMEM培养基(含5％FBS)；
转染后72h，收取全部培养上清液，于室温下以2000g转速离心10min，取上清分装保存于-80℃冰箱。
(3)EGFP及EGFP-S1慢病毒载体转染效率的对比
分别构建EGFP和EGFP-S1的慢病毒载体，并收集48h和72h的病毒上清液，用48h和72h病毒液按感染复数为4分别转导293T细胞，并于48h后收集293T细胞，以流式细胞仪的FITC通道检测绿色荧光强度，结果见图1。
根据图1，EGFP-S1慢病毒载体可以显著提高慢病毒滴度，48h时EGFP荧光强度为1070，提高了48.2％；72h时EGFP荧光强度为940，提高了46.4％。
实施例2、GP-S慢病毒载体的构建和包装
(1)GP-S系列慢病毒载体构建
人工合成表1所示的各结构的片段，并构建到慢病毒载体(LV100A，SystemBiosciences公司)，随后依照其说明书记载的方式转染获得慢病毒，分别得到GP、GP-S1、GP-S1A、GP-S1B、GP-S1B1、GP-S1C、GP-S1C1、GP-S1D、GP-S1D1、GP-S1E和GP-S1E1。
表1
(2)GP-S系列慢病毒的包装
将293T细胞以9×105/ml的细胞密度接种至六孔板中，每孔2ml，放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜，培养基为含10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基。次日观察细胞生长情况，待融合率达到80％-90％时候进行后续转染实验操作。
吸取200μL的Opti-MEM培养基加入1.5ml的EP管中，加入1μg包装质粒psPAX2、1.5μg包膜质粒pMD2G以及2μg步骤(1)中所得的GP-S慢病毒载体质粒，用手指轻弹EP管底部，经过均匀混合得到质粒混合物；再逐滴加入13.5μL的转染试剂FuGENE，轻弹EP管底混匀后室温孵育15min，形成质粒-转染试剂复合物。
在孵育结束前1min，取出293T细胞，在生物安全柜中用移液器吸出600μL培养上清，再将孵育好的质粒-转染试剂复合物逐滴加入到六孔板中。添加完毕并轻微摇晃混匀后，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
转染24h后，吸弃原孔中的培养液1ml，轻缓地加入2ml提前预热的DMEM培养基(含5％FBS)；
转染后72h，收取全部培养上清液，于室温下以2000g转速离心10min，取上清分装保存于-80℃冰箱。
(3)慢病毒滴度的检测
将293T细胞以5×104/ml的细胞密度接种入六孔板内，每孔2ml，加入3ul混匀的步骤(2)中获得的病毒上清液，再加入终浓度为8μg/ml的polybrene，将细胞放入37℃，5％CO2培养箱继续培养；
转导48h后，吸弃上清液，加入200ul的0.25％Trypsin-EDTA消化液，消化20s后，加入1ml的完全培养基终止消化；吸取细胞悬液以400g转速离心5min，遗弃上清所得细胞以PBS缓冲液重悬，于染色后以细胞流式仪检测阳性率，并计算病毒滴度，所得结果见表2。
病毒滴度＝接种细胞总数×孔阳性率/加入病毒体积(TU/ml)。
表2
病毒名称 病毒滴度(TU/ml) 相对滴度(％)
GP-CAR <![CDATA[5.5×10<sup>6</sup>]]> 100
GP-S1 <![CDATA[9.1×10<sup>6</sup>]]> 165.4
GP-S1A <![CDATA[9.8×10<sup>6</sup>]]> 178.1
GP-S1B <![CDATA[8.9×10<sup>6</sup>]]> 161.8
GP-S1B1 <![CDATA[9.7×10<sup>6</sup>]]> 176.3
GP-S1C <![CDATA[1.1×10<sup>7</sup>]]> 200
GP-S1C1 <![CDATA[8.9×10<sup>6</sup>]]> 161.8
GP-S1D <![CDATA[7.4×10<sup>6</sup>]]> 134.5
GP-S1D1 <![CDATA[9.9×10<sup>6</sup>]]> 180
GP-S1E <![CDATA[8.1×10<sup>6</sup>]]> 147.2
GP-S1E1 <![CDATA[8.6×10<sup>6</sup>]]> 156.3
根据表2，GP-CAR的病毒滴度为5.5×106TU/ml，而GP-S1、GP-S1A、GP-S1B、GP-S1B1、GP-S1C、GP-S1C1、GP-S1D、GP-S1D1、GP-S1E、GP-S1E1的病毒滴度分别为9.1×106、9.8×106、8.9×106、9.7×106、1.1×107、8.9×106、7.4×106、9.9×106、8.1×106、8.6×106TU/ml，相对于GP-CAR的滴度分别提高了65.4％、78.1％、61.8％、76.3％、100％、61.8％、34.5％、80.0％、47.2％和56.3％。
实施例3、加入激活剂对慢病毒滴度的影响
本实施例中提供一种慢病毒的包装方法，与实施例2中慢病毒的包装方法区别在于：
实施例2中，转染24h后，吸弃原孔中的培养液1ml，轻缓地加入2ml提前预热的DMEM培养基(含5％FBS)；
而本实施例中，转染24h后，吸弃原孔中的培养液1ml，分别轻缓地加入提前预热的含激活剂SRT1720(浓度为10uM)或SRT2104(浓度为0.5uM)的DMEM培养液(含5％FBS)2ml。
使用实施例2中的方法进行慢病毒滴度检测，结果见图2。
根据图2，在培养液中添加激活剂SRT1720显著提高了GP的滴度，提高了14.0％；
在培养液中添加激活剂SRT2104显著提高了GP的滴度，提高了22.8％。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
序列信息：
S蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO.1）
MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPRRDGPGLERSPGEPGGAAPEREVPAAARGCPGAAAAALWREAEAEAAAAGGEQEAQATAAAGEGDNGPGLQGPSREPPLADNLYDEDDDDEGEEEEEAAAAAIGYRDNLLFGDEIITNGFHSCESDEEDRASHASSSDWTPRPRIGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRTQKELAYLSELPPTPLHVSEDSSSPERTSPPDSSVIVTLLDQAAKSNDDLDVSESKGCMEEKPQEVQTSRNVESIAEQMENPDLKNVGSSTGEKNERTSVAGTVRKCWPNRVAKEQISRRLDGNQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDVLSSSSCGSNSDSGTCQSPSLEEPMEDESEIEEFYNGLEDEPDVPERAGGAGFGTDGDDQEAINEAISVKQEVTDMNYPSNKS
S蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.2）
ATGGCGGACGAGGCGGCCCTCGCCCTTCAGCCCGGCGGCTCCCCCTCGGCGGCGGGGGCCGACAGGGAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGGGGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCGCGGAGAGATGGTCCCGGCCTCGAGCGGAGCCCGGGCGAGCCCGGTGGGGCGGCCCCAGAGCGTGAGGTGCCGGCGGCGGCCAGGGGCTGCCCGGGTGCGGCGGCGGCGGCGCTGTGGCGGGAGGCGGAGGCAGAGGCGGCGGCGGCAGGCGGGGAGCAAGAGGCCCAGGCGACTGCGGCGGCTGGGGAAGGAGACAATGGGCCGGGCCTGCAGGGCCCATCTCGGGAGCCACCGCTGGCCGACAACTTGTACGACGAAGACGACGACGACGAGGGCGAGGAGGAGGAAGAGGCGGCGGCGGCGGCGATTGGGTACCGAGATAACCTTCTGTTCGGTGATGAAATTATCACTAATGGTTTTCATTCCTGTGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCCTCACATGCAAGCTCTAGTGACTGGACTCCAAGGCCACGGATAGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAACACAAAAAGAATTGGCTTATTTGTCAGAGTTGCCACCCACACCTCTTCATGTTTCAGAAGACTCAAGTTCACCAGAAAGAACTTCACCACCAGATTCTTCAGTGATTGTCACACTTTTAGACCAAGCAGCTAAGAGTAATGATGATTTAGATGTGTCTGAATCAAAAGGTTGTATGGAAGAAAAACCACAGGAAGTACAAACTTCTAGGAATGTTGAAAGTATTGCTGAACAGATGGAAAATCCGGATTTGAAGAATGTTGGTTCTAGTACTGGGGAGAAAAATGAAAGAACTTCAGTGGCTGGAACAGTGAGAAAATGCTGGCCTAATAGAGTGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGGCGGCTTGATGGTAATCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTCTTATCCTCTAGTTCTTGTGGCAGTAACAGTGATAGTGGGACATGCCAGAGTCCAAGTTTAGAAGAACCCATGGAGGATGAAAGTGAAATTGAAGAATTCTACAATGGCTTAGAAGATGAGCCTGATGTTCCAGAGAGAGCTGGAGGAGCTGGATTTGGGACTGATGGAGATGATCAAGAGGCAATTAATGAAGCTATATCTGTGAAACAGGAAGTAACAGACATGAACTATCCATCAAACAAATCATAG
S1蛋白氨基酸序列（SEQ ID NO.3）
GPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRGGGSGGGSQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDV
S1蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.4）
GGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAGGCGGAGGATCAGGCGGAGGCTCCCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTC
S1A氨基酸序列（SEQ ID NO.5）
GPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPR
S1A蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.6）
GGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGA
S1B氨基酸序列（SEQ ID NO.7）GPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRAAAADINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRGGGSGGGSQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDV
S1B蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.8）
GGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGGCGGCGGCGGCAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAGGCGGAGGATCAGGCGGAGGCTCCCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTC
S1B1氨基酸序列（SEQ ID NO.9）
GPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRAAAADINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPR
S1B1蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.10）GGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGGCGGCGGCGGCAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGA
S1C氨基酸序列（SEQ ID NO.11）
GPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEADAAAAAGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRGGGSGGGSQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDV
S1C蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.12）
GGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGCCGACGCGGCGGCGGCGGCGGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAGGCGGAGGATCAGGCGGAGGCTCCCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTC
S1C1氨基酸序列（SEQ ID NO.13）
GPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEADAAAAAGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPR
S1C1蛋白核苷酸序列（SEQ ID NO.14）
GGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGCCGACGCGGCGGCGGCGGCGGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGA
S1D氨基酸序列（SEQ ID NO.15）MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPRRDGGGGSGGGGSGGGGSGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRGGGSGGGSQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDV
S1D蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO.16)
ATGGCGGACGAGGCGGCCCTCGCCCTTCAGCCCGGCGGCTCCCCCTCGGCGGCGGGGGCCGACAGGGAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGGGGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCGCGGAGAGATGGCGGCGGAGGATCAGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAGGCGGAGGATCAGGCGGAGGCTCCCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTC
S1D1氨基酸序列(SEQ ID NO.17)
MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPRRDGGGGSGGGGSGGGGSGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPR
S1D1蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO.18)
ATGGCGGACGAGGCGGCCCTCGCCCTTCAGCCCGGCGGCTCCCCCTCGGCGGCGGGGGCCGACAGGGAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGGGGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCGCGGAGAGATGGCGGCGGAGGATCAGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGTTGACCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGA
S1E氨基酸序列(SEQ ID NO.19)
MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPRRDGGGGSGGGGSGGGGSGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEADAAAAAGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRGGGSGGGSQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDV
S1E蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO.20)
ATGGCGGACGAGGCGGCCCTCGCCCTTCAGCCCGGCGGCTCCCCCTCGGCGGCGGGGGCCGACAGGGAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGGGGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCGCGGAGAGATGGCGGCGGAGGATCAGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGCCGACGCGGCGGCGGCGGCGGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAGGCGGAGGATCAGGCGGAGGCTCCCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTC
S1E1氨基酸序列(SEQ ID NO.21)
MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPRRDGGGGSGGGGSGGGGSGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEADAAAAAGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPR
S1E1蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO.22)
ATGGCGGACGAGGCGGCCCTCGCCCTTCAGCCCGGCGGCTCCCCCTCGGCGGCGGGGGCCGACAGGGAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGGGGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCGCGGAGAGATGGCGGCGGAGGATCAGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGCCGACGCGGCGGCGGCGGCGGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGA
S1F氨基酸序列(SEQ ID NO.23)
MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPAADGPGLERSPGEPGGAAPEREVPAAARGCPGAAAAALWREAEAEAAAAGGEQEAQATAAAGEGDNGPGLQGPSREPPLADNLYDEDDDDEGEEEEEAAAAAIGYRDNAAFGDAAATNGFHSCESDEEDRASHASSSDWTPRPRIGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRAAAADINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEADAAAAAGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRGGGSGGGSQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDV
S1F蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO.24)
ATGGCGGACGAGGCGGCCCTCGCCCTTCAGCCCGGCGGCTCCCCCTCGGCGGCGGGGGCCGACAGGGAGGCCGCGTCGTCCCCCGCCGGGGAGCCGCTCCGCAAGAGGCCGGCGGCAGATGGTCCCGGCCTCGAGCGGAGCCCGGGCGAGCCCGGTGGGGCGGCCCCAGAGCGTGAGGTGCCGGCGGCGGCCAGGGGCTGCCCGGGTGCGGCGGCGGCGGCGCTGTGGCGGGAGGCGGAGGCAGAGGCGGCGGCGGCAGGCGGGGAGCAAGAGGCCCAGGCGACTGCGGCGGCTGGGGAAGGAGACAATGGGCCGGGCCTGCAGGGCCCATCTCGGGAGCCACCGCTGGCCGACAACTTGTACGACGAAGACGACGACGACGAGGGCGAGGAGGAGGAAGAGGCGGCGGCGGCGGCGATTGGGTACCGAGATAACGCGGCATTCGGTGATGCGGCGGCGACTAATGGTTTTCATTCCTGTGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCCTCACATGCAAGCTCTAGTGACTGGACTCCAAGGCCACGGATAGGTCCATATACTTTTGTTCAGCAACATCTTATGATTGGCACAGATCCTCGAACAATTCTTAAAGATTTATTGCCGGAAACAATACCTCCACCTGAGTTGGATGATATGACACTGTGGCAGATTGTTATTAATATCCTTTCAGAACCACCAAAAAGGGCGGCGGCGGCAGATATTAATACAATTGAAGATGCTGTGAAATTACTGCAAGAGTGCAAAAAAATTATAGTTCTAACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCATGTGGAATACCTGACTTCAGGTCAAGGGATGGTATTTATGCTCGCCTTGCTGTAGACTTCCCAGATCTTCCAGATCCTCAAGCGATGTTTGATATTGAATATTTCAGAAAAGATCCAAGACCATTCTTCAAGTTTGCAAAGGAAATATATCCTGGACAATTCCAGCCATCTCTCTGTCACAAATTCATAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGAAAACTACTTCGCAACTATACCCAGAACATAGACACGCTGGAACAGGTTGCGGGAATCCAAAGGATAATTCAGTGTCATGGTTCCTTTGCAACAGCATCTTGCCTGATTTGTAAATACAAAGTTGACTGTGAAGCTGTACGAGGAGATATTTTTAATCAGGTAGTTCCTCGATGTCCTAGGTGCCCAGCTGATGAACCGCTTGCTATCATGAAACCAGAGATTGTGTTTTTTGGTGAAAATTTACCAGAACAGTTTCATAGAGCCATGAAGTATGACAAAGATGAAGCCGACGCGGCGGCGGCGGCGGGGTCTTCCCTCAAAGTAAGACCAGTAGCACTAATTCCAAGTTCCATACCCCATGAAGTGCCTCAGATATTAATTAATAGAGAACCTTTGCCTCATCTGCATTTTGATGTAGAGCTTCTTGGAGACTGTGATGTCATAATTAATGAATTGTGTCATAGGTTAGGTGGTGAATATGCCAAACTTTGCTGTAACCCTGTAAAGCTTTCAGAAATTACTGAAAAACCTCCACGAGGCGGAGGATCAGGCGGAGGCTCCCAGTATCTGTTTTTGCCACCAAATCGTTACATTTTCCATGGCGCTGAGGTATATTCAGACTCTGAAGATGACGTC
第一原核定位信号氨基酸序列(SEQ ID NO.25)
PLRKRPRR
第一原核定位信号核苷酸序列(SEQ ID NO.26)
CCGCTCCGCAAGAGGCCGCGGAGA
第二原核定位信号氨基酸序列(SEQ ID NO.27)
PPKRKKRK
第二原核定位信号核苷酸序列(SEQ ID NO.28)
CCACCAAAAAGGAAAAAAAGAAAA
第一突变核定位信号氨基酸序列(SEQ ID NO.29)
PLRKRPAA
第一突变核定位信号核苷酸序列(SEQ ID NO.30)
CCGCTCCGCAAGAGGCCGGCGGCA
第二突变核定位信号氨基酸序列(SEQ ID NO.31)
PPKRAAAA
第二突变核定位信号核苷酸序列(SEQ ID NO.32)
CCACCAAAAAGGGCGGCGGCGGCA
第一原核出核信号氨基酸序列(SEQ ID NO.33)
LLFGDEII
第一原核出核信号核苷酸序列(SEQ ID NO.34)
CTTCTGTTCGGTGATGAAATTATC
第二原核出核信号氨基酸序列(SEQ ID NO.35)
VDLLIVI
第二原核出核信号核苷酸序列(SEQ ID NO.36)
GTTGACCTCCTCATTGTTATT
第一突变核出核信号氨基酸序列(SEQ ID NO.37)
AAFGDAAA
第一突变核出核信号核苷酸序列(SEQ ID NO.38)
GCGGCATTCGGTGATGCGGCGGCG
第二突变核出核信号氨基酸序列(SEQ ID NO.39)
ADAAAAA
第二突变核出核信号核苷酸序列(SEQ ID NO.40)
GCCGACGCGGCGGCGGCGGCG
T2A氨基酸序列(SEQ ID NO.41)
EGRGSLLTCGDVEENPGP
T2A核苷酸序列（SEQ ID NO.42）
GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT
P2A氨基酸序列（SEQ ID NO.43）
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
P2A核苷酸序列（SEQ ID NO.44）
GCCACCAATTTTAGCCTGCTGAAACAGGCCGGAGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCC
EGFP氨基酸序列（SEQ ID NO.45）
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
EGFP核苷酸序列（SEQ ID NO.46）
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
GP氨基酸序列（SEQ ID NO.47）
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
GP核苷酸序列(SEQ ID NO.48)
GATGTCGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCCCTGCCAGTGACACCAGGAGAGCCTGCATCCATCTCTTGCCGGAGCTCCCAGTCTCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGGTTCTCTGGAGTGCCAGACCGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCAGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGCTCCCAGAATACCCACGTGCCCCCTACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACAGATTATGAGATGCACTGGGTGCGGCAGGCACCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCGCCCTGGACCCAAAGACCGGCGATACAGCCTACTCTCAGAAGTTTAAGGGCAGGGTGACCCTGACAGCCGACGAGAGCACCTCCACAGCCTATATGGAGCTGTCTAGCCTGCGCAGCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCACCCGCTTCTACAGTTACACTTATTGGGGGCAGGGCACTCTGGTCACAGTCTCTTCAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
柔性连接子SEQ ID NO.49
GGGSGGGS
柔性连接子SEQ ID NO.50
DGGGGSGGGGSGGGGS。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如式I所示的结构，
A-S，式I
式I中，A为目的蛋白元件，S为SIRT蛋白或其衍生蛋白；
“-”为连接元件，所述连接元件为键或连接序列；
所述目的蛋白选自抗体、抗原片段、荧光蛋白和多肽中至少一种。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述SIRT蛋白的衍生蛋白选自下组中任一种：
所述SIRT蛋白的衍生蛋白选自下组中任一种：
(i)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥90％同源性的氨基酸序列，且保持有与SEQID NO:1所示的氨基酸序列的活性；
(ii)SIRT1蛋白的截短体；
(iii)SIRT1蛋白的截短体拼接物，所述SIRT1蛋白的截短体拼接物为两个或两个以上所述SIRT1蛋白的截短体依次拼接的产物；和
(iv)SIRT1蛋白的功能突变体，所述功能突变体由SIRT1蛋白、SIRT1蛋白的截短体或SIRT1蛋白的截短体拼接物进行突变获得。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的蛋白元件的氨基酸序列选自下组中任一种：
(a)如SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO.45所示氨基酸序列≥90％同源性的氨基酸序列，且保持有与SEQID NO.45所示的氨基酸序列的活性；
(c)如SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列；和
(d)具有与SEQ ID NO.47所示氨基酸序列≥90％同源性的氨基酸序列，且保持有与SEQID NO.47所示的氨基酸序列的活性。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码所述融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自下组中任一种：
(A1)序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列；
(A2)序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸序列；
(A3)序列如SEQ ID NO:6所示的多核苷酸序列；
(A4)序列如SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列；
(A5)序列如SEQ ID NO:10所示的多核苷酸序列；
(A6)序列如SEQ ID NO:12所示的多核苷酸序列；
(A7)序列如SEQ ID NO:14所示的多核苷酸序列；
(A8)序列如SEQ ID NO:16所示的多核苷酸序列；
(A9)序列如SEQ ID NO:18所示的多核苷酸序列；
(A10)序列如SEQ ID NO:20所示的多核苷酸序列；
(A11)序列如SEQ ID NO:22所示的多核苷酸序列；
(A12)序列如SEQ ID NO:24所示的多核苷酸序列；
(B)与(A)至(A12)中任一项所述多核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；和
(C)与(A)至(A11)和(B)中任一项所述多核苷酸序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组慢病毒表达载体。
8.一种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求6或7所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求4或5所述的多核苷酸。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求4或5所述的多核苷酸、权利要求6或7所述的表达载体或者权利要求7所述的细胞。
10.一种提高慢病毒滴度的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
使包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升，从而提高慢病毒滴度。优选地，所述包装细胞系中SIRT蛋白或其衍生蛋白的表达水平提升的方式选自以下至少一种：
(i)使用权利要求7所述的重组慢病毒载体和辅助载体共转染所述包装细胞系，培养所述包装细胞系，收集上清液；
(ii)在所述包装细胞系的培养介质中添加SIRT蛋白激活剂，培养所述包装细胞系，收集上清液；和
(iii)在所述包装细胞系的培养介质中添加SIRT蛋白或其衍生蛋白，培养所述包装细胞系，收集上清液。
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EMRE KOYUNCU ET AL: "Sirtuins are Evolutionarily Conserved Viral Restriction Factors", MBIO, vol. 5, no. 6, pages 02249 - 14 *
LORENA AGUILAR-ARNAL ET AL: "Spatial dynamics of SIRT1 and the subnuclear distribution of NADH species", PNAS, vol. 113, no. 45, pages 11217 *

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